一種高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法與流程

本發明涉及農業經濟作物育種技術領域，具體涉及一種高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法。

背景技術：

肉蓯蓉作為中草藥在中國已有1800年的應用歷史，是我國稀有的名貴中藥材，有“沙漠人參”之美譽，是補腎壯陽的要藥。目前生藥市場上普遍使用的肉蓯蓉生藥有三種，分別為荒漠肉蓯蓉、管花肉蓯蓉和鹽生肉蓯蓉。肉蓯蓉是一種多年生的專一性根寄生植物，成熟肉蓯蓉種子的胚為球形原胚，發育簡單，無胚根、胚芽和子葉的分化，在自然條件下萌發需經歷一定時間的形態后熟與生理后熟期后，才能解除休眠。由于肉蓯蓉種子存在復雜的休眠特性和特殊的根專性寄生生物學特性，導致自然萌發困難、發芽率極低。目前，野生肉蓯蓉資源匱乏，特別是藥用效果最好的荒漠肉蓯蓉，野生荒漠肉蓯蓉和寄主梭梭均處于瀕危境地，現為國家二級保護植物，被列入《中國植物紅皮書》。因此，人工栽培肉蓯蓉已經成為我國西北地區發展經濟作物，改善農業種植結構的重要途徑，將為當地農戶帶來可觀的經濟效益。

雖然荒漠肉蓯蓉人工栽培面積在逐年擴大，但荒漠肉蓯蓉種子價格昂貴，一公斤種子價格高達3萬元左右，但由于荒漠肉蓯蓉種子萌發困難，市售的荒漠肉蓯蓉種子摻假現象嚴重。但是目前還沒有快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法，常規發芽實驗的方法并不適用于肉蓯蓉種子，因為常規發芽方法處理下，肉蓯蓉種子發芽率較低，發芽時間過長，不能快速準確地得出肉蓯蓉種子的質量數據，沒有數據支持的肉蓯蓉種子給農戶帶來巨大的生產隱患。

近些年，國內外的科研工作者針對打破肉蓯蓉種子休眠開展了一些研究，采用的方法多種多樣，比如：歐陽杰等采用50℃高溫預處理肉蓯蓉種子，誘導種子形成愈傷組織；牛東玲等通過溫水處理、變溫以及外源GA₃預處理，可以使肉蓯蓉種子萌發率達到16.7％；盛晉華等對肉蓯蓉種子經過2～5℃低溫層積處理,發現種子內源激素GA₃含量逐漸增加，ABA含量逐漸降低，最高發芽率17.8％；盛晉華研究發現氟啶酮能夠打破荒漠肉蓯蓉種子休眠，采用該法荒漠肉蓯蓉發芽率最高可達52.5％，發芽延續時間約30天左右。雖然這些方法在一定程度上打破了肉蓯蓉種子的休眠，但是發芽率依然偏低且不穩定，而且發芽時間偏長，就算在最理想狀態下，管花肉蓯蓉發芽率最高能達75％，荒漠肉蓯蓉發芽率最低，為16.7％-52.5％，直到30d才能統計發芽率。現有的方法不便于種子質量檢驗，嚴重影響肉蓯蓉種子市場流通，增加農戶種植的風險。

技術實現要素：

為解決上述問題，本發明提出一種高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法，旨在為提出一種能夠顯著提高肉蓯蓉種子發芽率、縮短發芽時間、為肉蓯蓉種子質量檢驗和栽培提供技術支撐的檢驗方法。

本發明提供的高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法，包括如下步驟：

1)溫水浸種：將肉蓯蓉種子首先在25-40℃溫水中浸泡3-5h；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在20-30℃條件下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡24-48h，然后蒸餾水沖洗干凈備用；

3)配制培養基：配制1/2MS專用培養基或大量元素專用培養基，將配制好的培養基分裝至已滅菌的培養皿中備用；

4)種子消毒：在超凈工作臺上將步驟2)沖洗干凈的種子用消毒劑進行消毒，并用無菌蒸餾水沖洗干凈；

5)種子置床：采用無菌操作技術將步驟4)消毒好的種子置于步驟3)已制備好的培養皿上，每個培養皿置30-80粒種子；

6)發芽：將步驟5)種子已置床的培養皿置于25℃進行發芽。

進一步，所述1/2MS專用培養基的配制方法為，采用MS培養基配方為基礎，將其中所有無機鹽的濃度都減半，配制出1/2MS基礎培養基，然后加入占1/2MS基礎培養基重量3％的蔗糖，調整pH值為5.8，再加入占1/2MS基礎培養基重量0.8％的瓊脂，攪拌均勻后高壓濕熱滅菌，獲得1/2MS專用培養基。

