使用鎖核酸進行精細胞和胚胎的性別特異性鑒定的制作方法
【專利摘要】本申請公開了包含與性別特異性重復序列結合的經標記鎖核酸的精細胞和胚胎。用于鑒定包含經標記鎖核酸的精細胞或胚胎和將其與不包含經標記寡核苷酸的精細胞或胚胎分離的方法產生了性別富集的精細胞或胚胎級分。分離出的級分用于產生預定性別的后代。
【專利說明】使用鎖核酸進行精細胞和胚胎的性別特異性鑒定
[0001] 緒論
[0002] 在許多行業（包括畜牧業）中，期望產生預定性別或者預定性別比率的后代。精 細胞或者胚胎的性別特異性分離可促進產生具有預定性別的后代。分離出的精細胞可用于 人工授精或體外受精以產生發育成預定性別的生物體的合子。然而，缺乏產生性別足夠富 集的精細胞或胚胎的群體的技術。
[0003] 概述
[0004] 在一方面，提供了用于通過使群體與經標記鎖核酸接觸來分離精細胞或胚胎的群 體的方法，所述經標記鎖核酸能夠與在所述群體的一部分中存在的性別特異性串聯重復序 列結合。然后將所述經標記精細胞或胚胎與所述未經標記精細胞分離。
[0005] 在一方面，提供了具有性別特異性串聯重復序列和與所述性別特異性序列結合的 經標記寡核苷酸部分（例如鎖核酸）的精細胞或胚胎。
[0006] 在另一方面，提供了具有存在于X或Y染色體上的性別特異性串聯重復序列的精 細胞或胚胎的群體。所述精細胞或胚胎的群體的一部分具有與所述性別特異性序列結合的 經標記寡核苷酸部分，其是鎖核酸。
[0007] 在一方面，通過使胚胎的至少一個細胞與鎖核酸接觸來鑒定胚胎的性別。所述鎖 核酸包含標記并且能夠與存在于雌性胚胎或雄性胚胎細胞中的性別特異性串聯重復序列 結合。檢測標記在胚胎中的存在與否有利于鑒定胚胎的性別。
[0008] 在一方面，提供了用于由鎖核酸來靶向序列特異性DNA的方法，例如用于活細胞 中基因表達的位點特異性調節，或者位點特異性基因組DNA改變（包括突變、重組或修復） 的誘導。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1是示出染色體上的性別特異性串聯重復序列（GSTRS)和靶序列的位置的示意 圖。
[0010] 圖2是示出串聯重復序列（GSTRS)的位置的牛Y染色體之重復的非表達序列。
[0011] 圖3是示出合適的芘官能化鎖核酸的結構和具有雙鏈核苷酸的侵入性鎖核酸的 功能的圖。T MP是實驗溫度而是解離溫度。
[0012] 圖4是示出雄性牛體細胞核和侵入性LNA的照片。
[0013] 圖5是示出固定的雄性牛胚胎上的侵入性LNA_Cy3的照片。
[0014] 圖6是示出經INV-Cy3探針標記并且經H〇echst33342共標記的活牛胚胎從而示 出經Hoechst標記的細胞核中INV_Cy3的共定位的照片。
[0015] 圖7是示出雜合到對y-染色體序列具有特異性的iLNA探針的固定的公豬精子之 照片。
[0016] 詳述
[0017] 本發明涉及鑒定精細胞和胚胎的性別以及產生X或Y染色體富集的精細胞級分 (fraction)或胚胎級分。在一個實施方案中，本發明提供了用于分離包含與到性別特異性 串聯重復序列或性別特異性串聯重復序列互補序列（complement)結合的經標記寡核苷酸 部分（moiety)(鎖核酸）之精細胞的方法。寡核苷酸部分以足夠的數量合適地結合到染色 體區域以產生可檢測信號，所述可檢測信號可用作將包含性別特異性串聯重復序列的細胞 與不包含性別特異性串聯重復序列的細胞區分和任選地分離的基礎。本發明還提供了用于 將攜帶X染色體的精細胞或胚胎與攜帶Y染色體的精細胞或胚胎分離的方法。性別富集的 精細胞級分可用于使卵子受精以產生預定性別的后代。本發明還提供了用來選擇攜帶X染 色體的胚胎或攜帶Y染色體的胚胎的方法。在合適情況下，已經與經標記鎖核酸接觸的胚 胎是有活力的，從而避免破壞胚胎的一個或更多個細胞。
[0018] 在另一方面，本發明涉及通過特異性結合和活化鎖核酸來靶向序列特異性DNA的 能力，其可用于活細胞中基因表達的位點特異性調節、特異性基因組DNA改變（包括突變、 重組或修復）的誘導。
