一種以花瓣為外植體建立藍晶花小鱗莖再生體系的方法與流程

本發明涉及植物快速繁殖領域，尤其涉及一種以花瓣為外植體建立藍晶花小鱗莖再生體系的方法。

背景技術：

藍晶花(Griffinia)為石蒜科(Amaryllidaceae)藍晶花屬，是原產于巴西的熱帶球根花卉；多生長于植被茂密、潮濕的熱帶雨林，直徑2-3cm，為微型球根植物。自然生長條件下，藍晶花一般通過分球法分生出側生小鱗莖而形成新植株。該屬植物無法自交，通過種子繁殖需要有兩個不同的個體，并且種子成熟要歷經長達8個月的時間。因此，營養生長期長、自然繁殖系數低成為了制約藍晶花屬植物擴繁的兩個重要因素。

此外，由于原生地森林面積的日益縮減，作為瀕危物種的藍晶花在其原生地已面臨滅絕的威脅。因此，通過人工方法建立高效的藍晶花組培擴繁體系顯得尤為重要。

目前，國內外已有關于石蒜科植物的再生體系建立方法的研究，例如：

申請公布號為CN105379618A的發明專利申請文獻公開了一種石蒜離體快速繁殖方法，該方法包括如下步驟：取露地種植的石蒜種球，消毒，將母球附近附生的子球取下種植1～2個月；將種球消毒后去掉外麟皮，剝取種芽，進行不定芽的誘導生長培養，獲得帶有不定芽叢的組織塊；將得到的組織塊制成縱分組織塊，在芽伸長培養基上進行芽伸長培養；得到的不定芽伸長產生側芽時，進行切分后放入生根培養基中進行誘導生根培養，獲得石蒜幼苗。該發明以石蒜的幼嫩小芽為外植體，直接再生大量不定芽，繼而得到再生苗，再生效率增高，出芽率為90％以上，污染率降低，培養過程中不會出現反復污染的情況，通過調節培養基條件可提高誘導率并縮短再生周期。

申請公布號為CN102217540A的發明專利申請文獻公開了一種中國石蒜的快速繁殖方法，該方法包括：取中國石蒜的種胚，接種于誘導培養基上誘導愈傷組織；將愈傷組織轉接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培養基上誘導不定芽；將不定芽轉接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培養基上誘導小鱗莖；將已展葉的小鱗莖轉接于含瓊脂和NAA的MS培養基上，光照下誘導生根；將已生根的鱗莖移栽于珍珠巖+腐殖質的移栽基質培養。該發明以中國石蒜的種胚為外植體，先誘導外植體產生愈傷組織，進而誘導不定芽、小鱗莖的發生，最終完成植株再生，為中國石蒜組織培養快速繁殖增添了又一條新途徑。該方法不但增殖系數高，一年可生產百萬個小鱗莖，能夠為快速繁殖種球提供有效途徑；而且試管苗分化同步程度高、一致性好，規模化生產開發價值高，具有很好的經濟前景。

申請公布號為CN1596600A的發明專利申請文獻公開了一種長筒石蒜繁殖方法，該方法以長筒石蒜帶莖盤鱗片為外植體，采用“兩步法”，即先誘導不定芽，進而誘導小鱗莖的發生。以MS為基本培養基，附加不同種類和濃度的植物生長調節物質誘導小鱗莖。通過該方法小鱗莖(芽)每20天增殖率可達480％，一年可生產百萬個小鱗莖。

申請公布號為CN105475143A的發明專利申請文獻公開了一種長筒石蒜組織培養得到再生植株的方法，該方法主要包括以下步驟：步驟1、以長筒石蒜的種子胚或花朵為材料誘導出愈傷組織；步驟2、將愈傷組織順次進行不定芽誘導培養以及生根誘導培養，即得到長筒石蒜再生植株。該發明利用石蒜種子胚或花朵為外植體誘導愈傷組織獲得完整植株，不僅使石蒜的外植體來源更為廣泛易得，而且誘導成功率大幅度提高，誘導成功率達到80％以上，相對于傳統的利用石蒜鱗莖為外植體進行誘導的方法提高至少30％，從根本上解決了石蒜的快速繁殖的技術問題。此外，通過該種方法誘導培養所得植株也更為健壯，成活率高，生長速度快。