進一步，所述大量元素專用培養基包含的組分為KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O和KH₂PO₄，其濃度分別為950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，將上述四種組分按相應濃度混合，調整pH值為5.8，加入占培養基重量0.8％的瓊脂，攪拌均勻后高壓濕熱滅菌，獲得大量元素專用培養基。

優選地，所述溫水浸種步驟中，將肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h。

優選地，所述氟啶酮處理步驟中，將肉蓯蓉種子于25℃條件下，在10mg/l氟啶酮溶液中浸泡36h，然后蒸餾水沖洗干凈備用。

優選地，所述種子消毒步驟為在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用。

優選地，所述種子置床步驟中，每個培養皿上置50粒種子。

優選地，將種子已置床的培養皿置于25℃，黑暗條件下進行發芽。

進一步，所述肉蓯蓉種子為荒漠肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉任一種。

本發明的有益效果為：

1、提高發芽率，縮短發芽時間：資料研究表明，氟啶酮能夠打破肉蓯蓉種子休眠，但采用該法進行種子發芽前需要先將種子根據直徑分級，選取直徑大于0.5mm的種子，然后將種子消毒后浸泡在氟啶酮溶液中進行發芽，荒漠肉蓯蓉的種子發芽率最高為52.5％，發芽率偏低，30d統計發芽率，發芽時間太長。本研究通過篩選適宜的氟啶酮濃度和處理時間，同時結合溫水浸種處理以及發芽培養基的優化，結果表明，一定濃度的氟啶酮處理種子一段時間可有效打破荒漠肉蓯蓉種子休眠，但種子要萌發還需要一定的礦物質營養，在不提供營養時，發芽率最高僅為16％，因此，一定濃度的礦物質營養也是打破荒漠肉蓯蓉種子休眠的重要因素。本發明提供的方法提供了針對打破肉蓯蓉種子發芽休眠的專用培養基，該方法快速高效，14d時荒漠肉蓯蓉種子發芽率高達73％。采用本方法，14天時即可統計肉蓯蓉種子發芽率，比目前市場上最快速的檢驗方法還快了16天。

2、為肉蓯蓉種子質量檢驗和育種提供技術支撐：目前國內還沒有能14天就得出結果的快速高效的肉蓯蓉種子質量檢驗方法，本發明通過對肉蓯蓉種子的前處理方法、發芽條件的特殊設計，顯著的打破了肉蓯蓉種子的休眠，提高了肉蓯蓉種子的發芽率，縮短了發芽所需時間，該發明可為肉蓯蓉種子質量檢驗、組織培養和轉基因育種提供良好的技術平臺。

3、篩選出特定發芽培養基，沒有使用寄主引物即可誘導發芽。由于肉蓯蓉是根專性寄生植物，在誘導種子發芽時，現有技術有些采用添加專性寄主引物，例如管花肉蓯蓉使用紅柳提取物，荒漠肉蓯蓉使用梭梭提取物，但這些提取物是否起到實質作用并未有權威證據。有些僅采用化學藥劑處理，但發芽率偏低。本發明創造性的使用了1/2MS專用培養基和采用四種大量元素配制的大量元素專用培養基，配合整套種子前處理方法，并未使用專性寄主引物，使得荒漠肉蓯蓉種子發芽率大幅提高至73％。研究中發現肉蓯蓉種子單純采用藥劑處理發芽率很低，只有配合使用一定濃度的四種大量元素，種子發芽率才能大幅提高。該技術方法不僅可為進一步深入研究肉蓯蓉種子萌發機理提供線索，同時也可為其它寄生植物種子發芽提供一種新思路和新方法。