[0019] 如本文所使用的，"性別特異性串聯重復序列"或"GSTRS"是在Y染色體或X染色 體上但并不同時在兩者上重復的非常染色體的染色體序列。多個GSTRS存在于X或Y染色 體區域，如圖1中示意性地示出的。圖2示出了示出串聯重復序列（GSTRS)位置的牛Y染色 體之重復的非表達序列。GSTRS可存在于X或Y染色體上的任意位置。在一些實施方案中， 本發明的GSTRS靶標存在于染色體末端或染色體末端附近。性別特異性串聯重復序列可包 含至少約10個核苷酸，至少約50個核苷酸，至少約100個核苷酸，至少約500個核苷酸，至 少約1，000個核苷酸，至少約2, 000個核苷酸，至少約3, 000個核苷酸，或者至少約4, 000個 核苷酸，并且少于約10, 〇〇〇個核苷酸，少于約9, 000個核苷酸，少于約8, 000個核苷酸，少 于約7, 000個核苷酸，少于約6, 000個核苷酸，或者少于約5, 000個核苷酸。合適地，在重 復的GSTRS的每個單元之間具有少于約50, 000個核苷酸，約10, 000個核苷酸，約5, 000個 核苷酸，約3, 000個核苷酸，約2, 000個核苷酸，約1，000個核苷酸，約500個核苷酸，約300 個核苷酸，約100個核苷酸，約10個核苷酸，約1個核苷酸，或者零個核苷酸。GSTRS不必 以完全相同的序列被重復，并且重復序列的一些變型是可能的而不影響本發明的范圍。重 復的GSTRS的單元彼此可共有至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約 95%、至少約97%、至少約98%或者至少約99%的同一性（identity)。可使用在BLASTn 或MEGABLAST程序中使用的算法來測定同一性百分比，其可用于獲得與參考多核苷酸同源 的序列，如本領域已知的。Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250描述了用于序列比對的算法。GSTRS可在染色體上重復至少約50次，至 少約100次，至少約200次，至少約300次，至少約400次，至少約500次，至少約750次，或 者至少約1000次。
[0020] 對于每個GSTRS，鎖核酸可被選擇為與GSTRS或GSTRS的互補序列結合。如圖1 中示意性地描繪的，鎖核酸可靶向GSTRS中較短的靶序列。如本文所使用的，"靶序列"是 GSTRS中的DNA區段，其中鎖核酸與靶序列或靶序列的互補序列結合。靶序列可包含至少約 4個、至少約6個、至少約8個、至少約10個、至少約12個、至少約14個核苷酸，至少約16 個核苷酸，或者至少約18個核苷酸。靶序列可包含少于約100個、少于約90個、少于約80 個、少于約70個、少于約50個、少于約40個、少于約30個、少于約20個、或者少于約16個 核苷酸。鎖核酸可結合到GSTRS或GSTRS互補序列的至少約4個核苷酸，至少約5個核苷 酸,至少約6個核苷酸，至少約9個核苷酸，至少約12個核苷酸，至少約15個核苷酸，至少 約20個核苷酸，至少約25個核苷酸，至少約30個核苷酸，或者至少約35個核苷酸上。鎖 核酸可結合到GSTRS或GSTRS互補序列的少于約100個核苷酸，少于約50個核苷酸，少于 約45個核苷酸，少于約40個核苷酸，或者少于約20個核苷酸上。
[0021] 可通過在公共數據庫中搜索僅在X或Y染色體上高度重復的DNA序列來選擇合適 的GSTRS。可通過掃描GSTRS的連續嘌呤或連續嘧啶（例如同型嘌呤或同型嘧啶序列）來 選擇GSTRS中合適的靶序列。同型嘌呤或同型嘧啶序列有利于使寡核苷酸部分（例如鎖核 酸）結合到雙螺旋DNA的大溝（major groove)以形成三鏈體。性別特異性串聯重復序列 中的靶序列可包括但不限于同型嘌呤或同型嘧啶序列，如在某些實施方案中那樣，鎖核酸 能夠結合任意序列的DNA，包括混合的DNA序列，所述混合的DNA序列包括所有不同的核苷 酸，并且不僅是同型嘌呤或同型嘧啶。
[0022] 在一些實施方案中，靶序列是GSTRS中的自身重復單元。GSTRS可包括靶序列的 至少約1個、至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約7個、至少約10個、 至少約15個、至少約50個、至少約100個、或者至少約200個重復單元。具有更高數量重 復單元的GSTRS可促進更多的寡核苷酸部分結合到GSTRS上。合適地，至少約5個、至少約 10個、至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約 1，000個、至少約5, 000個、至少約25, 000個、或者至少約50, 000個寡核苷酸部分結合到 GSTRS 上。
[0023] 在一些實施方案中，可在GSTRS或GSTRS互補序列中選擇多于一個靶序列。具有更 高數量靶序列的GSTRS將促進更多寡核苷酸部分結合到GSTRS上。在另一些實施方案中， 可選擇多于一種類型的鎖核酸來結合GSTRS或GSTRS互補序列。
