本發明涉及一種狹葉紅景天種苗的快速培育方法，特別是涉及一種通過誘導狹葉紅景天胚狀體而實現狹葉紅景天植株快速繁育的方法。
背景技術：
狹葉紅景天Rhodiola kirilowii(Regel)Maxim.系薔薇目景天科紅景天，屬(Rhodiola L.)多年生草本。分布于我國西藏、青海、四川、云南等地海拔2000～5600m的高寒地區，為我國著名的高寒中藏醫藥材。狹葉紅景天具有清熱退燒、解毒和防瘟作用，可治療肺炎、發燒、腹瀉和四肢腫脹等癥。現代藥理研究表明，紅景天具有消熱解毒、抗疲勞、抗缺氧、抗衰老等功效。狹葉紅景天為雌雄異株植物，其種子微小，不易得到，且難以人工栽培，目前狹葉紅景天植物主要以野生資源為藥源。由于其特殊的功效和需求量急劇加大，使得野生資源也日益減少。另外，狹葉紅景天植物具有能在貧瘠的沙漠地帶很好生長的特性，同時兼有保持水土和保護生態環境的效果；因此狹葉紅景天又可作為治理土壤沙化的優質樹種。因此積極開展對狹葉紅景天的種苗大量培育具有十分重要的意義。
目前已有人對狹葉紅景天種苗快速培育進行了研究，如李建民等人采用狹葉紅景天的頂芽為外植體，經不定芽增殖培養和生根培養獲得了狹葉紅景天再生植株。本專利是以狹葉紅景天的子葉柄為外植體，通過誘導胚狀體來獲得狹葉紅景天再生植株，目前該方法還未見有任何報道。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種狹葉紅景天種苗的快速培育方法，該方法以狹葉紅景天的子葉柄為外植體，通過誘導胚狀體進而獲得狹葉紅景天的再生植株。
本發明提供的狹葉紅景天種苗的快速培育方法包括如下步驟：
(1)外植體的獲得
a.選取已成熟的狹葉紅景天種子，將其消毒處理后接入MS+酵母提取物50～100mg·L-1培養基中，在每天光照10～14小時、光照強度為700～1200lx和每天在5～8℃和20～25℃各培養12小時的條件下進行種子的萌發生長培養；
b.取已萌發的狹葉紅景天種子，轉接入MS+川蕎一號種子50～100g·L-1培養基中培養，在培養溫度為15～25℃、每天光照8～12小時、光照強度為1500～2000lx的條件下培養20天后，選取直徑在1mm以上、長度為0.5～1.5cm的子葉柄作為外植體；
(2)胚性組織細胞的培養：將子葉柄外植體靠近胚軸端部分插入到培養基B5+2,4-D 1.0～3.0mg.L-1+NAA 0.1～0.5mg+酵母多糖80～200mg·L-1中，在培養溫度為12～28℃、每天光照10～18小時、光照強度為1000～1500lx的條件下培養15～25天后，插入培養基中的子葉柄產生胚性組織細胞；
(3)胚狀體的產生：切取步驟(2)中產生的胚性組織細胞，以50～100g·L-1的接種量接入液體培養基1/2MS+TDZ1.0～3.0mg·L-1+NAA0.5～2.0mg·L-1+酵母提取物100～300mg·L-1中，在搖床轉速為80～100r·min-1、培養溫度18～25℃、每天光照8～16小時和光照強度為1000～2000lx的條件下培養15～20天后，再轉入1/2MS+6BA1～3.0mg·L-1+NAA0.5～2mg·L-1+酵母多糖200～400mg·L-1固體培養基中進行培養，培養溫度和光照條件與液體培養基中培養相同，培養25～35天后在胚性組織細胞表面產生胚狀體；
(4)種苗的獲得：將步驟(3)中產生的胚狀體切割后接入1/2MS培養基中，在培養溫度為18～30℃、每天光照12～24小時和光照強度為1800～3000lx的條件下培養30～45天，即獲得生長健壯的狹葉紅景天種苗；
上述所有培養基的蔗糖20～40g·L-1、pH值為5.8～6.6、瓊脂為5～6.5g·L-1。
進一步地，步驟(1)a中所述消毒處理是指將狹葉紅景天種子放入0.1％的升汞溶液中消毒3～7分鐘后，再用無菌水清洗3～6分鐘，所述種子與升汞溶液的體積比為1：20。
進一步地，步驟(2)中子葉柄外植體插入培養基部分占整個子葉柄外植體的1/3。
進一步地，步驟(3)中所述胚性組織細胞為分裂能力強、顏色為黃綠色的胚性組織細胞。
進一步地，步驟(4)中所述胚狀體按2～3個為1組進行切割。