附圖說明

圖1為肉蓯蓉種子發芽流程圖；

圖2為實施例1的荒漠肉蓯蓉種子發芽照片。

具體實施方式

以下通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商店購買得到的。如無特殊說明，“％”為質量百分比。

實施例1：一種高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率方法，具體步驟如下：

1)溫水浸種：將荒漠肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h，用濾紙吸干種子表面的水分；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干種子表面水分備用；

3)配制培養基：配制大量元素專用培養基，包含組分為KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O和KH₂PO₄，其濃度分別為950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，將上述四種組分按相應濃度混合，調整pH值為5.8，加入占培養基重量0.8％的瓊脂，攪拌均勻后高壓濕熱滅菌，獲得大量元素專用培養基，將配制好的培養基分裝至已滅菌的培養皿中備用；

4)種子消毒：在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的荒漠肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用；

5)種子置床：采用無菌操作技術將步驟4)消毒好的種子置于步驟3)已制備好的培養皿上，每個培養皿置50粒種子，種子之間間隔3mm左右，用石蠟封口膜封口；

6)發芽：將步驟5)種子已置床的培養皿置于25℃，黑暗條件下進行發芽。

14天時統計發芽率，發芽率達73％(見圖2)。

實施例2：檢測光照條件對荒漠肉蓯蓉種子發芽的影響，具體步驟如下：

1)溫水浸種：將荒漠肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h，用濾紙吸干種子表面的水分；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干種子表面水分備用；

3)配制培養基：配制1/2MS專用培養基，采用MS培養基配方為基礎，將其中所有無機鹽的濃度都減半，配制出1/2MS基礎培養基，然后加入占1/2MS基礎培養基重量3％的蔗糖，調整pH值為5.8，再加入占1/2MS基礎培養基重量0.8％的瓊脂，攪拌均勻后高壓濕熱滅菌，獲得1/2MS專用培養基，將配制好的培養基分裝至已滅菌的培養皿中備用；

4)種子消毒：在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的荒漠肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用；

5)種子置床：采用無菌操作技術將步驟4)消毒好的種子置于步驟3)已制備好的培養皿上，每個培養皿置50粒種子，種子之間間隔3mm左右，用石蠟封口膜封口；

6)發芽：將步驟5)種子已置床的培養皿置于25℃，光照(1000lux)或黑暗條件下進行發芽，20d統計發芽率。

光照條件下的荒漠肉蓯蓉種子發芽率達53％，黑暗條件下荒漠肉蓯蓉種子發芽率達51％，說明荒漠肉蓯蓉種子屬于光不敏感種子，在光照和黑暗條件下都可以很好的發芽。

實施例3：檢測不同發芽床對荒漠肉蓯蓉種子發芽的影響，步驟如下：

1)溫水浸種：將荒漠肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h，用濾紙吸干種子表面的水分；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干種子表面水分備用；

3)發芽床的制備：1/2MS專用培養基配制同實施例2；

A.紙床：以3層濾紙作發芽床，用蒸餾水完全潤濕后備用；

B.脫脂棉：將脫脂棉鋪一薄層(3mm厚)于培養皿底部，壓平，用蒸餾水完全潤濕后備用；

C.砂床：砂子直徑0.05～0.8mm，pH 6.0～7.5，洗凈后150℃消毒2h，無菌水拌成濕砂使用，手捏成團，放手即散開)，在培養皿中鋪5mm厚的濕砂后，置床時將種子壓入砂內即可。

4)種子消毒：在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的荒漠肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用；

(5)種子置床：將消毒好的種子整齊的擺放在發芽床上，每個培養皿50粒，其中培養基發芽床采用無菌操作技術將種子置床，用石蠟封口膜封口。

(6)種子發芽條件：在20℃黑暗條件下進行種子發芽。

20天統計發芽率，其中脫脂棉發芽床的發芽率為9％，砂床發芽床的發芽率為12％，紙床發芽床的發芽率為16％，培養基發芽床的發芽率為52.5％。由此看出，發芽床對荒漠肉蓯蓉種子發芽至關重要，所有種子置床前先用溫水浸種，然后再用氟啶酮處理，但發芽床不同，種子發芽率差異顯著。用砂床、紙床和脫脂棉作發芽床，發芽率均很低，最高僅為16％，但以培養基作發芽床發芽率顯著升高，達到52.5％。由此可見，氟啶酮可以有效的打破沙漠肉蓯蓉種子休眠，但營養物質不可缺少，使用培養基可極大地促進種子的萌發。

