雞繁殖基因啟動區snp分型及啟動子活性檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于生物技術領域，利用PCR-RFLP和雙報告基因技術檢測提供一種 雞繁殖性狀相關基因一一多巴胺受體Dl (DRD1)5'調控區SNP分型及啟動子活性快速檢測 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 多巴胺受體Dl (dopamine receptor Dlgene, DRDl)是由七個跨膜區域組成的G蛋 白偶聯受體家族成員之一。在鳥類中，多巴胺通過血管活性腸肽激活DRDl在下丘腦的水平 來刺激催乳素的分泌（Youngren at el，2002)，且經過多巴胺受體阻斷劑處理的母雞抑制 了催乳素的分泌，導致了就巢性的終止（Millam at el, 1980 ;Shi at el, 1999)，說明鳥類 的繁殖行為和多巴胺受體的調節有關。雞DRDl基因廣泛表達于下丘腦和垂體且此表達與 雞的生殖系統有關，且在催乳素較多的產蛋期，DRDl基因在垂體的表達量增加 （Chaiseha at el，2003)，說明DRDl基因可能是控制雞繁殖性狀的主效基因或候選基因。
[0003] 單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP)，作為第三代遺傳標記 已得到飛速發展，目前已經有多種發展成熟的檢測技術，如單鏈構象多態性（SSCP)、限制性 酶切片段長度多態性（RFLP)、DNA芯片以及Taqman探針等技術手段。限制性片段長度多態 性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP)技術就是利用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶 消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分型。該技術具有特異性高、檢測快速、通用 性強、適用范圍廣、成本低廉等特點，目前已成功應用于人類疾病及禽病相關基因分子標記 的SNP檢測和基因診斷試劑盒的研發。
[0004] 報告基因是一種編碼某種易于檢測蛋白質或酶的基因，通過它的表達產物來標定 目的基因的表達調控。該技術的主要優點是高靈敏度、可信性及檢測方便且適合大規模檢 測。目前已廣泛應用于啟動子分析、監控轉基因及其表達、細胞的信號轉導與藥物的篩選等 多種細胞事件。隨著技術和檢測方法的進步，熒光分析以其能夠將細胞內報告基因的活性 可視化和對細胞的非破壞性而越來越成為主流，因此熒光素酶和綠色熒光蛋白這兩種可發 出熒光的報告基因成為眾多報告基因中的后起之秀。雙報告基因技術結合了螢火蟲熒光素 酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試，在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試，快速、靈敏、簡 便。報告基因表達活力的相對改變與偶聯調控啟動子轉錄活力的改變相關，雙報告基因技 術使偶聯到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉錄活力的內對照，使測試不被實驗條 件變化所干擾，確保了實驗結果的準確性。
[0005] 經過對現有國內外文獻和專利的檢索，至今未見有DRDl基因5'調控區多態性位 點及其啟動子活性與雞繁殖性狀相關性的報道。 【實用新型內容】
[0006] 本實用新型的目的是為了給雞繁殖性狀相關基因一一DRDl基因5'調控區 G-570A(由啟動子的第一個堿基向調控區方向的第570個堿基）位點的檢測提供一種基因 分型及啟動子活性檢測試劑盒，該試劑盒準確性高、快速、價格低廉。
[0007] 本實用新型的目的是通過以下技術方案實現的，雞繁殖性狀相關基因一一 DRDl基因5'調控區SNP分型及啟動子活性快速檢測試劑盒，包括盒體，所述盒體內設 有襯墊，襯墊上設有孔腔，孔腔內分別設有用于DRDl基因5'調控區PCR擴增的上下游 引物混合物P、DNA Tag酶、DNA Tag酶擴增緩沖液、dNTP、內切酶緩沖液、MspI內切酶、 pGL3-DRDl-57〇-GG-Basic/promoter 質粒 l、pGL3-DRDl-57〇-AA-Basic/promoter 質粒 2、pGL3_Basic 質粒 3、pRL-CMV 質粒 4、轉染試劑、IXPBS、Dual-Glo Luciferase Reagent 雙熒光素酶試劑、Dual-Glo Stop&Glo Substrate雙熒光素酶終止反應底物、Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer雙焚光素酶緩沖液。