本發明通過對狹葉紅景天子葉柄外植體的胚性細胞和胚狀體的誘導培養，成功培育出狹葉紅景天的優質種苗，為狹葉紅景天優質種苗的大量快速培育提供了一條新途徑。
具體實施方式
實施例1
本實施例提供的狹葉紅景天種苗的快速培育方法包括如下步驟：
(1)外植體的獲得：
a.選取已完全成熟的狹葉紅景天種子，將其按種子與升汞溶液的體積比為1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒4分鐘后，再用無菌水清洗5分鐘，然后接入MS+酵母提取物80mg·L-1培養基中，在每天光照12小時、光照強度為1000lx和每天在7℃和22℃各培養12小時的條件下進行種子的萌發生長培養，培養5天統計，狹葉紅景天種子的染菌率為0％，萌發率為100％；
b.取已萌發的狹葉紅景天種子，轉接入MS+川蕎一號種子80g·L-1培養基中，在培養溫度為20℃、每天光照10小時、光照強度為1800lx的條件下培養20天后，選取直徑在1mm以上、長度為1.0cm的子葉柄作為外植體，
(2)胚性組織細胞的培養：將子葉柄外植體靠近胚軸端(即非著生子葉端)部分插入到培養基B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.3mg+酵母多糖120mg·L-1中，插入部分占整個子葉柄外植體的1/3，在培養溫度為22℃、每天光照14小時、光照強度為1200lx的條件下培養20天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為100％；
(3)胚狀體的產生：切取步驟(2)中產生的分裂能力強、顏色為黃綠色的胚性組織細胞，以80g·L-1的接種量接入液體培養基1/2MS+TDZ2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+酵母提取物200mg·L-1中，在搖床轉速為90r·min-1、培養溫度23℃、每天光照12小時和光照強度為1500lx的條件下培養18天后，再轉入1/2MS+6BA2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+酵母多糖300mg·L-1固體培養基中進行再培養，再培養溫度和光照條件與液體培養基中培養相同，再培養30天后統計，胚狀體的誘導率為100％，經顯微切片觀察，形成的胚狀體與母體組織的維管束不連接，有獨立的維管束系統；
(4)種苗的獲得：將步驟(3)中產生的胚狀體按2個為1組切割后接入1/2MS培養基中，在培養溫度為25℃、每天光照18小時和光照強度為2500lx的條件下培養40天后，狹葉紅景天種苗誘導率為100％；
上述所有培養基的蔗糖30g·L-1、pH值為6.0、瓊脂為5.5g·L-1。
實施例2
本實施例提供的狹葉紅景天種苗的快速培育方法包括如下步驟：
(1)外植體的獲得
a.選取已完全成熟的狹葉紅景天種子，將其按種子與升汞溶液的體積比為1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘后，再用無菌水清洗3分鐘，然后接入MS+酵母提取物50mg·L-1培養基中，在每天光照10小時、光照強度為700lx和每天在5℃和20℃各培養12小時的條件下進行種子的萌發生長培養，培養5天統計，狹葉紅景天種子的染菌率為5.56％，萌發率為95.15％；
b.取已萌發的狹葉紅景天種子，轉接入MS+川蕎一號種子50g·L-1培養基中，在培養溫度為15℃、每天光照8小時、光照強度為1500lx的條件下培養20天后，選取直徑在1mm以上、長度為0.5cm的子葉柄作為外植體；
(2)胚性組織細胞的培養：將子葉柄外植體靠近胚軸端部分插入到培養基B5+2,4-D 1.0mg.L-1+NAA 0.1mg+酵母多糖80mg·L-1中，插入部分占整個子葉柄外植體的1/3，在培養溫度為12℃、每天光照10小時、光照強度為1000lx的條件下培養15天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為82％；