然而，目前尚無關于藍晶花擴繁體系建立的報道。因此，有必要探究一種更適合于藍晶花離體擴繁體系建立的再生體系建立方法。

技術實現要素：

本發明提供了一種以花瓣為外植體建立藍晶花小鱗莖再生體系的方法，該方法可顯著提高藍晶花小鱗莖的誘導率，有效縮短藍晶花的育種周期。

一種以花瓣為外植體建立藍晶花小鱗莖再生體系的方法，包括以下步驟：

(1)取藍晶花花蕾，消毒處理后，切取花瓣，接種于愈傷誘導培養基上，培養獲得含小鱗莖的愈傷組織；

(2)將小鱗莖從步驟(2)所述愈傷組織中剝離下來，并轉入增殖培養基中，培養獲得小鱗莖增殖體；

(3)取所述小鱗莖增殖體，接入生根培養基中，進行小鱗莖的膨大和生根誘導，獲得藍晶花小鱗莖。

關于石蒜屬植物擴繁體系的建立已有相關報道，但是兩者(石蒜屬、藍晶花屬)雖為同科(石蒜科)而形態、生理、生長發育等屬性相差較大，所以在組培擴繁體系的建立方法上也存在著較大的差異。

石蒜屬植物的鱗莖直徑達6-7cm，而藍晶花屬植物的鱗莖直徑僅2-3cm，不適合選取嬌小的鱗莖為外植體；石蒜屬植物易結實，可以選用種子胚；但藍晶花屬植物結實率較低，不適合選用種子、種子胚作為外植體；石蒜屬植物一年僅開花一次，且一球僅抽生一個花序，花期較短，而多數藍晶花屬植物一年可多次開花，一球可抽生1-2個花序；因此，藍晶花屬植物花器官易得，本發明將花器官用于組培外植體的來源。

開花前一周含苞期的花苞因花被片未打開，外植體不易受到污染，且花器官幼嫩，誘導力強；作為優選，所述藍晶花花蕾為處于含苞期且長1.5～2.5cm的花苞。

在消毒處理前，將藍晶花花蕾(即外植體)進行冷藏可有效減少花蕾表面細菌的污染，有利于降低花苞外植體的污染率。

具體地，所述消毒處理的過程，包括：將所述藍晶花花蕾置于4℃下冷藏1周后，用表面活性劑浸泡藍晶花花蕾，清洗后；再用消毒試劑浸泡藍晶花花蕾，清洗后，得到已消毒的藍晶花花蕾。

其中，所述表面活性劑為吐溫和/或洗潔精，浸泡時間為15～20min。所述消毒試劑為體積分數75％的乙醇以及質量體積比為0.1％的升汞；外植體先在乙醇中浸泡30s，再在升汞中浸泡8～10min；最后用無菌水漂洗3～5遍，直至無明顯泡沫。

清洗時，采用紗布包裹藍晶花花蕾可避免因流水直接沖擊幼嫩花蕾而造成的花蕾損傷。由于藍晶花花器官個體小，組織材料薄，在濕潤的情況下接種，花瓣易粘連在一起，不利于外植體與培養基的接觸，且容易造成污染；所以，接種前需將消毒處理后的藍晶花花蕾表面水分吸干。

作為優選，步驟(1)中，所述愈傷誘導培養基為：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，6-芐氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L，pH 5.8。

作為優選，步驟(1)中，培養的條件為：25±2℃條件下，全黑暗培養45～60d。

作為優選，步驟(2)中，所述增殖培養基為：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，6-芐氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.5～1.0mg/L，pH 5.9。

因誘導藍晶花屬植物愈傷組織并維持愈傷組織的持續增殖較為不易，所以在誘導培養過程中，需要每30d繼代一次，將誘導形成的愈傷組織團塊連同其雄蕊外植體一起轉接至新鮮的愈傷誘導培養基上至不定芽形成。因為此時剛剛誘導出的愈傷組織無法直接從培養基中吸收營養，所以需要連帶外植體一同繼代，通過外植體母體來傳遞養分；如果過早的將其從母體上剝離下來單獨接種，會導致愈傷組織的干癟或者褐化死亡，無法分化形成不定芽。

步驟(2)中，所述剝離有助于分化形成的小鱗莖的增殖；因為若小鱗莖繼續附著于花瓣外植體上，會抑制其進一步增殖。

作為優選，步驟(3)中，所述生根培養基為：MS 4.43g/L，α-萘乙酸0.5～2.0mg/L、蔗糖60～90g/L、瓊脂8g/L，pH 5.9。

作為優選，步驟(2)和(3)中，培養的條件為：在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間為14h·d^-1，溫度為25±2℃的條件下，培養60～90d。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

(1)本發明以花瓣為外植體，通過消毒處理、誘導愈傷、小鱗莖再生和增殖以及小鱗莖膨大和生根培養，獲得藍晶花小鱗莖再生體系；顯著降低了污染率，提高了誘導率和增殖效率，縮短了擴繁周期。

(2)本發明利用花器官作為外植體，污染率低(污染率可降低為0)、愈傷誘導率高(愈傷誘導率達75％以上)、花器官材料易得；同時，不損耗母球，有利于小球型球根花卉藍晶花屬植物的種質資源保護；建立通過花器官(花瓣)擴繁得到大量藍晶花小鱗莖的人工繁殖體系，可應用于藍晶花屬植物的生產化擴繁。

