本發明屬于大黃魚標記領域，特別涉及一種用茜素紅標記大黃魚的方法。
背景技術：
標志重捕是評估魚類增殖放流效果最常用的方法，該方法需要在放流前對魚類進行標記以區分放流群體和野生群體。目前常用的標記方法有物理標記、生物分子標記和化學標記等。這些方法中物理標記會對魚體造成一定的損傷，只適用于對規格較大的魚體進行標記，且標記成本較高、需逐條操作，不適合大規模標記放流。生物分子標記檢測程序則過于復雜。化學標記主要是通過浸泡、注射、投喂等方法指在鰓蓋、耳石等部位形成可穩定保持的化學熒光標記。其中浸泡法是最主要的化學標記方式，該方法可以對放流群體規模化標記，且對魚的傷害小，尤其適用于仔稚幼魚的標記。常用的化學熒光染料包括：鹽酸四環素、鈣黃綠素、茜素紅、茜素絡合指示劑。這些染料能與生物體內的鈣結合形成穩定的螯合物，沉積在水生生物的硬組織中,最終形成熒光標記。鹽酸四環素是一種抗生素,在用于化學標記時，使用濃度太低會影響標記效果，濃度過大會降低標記目標的存活率，且會威脅水產品質量安全。鈣黃綠素產生的背景熒光較強，標記檢測效果較差。茜素紅和茜素絡合指示劑在熒光標記應用中表現良好，對標記目標無明顯損害，標記效率高，標記效果明顯且保留時間較長，是理想的標記方法。值得注意的是，這兩種染料均易與海水中的Ca2+等螯合產生沉淀物，影響了在海水中的溶解量。如梁小雙等在《紅鰭笛鯛熒光標記技術的研究》中報道，茜素紅在海水中的溶解量僅為30mg/L，而染色濃度需達100～200mg/L才能形成明顯的標記色。這一特點使得二者對海洋生物的標記效果較差，懸浮的沉淀物也可能堵塞魚的腮部，造成死亡。另外，使用成本較高也是限制茜素絡合指示劑標記應用的一大因素，該染料對5cm幼魚的標記成本達1～2元/尾，限制了其在放流標記中的應用。相較而言，茜素紅的應用成本則較低，僅為前者的約1/200，特別適合魚類的大規模標記。
大黃魚是我國重要的海洋經濟魚類，由于野生大黃魚的資源的衰退，大黃魚成為我國最重要的增殖放流魚類之一，每年各地大黃魚的放流量達數千萬尾。大黃魚放流規格一般為5cm左右，如何能對這一規格的大黃魚幼魚進行規模化標記成為評估增殖放流效果亟需解決的一大問題。大黃魚屬石首魚科魚類，耳石較大，易于標記和檢測，非常適合以耳石作為標記物進行熒光標記，但現有的標記方案都存在一些弊端。如發明專利《一種大黃魚增殖放流標志的方法》，申請號201410283245.X，公開了一種通過在育苗池中加入六水合氯化鍶，對大黃魚幼魚進行鍶標志的方法。該方法標記時間較長，且標記的鑒定需要對耳石磨片后用專業設備檢測，操作復雜，實用性較差。另外，專利《一種標志石首科幼魚的方法》，申請號201410145230.7，公開了一種用茜素絡合指示劑標記石首科幼魚的方法，該方法標記成本較高，且不能解決茜素絡合指示劑在海水中易產生沉淀的問題。大黃魚在染料浸泡應激狀態下會分泌大量粘液，粘液與懸浮的沉淀物結合形成絮狀物，極易對大黃魚的腮部造成堵塞，引起死亡。實際操作中大黃魚標記后成活率不足50％。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種用茜素紅標記大黃魚的方法，該方法通過調配人工海水，避免了鈣離子對茜素紅溶解的影響和沉淀的產生，提高了茜素紅的有效濃度和浸染效果，解決了懸浮沉淀物易堵塞大黃魚鰓部引起大量死亡的問題。
本發明的一種用茜素紅標記大黃魚的方法，包括：
(1)配制茜素紅儲備母液，稀釋母液至應用濃度后調節鹽度至15‰以上，得到人工海水染液；
(2)將待染色大黃魚魚苗浸泡于上述染液中進行染色；染色完成后將魚苗轉移至自然海水中漂洗，即得經茜素紅標記的大黃魚。
所述步驟(1)中配制茜素紅儲備母液時用氣石強曝氣12h。
所述步驟(1)中應用濃度為100～300mg/L，采用曝氣48h以上的自來水稀釋。
所述步驟(1)中采用不含碘精鹽、MgSO4、MgCl2和KCl調節鹽度。添加量為：每升染液添加不含碘精鹽12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g。