(3)胚狀體的產生：切取步驟(2)中產生的分裂能力強、顏色為黃綠色的胚性組織細胞，以50g·L-1的接種量接入液體培養基1/2MS+TDZ1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+酵母提取物100mg·L-1中，在搖床轉速為80r·min-1、培養溫度18℃、每天光照8小時和光照強度為1000lx的條件下培養15天后，再轉入1/2MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+酵母多糖200mg·L-1固體培養基中進行再培養，再培養溫度和光照條件與液體培養基中培養相同，培養25天后統計，胚狀體的誘導率為81％，經顯微切片觀察，形成的胚狀體與母體組織的維管束不連接，有獨立的維管束系統；
(4)種苗的獲得：將步驟(3)中產生的胚狀體按2個為1組切割后接入1/2MS培養基中，在培養溫度為18℃、每天光照12小時和光照強度為1800lx的條件下培養30天，狹葉紅景天種苗誘導率為80.21％；
上述所有培養基的蔗糖20g·L-1、pH值為5.8、瓊脂為5g·L-1。
實施例3
本實施例提供的狹葉紅景天種苗的快速培育方法包括如下步驟：
(1)外植體的獲得
a.選取已完全成熟的狹葉紅景天種子，將其按種子與升汞溶液的體積比為1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒7分鐘后，再用無菌水清洗6分鐘，然后接入MS+酵母提取物100mg·L-1培養基中，在每天光照14小時、光照強度為1200lx和每天在8℃和25℃各培養12小時的條件下進行種子的萌發生長培養，培養5天統計，狹葉紅景天種子的染菌率為0％，萌發率為81.24％；
b.取已萌發的狹葉紅景天種子，轉接入MS+川蕎一號種子100g·L-1培養基中，在培養溫度為25℃、每天光照12小時、光照強度為2000lx的條件下培養20天后，選取直徑在1mm以上、長度為1.5cm的子葉柄作為外植體；
(2)胚性組織細胞的培養：將子葉柄外植體靠近胚軸端部分插入到培養基B5+2,4-D 3.0mg.L-1+NAA 0.5mg+酵母多糖200mg·L-1中，插入部分占整個子葉柄外植體的1/3，在培養溫度為28℃、每天光照18小時、光照強度為1500lx的條件下培養25天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為95.41％；
(3)胚狀體的產生：切取步驟(2)中產生的分裂能力強、顏色為黃綠色的胚性組織細胞，以100g·L-1的接種量接入液體培養基1/2MS+TDZ3.0mg·L-1+NAA 2.0mg·L-1+酵母提取物300mg·L-1中，在搖床轉速為100r·min-1、培養溫度25℃、每天光照16小時和光照強度為2000lx的條件下培養20天后，再轉入1/2MS+6BA3.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+酵母多糖400mg·L-1固體培養基中進行再培養，再培養溫度和光照條件與液體培養基中培養相同，培養35天后統計，胚狀體的誘導率為96％，經顯微切片觀察，形成的胚狀體與母體組織的維管束不連接，有獨立的維管束系統；
(4)種苗的獲得：將步驟(3)中產生的胚狀體按3個為1組切割后接入1/2MS培養基中，在培養溫度為30℃、每天光照24小時和光照強度為3000lx的條件下培養45天，狹葉紅景天種苗誘導率為98％；
上述所有培養基的蔗糖40g·L-1、pH值為6.6、瓊脂為6.5g·L-1。
實施例4
將實施例1步驟(1)a中狹葉紅景天種子的消毒時間改為7分鐘，其它步驟同實施例1，培養5天統計狹葉紅景天種子的染菌率為0％，萌發率為92.45％。
實施例5
將實施例1步驟(1)a中狹葉紅景天種子的消毒時間改為3分鐘，其它步驟同實施例1，培養5天統計狹葉紅景天種子的染菌率為5.13％，萌發率為97.65％。
實施例6
將實施例1步驟(2)中誘導胚性細胞的培養基改為B5+2,4-D 1.0mg.L-1+NAA 0.1mg+酵母多糖80mg·L-1，其它步驟同實施例1，培養20天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為91.89％。