[0008] 優選地，所述盒體橫截面是圓形。
[0009] 優選地，所述盒體上設有盒蓋，盒蓋為圓形。
[0010] 引物混合物P表示用于DRDl基因5'調控區PCR擴增的上下游引物混合物，引物 信息如下：
[0011] 上游引物 S :5' ACAAAGTGAAGAATTGCTCGCCG 3'
[0012] 下游引物 A :5' GCAATCACTTTTCCATGCTTGCAT 3'。
[0013] 質粒 I (pGL3-DRDl-570-GG-Basic/promoter)表示將啟動子區域（-570 堿基為 G) 正確插入報告基因質粒（pGL3-Basic)中的重組質粒（大寫字母為啟動子區域，小寫字母為 pGL3-Basic質粒部分序列，帶框ATG為啟動子，帶框G為啟動子第一個字母向調控區方向的 第570個堿基），其信息如下：
[0014] ggtaccgagctcttacgcgtTGCTGGGTTTGTAAGATTTGCTATGCAATTCCAAACCTAAATGAGGAGA AGAGGCGGCCCTGCATCCCAGAGCAAACAGAAACCAAGGTGAAAGGTAGGAGCCAGAATTTCTCATTTCAATAAAAC TMATAACCTGAGCTACTTCTTACTGAAAACCTTTAMACACACCTGCTCTGTGCTTATTTCCTTTGTCTCTGGAAGT gtmaacttgaaacaaagtgaagmttgctcgctgItgctgcccagmgcagagaactgatggattttgtaacagga GTGTGCTGAGGAGGAAGGATGGGGTGTTTAATCAGTGAGACACTTAGGGAACCAAAGCAGAGGAA AAGCACCTCGT ACAGTACGCATCAGTAAATATGAAGGGCTAGTGCAATGGACGCTGGAAACACTCGATCAATAGTCTATTTAAGTGGG AATATATGCAAGCATGGAAAAGTGATTGCTTTCCGGTCTGTGGGGTATATTTGCAGAGGACAGCAGCAGAACATTTG CAGGTGAGCTGTCTGAATTAGGCTGCTTCGTGCTGGGGTGGTGCAGCGTGTTTCTGAAGGGATCGCTTAAAAACCCC TCTGTATTTGTGCATTTTCGGTTCCTGCTCATAGAGCTTTCAATGTCGTTCAGGGAGATTCAGAGTGGATGAAGTCC ATCTGGGCTTGAGGGGACCGTAACCAAGAGCCTTTGGTCTGTCCAGAGATGACTAATTAACGGACGTCTCATGTCTG CTATCTGTAAGGAAAGGAGCTGATGTTGTCATGAGAATCATGATGTGATTTTCCCTCAGGAGAAACT SaCTTGG AACGACACCACTATGGATGGGGAAGGGTTGCTTGTGGAAAGGGACTCTTCCTTTCGGATCCTCACctcgaGatctgc gatctaagtaagctt 〇
[0015] 質粒 2 (pGL3-DRDl-570-AA-Basic/promoter)表示將啟動子區域（-570 堿基為 A) 正確插入報告基因質粒（pGL3-Basic)中的重組質粒（大寫字母為啟動子區域，小寫字母為 pGL3-Basic質粒部分序列，帶框ATG為啟動子，帶框A為啟動子第一個字母向調控區方向的 第570個堿基），其信息如下：
[0016] ggtaccgagctcttacgcgtTGCTGGGTTTGTAAGATTTGCTATGCAATTCCAAACCTAAATGAGGAGA AGAGGCGGCCCTGCATCCCAGAGCAAACAGAAACCAAGGTGAAAGGTAGGAGCCAGAATTTCTCATTTCAATAAAAC TMATAACCTGAGCTACT