所述步驟(1)中得到人工海水后進行曝氣，采用氣動式過濾棉吸附沉淀(吸附自來水和精鹽中攜帶的少量鈣離子可能形成的沉淀)，用NaHCO3溶液調節pH值至7.8～8.2。
所述步驟(2)中待染色大黃魚魚苗預先在鹽度為15‰的低鹽海水中適應48h以上(增強對低鹽人工海水的適應能力)。
所述步驟(2)中染色在養殖池或染色桶中進行。
所述步驟(2)中待染色大黃魚的浸泡密度為1.5～2.5尾/L(全長5cm左右)，浸泡時間為24h。
所述浸泡期間持續充氣，采用氣動式過濾棉吸附沉淀(吸附由大黃魚體表帶入海水等形成的少量沉淀物及魚體分泌粘液)，用NaHCO3溶液調節pH，使其保持在7.8～8.2之間。
所述步驟(2)中染色完成后的染色液經過濾重復使用。
有益效果
(1)本發明采用調制人工海水的方式，提高了茜素紅染液的有效濃度和染色效果，標記率達100％，耳石著色在浸染后90d依然可清晰檢測到。檢測方式簡單，前期(約50d內)通過肉眼觀察即可分辨標記魚苗，后期可借助熒光顯微鏡觀察提高辨別準確度；
(2)本發明中人工海水避免了懸浮沉淀物的產生，防止其與大黃魚分泌粘液結合形成絮狀物堵塞魚鰓引起的大黃魚大量死亡，標記后48h大黃魚成活率保持在95％以上；
(3)本發明借助氣動式過濾棉的過濾作用進一步減小了浸染過程中可能產生的少量沉淀對魚苗的影響；
(4)本發明的方法避免了體外掛牌等方法對魚體損傷大，不適合小規格魚標記，且易遺失的問題；
(5)本發明的方法標記成本極低，每尾魚的標記成本不到0.1元，適合大黃魚放流大規模標記；
(6)大黃魚對鹽度變化的耐受性較強，本發明中從自然海水直接轉移至鹽度為15‰的人工海水中，對大黃魚的成活無明顯影響，適當降低浸染鹽度可減少精鹽等的用量，進一步節約成本。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1
(1)用蒸餾水配制2000mg/L的茜素紅儲備母液，配制時用氣石強曝氣12h使茜素紅充分溶解；用曝氣48h后的自來水稀釋母液至200mg/L；采用不含碘精鹽(市售)、MgSO4、MgCl2和KCl調節鹽度至15‰，得到人工海水染液(添加量為每升染液添加不含碘精鹽12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g)。染液曝氣12h，采用氣動式過濾棉吸附沉淀(每立方米水體布放2只)，用NaHCO3溶液調節pH值至8.2。
(2)染色在6m3的養殖池中進行。將12000尾平均全長5.15±0.75cm待染色大黃魚魚苗(約5cm，預先在不含茜素紅的鹽度15‰的海水中適應48h)浸泡于上述人工海水中進行染色，浸泡時間為24h，浸泡期間持續充氣，采用氣動式過濾棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液調節pH，使保持在7.8～8.2之間；染色完成后將魚苗轉移至自然海水中漂洗24h，去除體表浮色，即得經茜素紅標記的大黃魚。
經觀察，標記后48h大黃魚成活率為98％，標記率達100％。
實施例2
(1)用蒸餾水配制2000mg/L的茜素紅儲備母液，配制時用氣石強曝氣12h使茜素紅充分溶解；于3只300L染色桶中分別用曝氣48h后的自來水稀釋母液至100、200、300mg/L；每升稀釋液添加不含碘精鹽12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g，得到鹽度為15％的人工海水染液，曝氣12h，每桶用1只氣動式過濾棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液調節pH值至8.2。
(2)每桶放入500尾全長為4.68±0.82cm的大黃魚魚苗進行浸泡染色，浸泡時間為24h，浸泡期間持續充氣，采用氣動式過濾棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液調節pH，使其保持在7.8～8.2之間；染色完成后將魚苗轉移至自然海水中漂洗24h，去除體表浮色。
大黃魚染色標記效果如下：