實施例7
將實施例1步驟(2)中誘導胚性細胞的培養基改為B5+2,4-D 3.0mg.L-1+NAA 0.5mg+酵母多糖200mg·L-1，其它步驟同實施例1，培養20天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為94.09％。
實施例8
將實施例1步驟(3)中的液體培養基改為1/2MS+TDZ 1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+酵母提取物100mg·L-1，其它步驟同實施例1，再培養30天后統計，胚狀體的誘導率為93.28％。
比較實施例1
將實施例1步驟(1)a中狹葉紅景天種子的消毒時間改為10分鐘，其它步驟同實施例1，培養5天統計，狹葉紅景天種子的染菌率為0％，萌發率為41.15％。
比較實施例2
在實施例1步驟(1)b中，將消毒后的種子改接入MS基本培養基中，其它步驟同實施例1，培養20天后統計，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為0％。
比較實施例3
將實施例1步驟(1)a中狹葉紅景天種子的萌發生長條件改為在無光照條件下培養，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為30.36％。
比較實施例4
將實施例1步驟(1)a中狹葉紅景天種子的萌發生長條件改為全天在25°的條件下培養，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為48.32％。
比較實施例5
在實施例1步驟(1)b中，取消將已萌發的狹葉紅景天種子轉接入MS+寧蕎一號種子80g·L-1培養基中培養的步驟，其它步驟同實施例1，所得到的狹葉紅景天種苗的子葉柄生長直徑在1mm以下，采用直徑在1mm以下的子葉柄作為外植體進行胚性組織細胞的誘導，其誘導率為12.54％。
比較實施例6
在實施例1步驟(2)中，改用將子葉柄外植體靠近子葉端部分插入到培養基中，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性細胞的誘導率為43.09％。
比較實施例7
在實施例1步驟(2)中，改用將子葉柄平放在培養基表面，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性細胞的誘導率為33.59％。
比較實施例8
在實施例1步驟(2)中，將培養基中的基本培養基由“B5”改為“MS”，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率僅為45.24％。
比較實施例9
在實施例1步驟(2)中，將培養基由“B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.3mg+酵母多糖120mg·L-1”改為“B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.2mg”，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天胚性組織細胞的誘導率為40.64％。
比較實施例10
將實施例1步驟(3)中胚性組織的接種量改為200g·L-1，其它步驟同實施例1，胚狀體的誘導率為36.14％。
比較實施例11
將實施例1步驟(3)中的搖床轉速改為180r·min-1，其它步驟同實施例1，胚狀體的誘導率為29.74％。
比較實施例12
在實施例1步驟(3)中，取消將黃綠色的胚性組織細胞轉入液體培養基中培養的步驟，而直接接入1/2MS+6BA2.0mg·L-1+NAA1mg·L-1+酵母多糖300mg·L-1固體培養基中進行培養，其它步驟同實施例1，胚狀體的誘導率為23.18％。
比較實施例13
在實施例1步驟(4)中，將胚狀體改接入MS培養基中，其它步驟同實施例1，狹葉紅景天種苗的誘導率為67.18％。