本發明屬于生物技術領域，涉及動物精液低溫和冷凍保存液的制作，特別涉及一種馬用精子低溫及冷凍保存稀釋液。
背景技術：
我國是養馬業大國，馬匹數量居世界第二位。作為一種主要的大家畜，馬曾經與人類生產生活息息相關，機械工業興起后，馬的役用價值弱化，逐漸淡出人們生活。近些年，隨著我國人民生活水平的提高，以產品、文化休閑為主的現代馬業在我國悄然興起，現代馬業的發展迫切需要采用人工授精的方式進行馬匹改良，精液的體外保存(低溫及冷凍保存)是目前馬匹人工授精過程中的技術核心。
自從1950年Czechoslovakia首次報道了將煮沸的牛奶用于精液體外保存后，這一簡單易于獲取的天然精液稀釋液被廣泛的用于牛、山羊、綿羊及馬的精液保存。直到今天，幾乎所有的馬精液保存液均以脫脂奶作為其主要成分。然而這種基于奶的精液稀釋液存在如下幾個問題，第一，不同個體、不同產奶期乳成分變異較大，由此導致稀釋液批次間不穩定，無法實現標準化生產；第二，奶中除了對精子保存有利的物質外，還含有某些對精子保存不利的成分，不做區分的應用脫脂乳會對精子保存產生一定的負面影響；第三，天然奶是一種膠體溶液，其主要成分酪蛋白均以酪蛋白顆粒的形式存在，這種顆粒在長期低溫儲存和冷凍條件下易于聚合產生沉淀，這一性質導致以天然奶為基礎的精液稀釋儲存期較短。
1949年英國科學家Polge、Smith和Parkes等發現甘油對低溫冷凍精液的保護作用后，家畜精液冷凍技術才出現重大突破。但以甘油作為抗凍劑應用于馬精子冷凍并未取得理想效果。已經意識到相同冷凍劑對不同的細胞組織的冷凍保護效果存在顯著差異，因此,針對馬精子細胞應該尋找更加適合的抗凍劑進行冷凍保護。
普通體細胞主要依靠周圍環境和胞內的抗氧化酶和天然抗氧化劑清除多余活性氧。精子作為一類高度分化的特殊細胞，極具簡化的細胞質使其喪失了攜帶大量抗氧化劑和自身修復氧化損傷的能力。因此精子抗氧化途徑主要依靠周圍環境中的抗氧化物。精子體外保存過程中稀釋液即為其所處的環境，因此稀釋液中抗氧化劑對保護精子免受氧化損傷至關重要意義。
為了克服以上基于天然奶或奶成分制備的精液稀釋液的缺點，研制具有自主知識產權的精液稀釋液，我們研究團隊從2012年至今開展了系列研究發明了一種馬用精子低溫和冷凍保存稀釋液，其應用效果優于國內外同類產品。
相關檢索未發現與本專利權利要求相似的報道。
技術實現要素：
本發明目的在于針對目前精液保存稀釋液的不足之處，提供一種用于精液低溫和冷凍保存的稀釋液及其制備方法，能有效提高馬精液低溫和冷凍解凍后的精子活率及配種受胎率。與常規方法比，該方法操作簡單、穩定，技術效果尤其顯著。
實現上述目的的技術方案是：
一種馬精子低溫及保存稀釋液，所述精子低溫保存稀釋液由糖鹽溶液焦磷酸鈉、酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，SC)、乳清蛋白(whey protein，WP)、抗氧化劑、組合抗生素及去離子水組合而成。
所述糖鹽溶液制作方法及添加量：稱量碳酸氫鈉0.33g，羥乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合檸檬酸鈉0.375g,一水合檸檬酸鉀0.615g,氫氧化鈉0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去離子水中，再用1000ml容量瓶加去離子水定容至1000ml。每1000ml所述馬精子低溫保存液中添加該糖鹽溶液999ml。
所述組合抗生素制作方法及添加量：稱量慶大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、兩性霉素0.01g溶解于40ml去離子水中。每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入1ml混合抗生素。
所述焦磷酸鈉添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入0.02g。
所述酪蛋白酸鈉添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入10-40g。
所述乳清蛋白添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入5-10g。
所述抗氧化劑及其添加量為，每1000ml所述馬精子低溫保存液中添加甘氨酸(Gly)1g、牛磺酸(Tau)3g、甲流氨酸(Met)3.75g、維生素E(Ve)0.5ml。
一種用于馬精子冷凍保存的稀釋液，所述精子冷凍保存的稀釋液由上述馬精子低溫保存液、抗凍劑和雞卵黃組合而成。
所述馬精子低溫保存稀釋液的添加量為：每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加865ml。
所述抗凍劑包含單一抗凍劑或組合抗凍劑。
所述單一抗凍劑為：甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺。
所述組合抗凍劑的制作方法及添加量為：
組合1：1/3甘油與2/3甲基甲酰胺；
組合2：2/3甘油與1/3甲基甲酰胺；
組合3：1/3甘油與2/3二甲基甲酰胺；
組合4：2/3甘油與1/3二甲基甲酰胺；
組合5：1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺；
組合6：1/3二甲基甲酰胺與2/3甲基甲酰胺；
組合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺；
每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加35ml組合抗凍劑。
所述雞卵黃的添量為：每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加100ml。
下面結合實施例對發明作進一步的描述。
實施例1混合抗生素的制備
稱量慶大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、兩性霉素0.01g溶解于40ml去離子水中，置于4℃冰箱中備用。
實施例2組合抗凍劑的制備
組合1：1/3甘油與2/3甲基甲酰胺
組合2：2/3甘油與1/3甲基甲酰胺
組合3：1/3甘油與2/3二甲基甲酰胺
組合4：2/3甘油與1/3二甲基甲酰胺
組合5：1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺
組合6：1/3二甲基甲酰胺與2/3甲基甲酰胺
組合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺
實施例3糖鹽溶液
稱量碳酸氫鈉0.33g，羥乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合檸檬酸鈉0.375g,一水合檸檬酸鉀0.615g,氫氧化鈉0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去離子水中，添加1ml混合抗生素，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加去離子水定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實施例4酪蛋白酸鈉的保護作用
稱量酪蛋白酸鈉1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實施例5乳清蛋白的保護作用
稱量乳清蛋白1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實施例6酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協同保護作用