[0024] 與靶序列結合的寡核苷酸部分是鎖核酸（LNA)，并且特別合適的是侵入性鎖核酸 (iLNA)。鎖核酸（LNA)是由"鎖定"3'-內（北）構象中核糖之另外的橋修飾的經修飾RNA 核苷酸。可將LNA核苷酸與DNA或RNA殘基混合。這樣的寡核苷酸部分通常為化學合成的。 鎖定核糖構象增強了堿基堆積和骨架預先組織。這顯著地改進了寡核苷酸的雜交性質（溶 解溫度）。
[0025] 侵入性LNA是具有嵌入劑官能化的2'-氨基-a -1-LNA單體的"+1鏈間拉鏈排列" 的DNA雙螺旋。在生理學相關條件下，侵入性LNA有利于序列無限制地靶向雙鏈DNA (dsDNA) 并且能夠特異性地識別短的混合序列dsDNA靶標。
[0026] 目前的探針技術（例如TF0 (三鏈形成寡核苷酸）和PNA(肽核酸））通常經歷靶 序列限制和/或需要非生理離子強度以有效識別dsDNA。侵入性LNA能夠高效靶向異序列 的dsDNA，所述侵入性LNA為具有由N2-芘官能化2'-氨基-a -L-LNA單體的+1鏈間拉鏈 組成的能量熱點（energetic hotpot)的雙螺旋探針。iLNA核苷酸增加了基于寡核苷酸的 技術的強度、靈敏度和特異性并且在生理條件下有利于序列特異性靶向混合序列的dsDNA。
[0027] LNA和iLNA可化學地合成。在PCT公開No. W02011/032034中描述了用于合成LNA 和iLNA的合適方法，其通過引用整體并入本文。圖3說明了合適的侵入性LNA的結構和功 能。鎖核酸可示出對于雙鏈DNA (通過Hoogsteen堿基配對）、單鏈DNA (通過Watson-Crick 堿基配對）和單鏈RNA祀標（通過Watson-Crick堿基配對）的增加的結合親和力。鎖核酸 改進了錯配核酸靶標的辨別以最小化診斷和生物學應用中的假陽性和非靶向特異性效應。 鎖核酸還可增強對酶（例如核酸酶）降解的穩定性。
[0028]
[0029] 式X中示出了適用于本文公開的方法和組合物中的鎖核酸的C5官能化核苷酸。 對于式X，!? 1可選自氫、羥基、巰基、脂肪族、雜脂肪族、芳基、雜芳基、帶電部分以及金屬絡合 物。R2可選自氫、脂肪族、雜脂肪族、芳基、雜芳基、官能團保護基團、含雜原子的化合物（例 如含磷化合物、含氮化合物、含氧化合物、含硫化合物和含硒化合物）。R 3可選自氫、含雜原 子的化合物（例如含磷化合物、含氮化合物、含氧化合物、含硫化合物和含硒化合物）。R4是 選自天然或非天然核堿基的核堿基。連接子部分可選自脂肪族、芳基、雜脂肪族和雜芳基。 Y可選自氧、硫、或者NR5,其中R5選自氫、脂肪族、芳基、雜脂肪族和雜芳基；并且m+n = 2至 4。
[0030] 在某些實施方案中，R1可選自醚、羰基、腈基、二硫化物、硫醚、胺、氨基酸、氨基 糖苷、碳水化合物、熒光團、核苷、核苷酸、寡核苷酸、肽、嵌入劑、類脂質（lipidoids)、甾 醇、嚇啉、蛋白質和維生素。在一些特定實施方案中，R 1可選自酰胺、酯、羧酸、醛、酮、精 胺衍生物、胍基團、自旋標記物、電化學探針、脂肪酸、甘油、乙二醇、聚乙二醇、氧化還原 活性的FRET標記和二茂鐵衍生物。甚至更通常地，R 1可選自氫、羥基、巰基、伯胺、生物 素、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、突光素、羅丹明、花青、花、花、六苯并苯、金剛硼、η 丫陡、菲咯啉 (phenantroline)、二苯基憐醜基疊氮化物（diphenylphosphorylazide)、HIV Tat 片段、 transportan、膽固醇、石膽酸（lithocolic)-油基、肉豆蘧酰基、二十二燒基、月桂酰基、硬 脂酰基、棕櫚酰基、油酰基以及亞油酰基、二氫睪酮、石膽酸、葉酸和維生素 E。
[0031] 在某些實施方案中，單體具有式Y
[0032]
【權利要求】
1. 用于分離精細胞或胚胎的群體的方法，其包括： a) 使所述群體與經標記鎖核酸接觸以提供經標記級分和未經標記級分，所述經標記鎖 核酸能夠與所述群體的一部分中的性別特異性串聯重復序列結合；以及 b) 將所述經標記級分與所述未經標記級分分離。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述鎖核酸包含侵入性鎖核酸。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中在步驟（a)中，多種鎖核酸結合到所述性別特 異性串聯重復序列上。
4. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述鎖核酸是經熒光標簽、重密度標簽、 磁性標簽、納米顆粒、毒素、DNA、siRNA、酶、特異性離子及其組合標記的。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述群體包含精細胞，并且所述經標記級分中至 少70%的細胞包含Y染色體，所述未經標記級分中至少70%的細胞包含X染色體。
6. 根據權利要求4所述的方法，其中所述群體包含精細胞，并且所述經標記級分中至 少70%的細胞包含X染色體，所述未經標記級分中至少70%的細胞包含Y染色體。
7. 根據權利要求1至4所述的方法，其中所述群體包含精細胞，并且其中在步驟（b)之 后所述經標記級分或所述未經標記級分中至少50%的細胞是有活力的。
8. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述群體包含精細胞，并且其中步驟 (b)中對細胞的分離包括通過流式細胞術、離心、磁力的物理分離或者使用影響代謝、活力、 運動性、完整性或受精能力的方法的化學分離。
9. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其還包括在步驟（a)之前或在步驟（a)期間 透化所述精細胞或胚胎。
10. 根據權利要求9所述的方法，其中使用電穿孔、脂質體、滲透壓或滲透肽來透化所 述精細胞或胚胎。
11. 根據權利要求9所述的方法，其還包括在步驟（a)之前或在步驟（a)期間使用微顆 粒、納米顆粒或其他顆粒來促進所述鎖核酸穿透進入所述精細胞或胚胎。
12. 根據權利要求9所述的方法，其中所述鎖核酸通過電穿孔、脂質體、納米顆粒或微 顆粒、滲透壓或者滲透肽來穿透經透化的精細胞或胚胎。
13. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述性別特異性串聯重復序列包含端 粒序列。
14. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述性別特異性串聯重復序列為約 2, 000個至約10, 000個核苷酸。
15. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述經標記寡核苷酸為約12個至約24 個核苷酸。
16. 根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述群體包含選自牛、豬、犬和馬的哺 乳動物精細胞或哺乳動物胚胎。
17. 精細胞或胚胎，其包含性別特異性串聯重復序列和與所述性別特異性串聯重復序 列結合的鎖核酸。
18. 根據權利要求17所述的精細胞或胚胎，其中所述鎖核酸是侵入性鎖核酸。
19. 根據權利要求17或18所述的精細胞或胚胎，其中所述鎖核酸是經熒光標簽、重密 度標簽、磁性標簽、納米顆粒或其組合標記的。
20. 精細胞的群體，所述群體中的每個細胞包含含有性別特異性串聯重復序列的X染 色體或者含有性別特異性串聯重復序列的Y染色體，其中所述細胞中的至少30%包含與所 述性別特異性序列結合的鎖核酸。
21. 根據權利要求20所述的細胞，其中所述細胞中的至少70 %包含與所述性別特異性 序列結合的所述鎖核酸。
22. 根據權利要求20所述的細胞，其中所述細胞中的至少90 %包含與所述性別特異性 序列結合的所述鎖核酸。
23. 用于鑒定胚胎性別的方法，所述方法包括： (a) 使所述胚胎的至少一個細胞與鎖核酸接觸，所述鎖核酸包含標記并且能夠結合性 別特異性串聯重復序列，以及 (b) 檢測所述胚胎中所述標記的存在與否。
24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述胚胎的至少一個細胞是有活力的。
25. 根據權利要求23或24所述的方法，其中使所述胚胎的每個細胞與所述鎖核酸接 觸。
26. 根據權利要求23、24或25所述的方法，其中所述胚胎包含與所述性別特異性串聯 重復序列結合的所述鎖核酸并且其中所述胚胎是有活力的。
27. 根據權利要求23、24、25或26所述的方法，其中所述標記包含CY3并且其中使用熒 光測定技術來檢測所述標記。
【文檔編號】A61B10/00GK104105450SQ201380004915
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年1月3日 優先權日:2012年1月6日
【發明者】布雷德利·迪迪翁, 約翰·韋斯泰根, 帕特里克·赫爾德利奇卡 申請人:Mofa集團有限責任公司