實施例4：檢測不同發芽溫度對荒漠肉蓯蓉種子發芽的影響，步驟如下：

1)溫水浸種：將荒漠肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h，用濾紙吸干種子表面的水分；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干種子表面水分備用；

3)培養基的制備：1/2MS(無機鹽減半)專用培養基配制同實施例2；

4)種子消毒：在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的荒漠肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用；

5)種子置床：采用無菌操作技術將種子置于培養皿的培養基上，每個培養皿50粒種子，種子之間間隔3mm左右，用石蠟封口膜封口。

6)種子發芽條件：將置床后的種子分別置于變溫(15℃～25℃)、15℃、20℃、25℃和30℃黑暗條件下進行培養。

20天統計發芽率，變溫(15℃～25℃)發芽率為15％，15℃發芽率為1％，20℃發芽率為53％，25℃發芽率為61.76％，30℃發芽率為48.33％。由此6可知，變溫和15℃低溫不利于荒漠肉蓯蓉種子發芽，隨著溫度的升高種子發芽率顯著升高，25℃發芽率最高，達61.76％，當溫度升高到30℃發芽率降低為48.33％。因此，25℃是荒漠肉蓯蓉種子適宜的發芽溫度。

實施例5：檢測不同營養成分對荒漠肉蓯蓉種子發芽的影響，步驟如下：

1)溫水浸種：將荒漠肉蓯蓉種子在30℃溫水中浸泡4h，用濾紙吸干種子表面的水分；

2)氟啶酮處理：將步驟1)所得肉蓯蓉種子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干種子表面水分備用；

3)不同營養培養基的制備：1/2MS(無機鹽減半)專用培養基配制同實施例2；大量元素、鈣鹽、微量元素、鐵鹽、有機和蔗糖培養基，指的是培養基中分別只含有大量元素、鈣鹽、微量元素、鐵鹽、有機或蔗糖，其物質含量同1/2MS專用培養基，pH5.8，瓊脂0.8％。

4)種子消毒：在超凈工作臺上將經氟啶酮處理并沖洗干凈的荒漠肉蓯蓉種子先用75％的乙醇漂洗10s，將乙醇傾倒干凈，然后倒入0.1％的HgCl₂浸泡2min，其間震蕩多次，將HgCl₂傾倒干凈，再用2％的NaClO浸泡5min，其間震蕩多次，將NaClO傾倒干凈，最后用無菌蒸餾水沖洗3次，將無菌蒸餾水傾倒干凈后備用；

5)種子置床：采用無菌操作技術將種子置于培養皿的培養基上，每個培養皿50粒種子，種子之間間隔3mm左右，用石蠟封口膜封口。

6)種子發芽條件：在25℃黑暗條件下，進行種子發芽。

14天統計發芽率，培養基中營養成分組成不同，荒漠肉蓯蓉種子發芽率差異顯著，當培養基中僅含有蔗糖、有機或微量元素時，各組發芽率均低于10％，與只含水的對照相比差異不顯著，因此，這幾種營養物質對荒漠肉蓯蓉種子發芽沒有促進作用；當培養基中僅含有鈣鹽和鐵鹽時，發芽率分別為17.5％和18.67％，較對照有所升高，但沒有進步意義；當培養基為1/2MS專用培養基和僅含大量元素的培養基作發芽床時發芽率顯著升高，分別為60.7％和73.1％。因此，促進荒漠肉蓯蓉種子發芽的營養物質主要是大量元素。

經過系列試驗確定了實施例1所述高效快速檢驗荒漠肉蓯蓉種子發芽率的方法為最優操作方法。

本發明的研究結果可為肉蓯蓉人工栽培提供一定的理論依據和技術支撐，本發明的高效快速的肉蓯蓉種子發芽方法，可用于荒漠肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉、沙蓯蓉的任一種。

以上對本發明所提供的一種高效快速檢驗肉蓯蓉種子發芽率的方法進行了詳細介紹。本文通過具體實施方式對本發明的原理和實施方式進行了闡述，以上說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。