稱量酪蛋白酸鈉1g及乳清蛋白1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實施例7不同濃度的酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協同保護作用
稱量酪蛋白酸鈉1、2或4g及乳清蛋白0.5、1或2g按照表1分別溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
表1不同濃度的酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協同保護作用分組配置表
注釋：酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，SC)，乳清蛋白(whey protein，WP)
實施例8焦磷酸鈉的作用
稱量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.004g,0.02g或0.04g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實施例9抗氧化劑的作用
稱量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.02g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；分成5份，向其中分別加入1g甘氨酸或3g牛磺酸或3.75g甲硫氨酸或0.5ml維生素E，置于4℃冰箱中備用。
實施例10單一抗凍劑的抗凍保護作用
稱量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.02g，甘氨酸1g，牛磺酸3g，甲硫氨酸3.75g和維生素E 0.5ml溶解于800ml去離子水中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml雞卵黃和35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，攪拌均勻，置于4℃冰箱中備用。
實施例11組合抗凍劑的抗凍保護作用
稱量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，肌醇0.01g，焦磷酸鈉0.02g，甘氨酸1g，牛磺酸3g，甲硫氨酸3.75g和維生素E 0.5ml溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml雞卵黃和35ml 7種組合抗凍劑之一，攪拌均勻，置于4℃冰箱中備用。
試驗例1
下面結合試驗例對酪蛋白酸鈉和乳清蛋白在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
1不濃縮精液低溫保存(含有25％精清)
將過濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲存，48h后檢測精液活力參數。
2濃縮后精液低溫保存(不含精清)
過濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液低溫保存稀釋液稀釋至50×106個/ml濃度置于5℃儲存，48h后檢測精液活力參數。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質量評定結果
當保存液中不含精清時，糖鹽溶液中添加乳清粉組和乳清粉+酪蛋白酸鈉組TM、PM、VAP及RAP顯著高于對照組；當保存液中含有25％濃度精清時，糖鹽溶液中添加酪蛋白酸鈉和乳清粉+酪蛋白酸鈉組TM、PM及RAP值顯著高于對照組。
試驗例1結果如下表所示
注釋：同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)。
試驗例2
下面結合試驗例對不同濃度酪蛋白酸鈉和乳清蛋白在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲存，48h后檢測精液活力參數。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質量評定結果
低溫保存48h后檢測結果表明：SC 4+Whey 1和SC 2+Whey 1組TM值顯著高于其他四組；SC 4+Whey 1組PM值顯著高于其他五組；SC 4+Whey 1組RAP值顯著高于其他五組，SC 1+Whey 2組RAP值顯著低于SC 0.5+Whey 1和SC 2+Whey 1組。這一結果表明在糖鹽溶液中同時添加1g/mL濃度乳清粉和4g/mL濃度的酪蛋白酸鈉可以獲得最佳的保存效果。
試驗例2結果如下表所示
注釋：同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗例3
下面結合試驗例對焦磷酸鈉在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲存，48h后檢測精液活力參數。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質量評定結果
低溫保存48h后檢測結果表明：添加4、20及40mg/L濃度焦磷酸鈉組精子TM、PM、VAP及RAP均高于對照。
試驗例3結果如下表所示
注釋：同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗例4
下面結合試驗例對四種抗氧化劑在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲存，48h后檢測精液活力參數。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質量評定結果
低溫保存72h后檢測結果表明：添加甘氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸及維生素E四組精子TM、PM、VAP及RAP均高于對照。
試驗例4結果如下表所示
注釋：甘氨酸Gly；甲硫氨酸Met；牛磺酸Tau；維生素E Ve；同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗例5
下面結合試驗例對不同抗凍劑在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
過濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個/ml濃度，裝入0.5ml細管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子質膜完整性(viability)用SYBR14/PI熒光染色試劑盒進行檢測(Invitrogen，L-7011)。具體方法為：精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml HEPES緩沖液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM濃度的PI(propidium iodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS稀釋后滴片置于熒光顯微鏡(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下觀測。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
用JC-1(Invitrogen,M34152)熒光染料染色檢測精子線粒體膜電勢(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片觀察，每個視野在熒光下對染色精子進行計數，然后轉換至可見光下對總精子數進行計數。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
