本發明涉及的是一種農業技術領域的組織培養方法，具體是一種北五味子誘導不定芽的方法。
背景技術：
組織培養是加速植物繁殖、創造優良品種的一種行之有效的方法，為農業生產提供許多優良的新品種，也為農業生產工廠化提供了廣闊的前景。MS培養基，6-BA，NAA，ZT的選用在誘導不定芽萌發和不定芽增殖中已經得到肯定。
北五味子這一中國傳統著名的藥材近年來在國外受到相當的關注，其含有大量的精油、酸等液體物質，具有增強視力和聽力能力，消除眼部疲勞，加強視力集中，增強機體免疫能力，提高抵抗力等功能。因此北五味子可以成為一些特殊職業的必備良藥，諸如長途駕駛司機、飛行員、航海員和運動員等都可以用它來緩解工作過程中的巨大壓力。
經對現有技術的文獻檢索發現，陳雅君等在《植物研究》(1999，7，19(3)：318-322)上發表的《藥用植物北五味子的組織培養》該文中提出以帶腋芽的北五味子嫩莖為外植體，在附加6-BA2.0+ZT0.1mg/L的MS培養基上，誘導芽的效果最好。其具體方法為：把北五味子嫩莖剪去葉片及葉柄，用自來水沖洗，并加少量市售洗衣粉加以洗滌，用自來水沖洗4～5小時，然后切成約5cm長的莖段移到超凈工作臺上，先用70％酒精浸泡30秒，再用0.2％溶液消毒8分鐘，取出后用無菌水沖洗5次，切成長度約0.5cm左右的小段，每段至少有一個葉腋，按無菌操作要求，接種于培養基上。將培養瓶置于20～26℃，光照強度為2000Lx的培養室，光照時間每天為12小時。其不足在于：升汞溶液有劇毒，對植物材料損傷大，對人體有危害性，處理不當對環境有污染，不適宜實際應用。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足，提供一種北五味子誘導不定芽的方法，使其提供北五味子組培快繁的不定芽誘導所需要的最佳培養基和外植體消毒方法，為優良北五味子的快速繁殖提供了技術保證，將對北五味子資源的開發和利用起到積極的推動作用。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下具體步驟：
①取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養地外植體材料；
②采用間二滅菌法對外植體材料消毒；
③在誘導培養基上培養獲得無菌叢生芽；
④叢生芽經過分株后再接種于誘導培養基上培養獲得大量不定芽。
所述采用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指：用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒后接種于誘導培養基上，隔一天后再用次氯酸鈉消毒一次。
進一步的，所述采用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指：剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導芽的培養基上，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，以獲得高質量的無菌北五味子外植體材料。
所述在誘導培養基上培養獲得無菌叢生芽，其培養室溫度20℃-25℃，光照12h/d，光照強度800-12001x。經過20天-30天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽。
所述叢生芽經過分株后再接種于培養基上培養，是指：長出腋芽后繼續培養20天左右，待腋芽長到2cm后，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導培養基上培養。在剪取不定芽時，盡量選擇腋芽莖段，因為該部位在繼代培養中是最容易誘導出更多的不定芽。等待不定芽長成芽叢后，再將不定芽切下分株繼續擴大繁殖，直至到達所需數量。
所述誘導培養基，其成分為：每升液體MS基本培養基中加6-芐氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。
本發明對于外植體的消毒采用了間二滅菌法，原因在于培養的植物材料大都采集于田間栽培植株，材料上常附有各種微生物，一旦被帶入培養基，即會迅速繁殖滋長，造成污染，而接種到培養基上之后兩天是孢子體生命力最弱的階段，此時將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，接種到培養基上后，污染率小于5％，且外植體腋芽萌發率高，相對于傳統的一次滅菌方法，能取得更好的滅菌效果，而且次氯酸鈉相對于其他消毒劑更易于去除，不易殘留在外植體上對其造成損傷。
本發明中培養基附加了低濃度的NAA，其作為一種生長素，主要作用是重新啟動有絲分裂，使已停止分裂的植物細胞恢復分裂能力。在北五味子不定芽誘導的實驗中，低濃度的NAA與6-BA組合，效果比不加NAA要好。不定芽平均增殖系數達到3.4，最高4.1，比前人所作有大幅提高。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
本實施例所使用的誘導培養基，通過以下方法制成：每升液體MS基本培養基中加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值調為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養基。
實施例1
剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值調為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養基)100個，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導培養基上，在溫度20℃，光照12h/d，光照強度12001x條件下培養。經過20天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種到上述培養基上繼續培養，30天后統計不定芽數量為211個，增殖系數為3.52。
實施例2
剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)1.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.03mg、ZT(玉米素)0.04mg、蔗糖30g，pH值調為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養基)100個，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導培養基上，在溫度25℃，光照12h/d，光照強度8001x條件下培養。經過25天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種到上述培養基上繼續培養，30天后統計不定芽數量為166個，增殖系數為2.76。
實施例3
剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.07mg、ZT(玉米素)0.08mg、蔗糖30g，pH值調為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養基)100個，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導培養基上，在溫度22℃，光照12h/d，光照強度10001x條件下培養。經過26天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種到上述培養基上繼續培養，30天后統計不定芽數量為175個，增殖系數為2.92。