(3)本發明通過幼嫩花瓣誘導愈傷，經再分化途徑可形成大量小鱗莖，增殖效率顯著高于通過自然條件下鱗莖分球的方法，增殖效率高(增殖比率達1:9-1:25)、擴繁周期短(從誘導愈傷至獲得大量膨大健壯的小鱗莖僅需要10-11個月)，每個花瓣外植體可獲得16-30株小鱗莖，直徑達0.7～1.3cm。

附圖說明

圖1為實施例1中接種至愈傷誘導培養基60d后，花瓣外植體誘導形成的愈傷組織團塊。

圖2為實施例3中接種至增殖培養基90d后獲得的藍晶花小鱗莖增殖個體。

圖3為實施例3中接種至膨大及生根培養基90d后，誘導形成的藍晶花小鱗莖。

具體實施方式

實施例1

(1)外植體取材及處理

于藍晶花花期6月，采長1.5～2.5cm的幼嫩花蕾(花苞未打開)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

將冷藏后的花蕾材料轉移至燒杯中，在滴加了少許吐溫及洗潔精的水中浸泡15min，隨后將紗布覆蓋于燒杯口，隔紗布用流水沖洗1h。將沖洗后的外植體置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡處理8min，浸泡過程中不斷搖晃使外植體與消毒試劑充分接觸。

最后，用無菌水漂洗3遍，每遍不少于3分鐘，直至無明顯泡沫出現。用鑷子取出外植體，置于無菌操作臺上，用濾紙吸干表面水分，待接種。

(2)外植體接種及愈傷組織誘導

于超凈工作臺上，用滅菌鑷子和解剖刀將步驟(1)消毒處理后的幼嫩花蕾剝離開，切取花瓣，將其平鋪接種于愈傷誘導培養基上，花瓣基部傷口處輕插入培養基中。在培養溫度為25±2℃的全黑暗誘導條件下45d開始出現愈傷組織，愈傷組織誘導率為75％(如圖1)，污染率為6％。

所述愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43g MS粉，所述培養基中還含有30g/L的蔗糖，8g/L瓊脂，0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值為5.8。

(3)小鱗莖再生

將花瓣外植體連同愈傷組織團塊一起于超凈工作臺上轉接到新鮮的愈傷誘導培養基(愈傷誘導培養基配制見步驟(2))，進行60d的小鱗莖誘導培養，愈傷組織團塊再生分化率達90％。每30d繼代一次，至小鱗莖直徑達0.3～0.5cm。

培養環境的光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1，光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃。

(4)小鱗莖增殖

將分化形成的小鱗莖從愈傷組織團塊上剝離下來，轉入增殖培養基，每4周繼代一次，以維持小鱗莖持續增殖；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的條件下進行60d的小鱗莖增殖培養，獲得小鱗莖增殖比率為1:9。

所述增殖培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加4.43gMS粉，增殖培養基中還含有30g/L的蔗糖、8g/L瓊脂、1.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、0.5mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，pH值為5.9。

(5)小鱗莖膨大及生根培養：

用滅菌的鑷子和解剖刀將經由增殖培養得到的小鱗莖叢剝落分離成單獨的小鱗莖個體，基盤向下輕插入培養基中，進行小鱗莖的膨大及生根誘導；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的培養條件下培養60d，可獲得生長健壯、根系發達、鱗莖顯著膨大(直徑0.7cm左右)的藍晶花小鱗莖。

所述膨大及生根培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基中添加有4.43g MS粉，膨大培養基中還含有濃度為0.5mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、60g/L的蔗糖、8g/L的瓊脂；pH值為5.9。

實施例2

(1)外植體取材及處理

于藍晶花花期6月，采長1.5～2.5cm的幼嫩花蕾(花苞未打開)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

將冷藏后的花蕾材料轉移至燒杯中，在滴加了少許吐溫及洗潔精的水中浸泡15min，隨后將紗布覆蓋于燒杯口，隔紗布用流水沖洗1.5h。將沖洗后的外植體置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡處理10min，浸泡過程中不斷搖晃使外植體與消毒試劑充分接觸。

最后，用無菌水漂洗4遍，每遍不少于3分鐘，直至無明顯泡沫出現。用鑷子取出外植體，置于無菌操作臺上，用濾紙吸干表面水分，待接種。

(2)外植體接種及愈傷組織誘導

于超凈工作臺上，用滅菌鑷子和解剖刀將步驟(1)消毒處理后的幼嫩花蕾剝離開，切取花瓣，將其平鋪接種于愈傷誘導培養基上，花瓣基部傷口處輕插入培養基中。在培養溫度為25±2℃的全黑暗誘導條件下60d開始出現愈傷組織，愈傷組織誘導率為80％，污染率為0。