精子頂體缺損率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin of arachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)熒光染料染色觀測。精液解凍后用PBS1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片用熒光顯微鏡觀察。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
(四)精子質量評定結果
比較三種不同濃度甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺與常規抗凍劑甘油、乙二醇及二甲基亞砜對馬精子冷凍效果的影響。結果顯示3.5％的甲基甲酰和二甲基甲酰胺凍后精子質量最好。
試驗例5結果如下表所示
注釋：同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗例6
下面結合試驗例對7種不同抗凍劑組合在馬精子低溫保存中的作用對本發明進行說明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進行精液保存實驗，用母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
過濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個/ml濃度，裝入0.5ml細管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液質量評價
用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動參數。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺的計算機精子輔助分析儀下，進行精液質量評價，評價參數主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運動精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子質膜完整性(viability)用SYBR14/PI熒光染色試劑盒進行檢測(Invitrogen，L-7011)。具體方法為：精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml HEPES緩沖液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM濃度的PI(propidium iodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS稀釋后滴片置于熒光顯微鏡(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下觀測。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
用JC-1(Invitrogen,M34152)熒光染料染色檢測精子線粒體膜電勢(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片觀察，每個視野在熒光下對染色精子進行計數，然后轉換至可見光下對總精子數進行計數。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
精子頂體缺損率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin of arachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)熒光染料染色觀測。精液解凍后用PBS1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片用熒光顯微鏡觀察。每個實驗組解凍3支細管，每支細管取3個觀察視野，每個樣本計數精子個數不少于500個。
(四)精子質量評定結果
7種組合抗凍劑對馬精子冷凍效果的顯示：組合1凍后精子活率顯著高于組合5、組合7、甘油組及甲基甲酰胺組(P<0.05)。組合2凍后PM值顯著高于二甲基甲酰胺和組合5(P<0.05)。
試驗例6結果如下表所示
注釋：同列數據上標不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗例7
下面結合試驗例低溫和冷凍保存后精液受胎率對本發明進行說明。
(一)精液采集
母馬誘情，當公馬勃起爬跨時，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺馬右或左后側，將假陰道平放于母馬尻側，并迅速將陰莖導入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過濾后備用。本方法精子采集的過程遵循自然規律，用人工假陰道誘導雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
1.低溫保存
將過濾后精液分成兩份，一份用自配液稀釋3倍，另一份用進口商品馬專用稀釋液稀釋3倍，置于5℃儲存8-12h后用于輸精實驗。
2.精液冷凍
過濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個/ml濃度，裝入0.5ml細管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存，配種前37℃水浴30s解凍,評價精液活力參數。
(四)精子受胎率驗證
1.低溫保存后精液的受胎驗證
4匹英純血種公馬按順序輪流采精，每匹公馬每周采精2-3次。精液采集后離心濃縮處理，用本專利低溫保存液和對照稀釋液(馬專用進口商品稀釋液)稀釋至2億/ml，5℃保存8-12h后，用于輸精驗證受胎效果。
供試母馬共計114匹，其中71匹母馬用對照稀釋液保存后的精液輸精，另外43匹母馬用本專利低溫保存液稀釋保存后的精液輸精。母馬的發情鑒定和輸精時間的確定采用直腸觸摸檢查卵巢的方式實施。當卵泡發育至3期卵泡時進行一次輸精，間隔大約24小時再進行卵巢檢查，未排卵則再輸精一次，直至排卵，每次輸精所用公馬精液由輸精當天公馬的輪序決定。采用子宮角輸精法，每次輸入1個億有效精子，排卵后13天B超檢查妊娠結果。
2.凍精受胎驗證
2匹英純血種公馬按上述所述冷凍方法，解凍后輸精進行受胎驗證。供試母馬30匹，采用B超探測結合激素誘導確定輸精時間，每天7點和19點B超檢查母馬卵泡發育情況，當卵泡大于35×35mm時注射5000IU單位人絨毛膜促性腺激素(HCG)，于注射激素24h后，每間隔6-12h B超探測(卵泡大小)結合觸摸卵泡質地(軟硬)綜合確定輸精時間，每次輸入6-8支0.5ml細管精液，總前進精子數約為200～300×106個總精子。
應當強調的是，對本領域技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
(四)受胎率評定結果
專利低溫保存稀釋液與進口商品低溫保存稀釋液保存馬精子8-12h后，人工授精驗證受胎率，結果表明本專利稀釋液情期受胎率為67.7％(29/43)，進口商品稀釋液情期受胎率為57.7％(41/71)，表明本專利稀釋液保存效果優于進口商品液，彰顯了技術進步。
用本專利冷凍稀釋液進行精液冷凍，解凍后進行受胎率驗證，情期受胎率達到了50％(15/30)。這一受胎率略高于國際上報道的40-50％情期受胎率，彰顯了技術進步。