所述愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43g MS粉，所述培養基中還含有30g/L的蔗糖，8g/L瓊脂，1.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值為5.8。

(3)小鱗莖再生

將花瓣外植體連同愈傷組織團塊一起于超凈工作臺上轉接到新鮮的愈傷誘導培養基(愈傷誘導培養基配制見步驟(2))，進行75d的小鱗莖誘導培養，愈傷組織團塊再生分化率達90％。每30d繼代一次，至小鱗莖直徑達0.3～0.4cm。

培養環境的光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1，光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃。

(4)小鱗莖增殖

將分化形成的小鱗莖從愈傷組織團塊上分離下來，轉入增殖培養基，每4周繼代一次，以維持小鱗莖持續增殖；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的條件下進行75d的小鱗莖增殖培養，獲得小鱗莖增殖比率為1:17。

所述增殖培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加4.43g MS粉，增殖培養基中還含有30g/L的蔗糖、8g/L瓊脂、2.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、1.0mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，pH值為5.9。

(5)小鱗莖膨大及生根培養：

用滅菌的鑷子和解剖刀將經由增殖培養得到的小鱗莖叢剝落分離成單獨的小鱗莖個體，基盤向下輕插入培養基中，進行小鱗莖的膨大及生根誘導；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的培養條件下培養75d，可獲得生長健壯、根系發達、鱗莖顯著膨大(直徑1.0cm左右)的藍晶花小鱗莖。

所述膨大及生根培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基中添加有4.43g MS粉，膨大培養基中還含有濃度為1.0mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、60g/L的蔗糖、8g/L的瓊脂；pH值為5.9。

實施例3

(1)外植體取材及處理

于藍晶花花期6月，采長1.5～2.5cm幼嫩花蕾(花苞未打開)，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周。

將冷藏后的花蕾材料轉移至燒杯中，在滴加了少許吐溫及洗潔精的水中浸泡20min，隨后將紗布覆蓋于燒杯口，隔紗布用流水沖洗1.5h。將沖洗后的外植體置于(v/v)75％的乙醇中浸泡30s，再置于(w/v)0.1％升汞中浸泡處理10min，浸泡過程中不斷搖晃使外植體與消毒試劑充分接觸。

最后，用無菌水漂洗5遍，每遍不少于3分鐘，直至無明顯泡沫出現。用鑷子取出外植體，置于無菌操作臺上，用濾紙吸干表面水分，待接種。

(2)外植體接種及愈傷組織誘導

于超凈工作臺上，用滅菌鑷子和解剖刀將步驟(1)消毒處理后的幼嫩花蕾剝離開，切取花瓣，將其平鋪接種于愈傷誘導培養基上，花瓣基部傷口處輕插入培養基中。在培養溫度為25±2℃的全黑暗誘導條件下60d開始出現愈傷組織，愈傷組織誘導率為85％，污染率為0。

所述愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，所述培養基中還含有30g/L的蔗糖，8g/L瓊脂，0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)，2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，pH值為5.8。

(3)小鱗莖再生

將花瓣外植體連同愈傷組織團塊一起于超凈工作臺上轉接到新鮮的愈傷誘導培養基(愈傷誘導培養基配制見步驟(2))，進行90d的小鱗莖誘導培養，愈傷組織團塊再生分化率達95％。每30d繼代一次，至小鱗莖直徑達0.4～0.5cm。

培養環境的光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1，光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃。

(4)小鱗莖增殖

將分化形成的小鱗莖從愈傷組織團塊上分離下來，轉入增殖培養基，每4周繼代一次，以維持小鱗莖持續增殖；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的條件下進行90d的小鱗莖增殖培養(如圖2)，獲得小鱗莖增殖比率為1:25。

所述增殖培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加4.43gMS粉，增殖培養基中還含有30g/L的蔗糖、8g/L瓊脂、2.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyladenine,6-BA)、0.5mg/Lα-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)，增殖培養基的pH值為5.9。

(5)小鱗莖膨大及生根培養：

用滅菌的鑷子和解剖刀將經由增殖培養得到的小鱗莖叢剝落分離成單獨的小鱗莖個體(如圖3)，基盤向下輕插入培養基中，進行小鱗莖的膨大及生根誘導；在光照強度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為(25±2)℃的培養條件下培養90d，可獲得生長健壯、根系發達、鱗莖顯著膨大(直徑1.3cm左右)的藍晶花小鱗莖，如圖3。

所述膨大及生根培養基以MS培養基(Murashige and Skoog,1962)為基本培養基，即每升培養基中添加有4.43g MS粉，膨大培養基中還含有濃度為2.0mg/L的α-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)、90g/L的蔗糖、8g/L的瓊脂；pH值為5.9。

最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容中直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。