一種酶及其編碼基因和它們的應用以及制備人參皂苷化合物k的方法
【專利摘要】本發明涉及生物領域，公開了一種酶及其編碼基因和它們的應用以及制備人參皂苷化合物K的方法。具體地，本發明提供了一種酶及其編碼基因，含有該基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，以及以該酶作為活性成分的組合物，及其在降解糖苷類化合物中的應用，并且提供了一種制備人參皂苷化合物K的方法。將本發明提供的酶用于降解三七葉總皂苷中的人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX時，其可能通過作用于人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX中C20位的木糖糖苷結構，同時也可將其C3位的葡萄糖水解下來，從而獲得人參皂苷CK，并且人參皂苷CK的轉化率在84％以上。
【專利說明】
-種酶及其編碼基因和它們的應用從及制備人參皂昔化合物 K的方法
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體地，設及一種酶及其編碼基因和它們的應用W及 一種制備人參皂巧化合物K的方法。
【背景技術】
[0002] 人參皂巧化合物K(人參皂巧Compound K，人參皂巧CK，結構式如下式I所示）是二 醇型人參皂巧（例如，人參皂巧肺3和絞股藍皂巧IX，結構式分別如下式II和ΙΠ 所示)在人 體腸道內的主要代謝產物，屬于稀有人參皂巧。研究發現人參皂巧CK在體內外都有良好的 抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，是一種潛在抗腫瘤藥物，并且在抗衰老、改善記憶、抗炎 等各方面都有一定的療效。因此，如何獲得大量的人參皂巧CK是目前藥學研究的重點。
[0005]
[0006] 目前，人參皂巧CK主要通過生物轉化法或生物合成法獲得。其中，生物轉化法是利 用有機體(細胞、細胞器)或酶作為催化劑實現化學轉化的過程，是生物體系(包括細菌、真 菌和植物組織等)對外源性底物進行結構修飾的化學反應。其本質是利用生物本身所產生 的酶對外源底物進行的催化反應。生物轉化具有反應條件溫和、不易破壞皂巧結構、副產物 少、后處理簡單及對環境友好等優點。近年來，W人參皂巧為原料進行生物轉化W獲得人參 皂巧CK的研究越來越多，特別是利用微生物或酶對二醇型人參皂巧的C3和C20位的糖巧結 構進行修飾，使含量較高的人參皂巧的糖巧經過水解作用，定向轉化為人參皂巧CK。根據構 成糖巧結構的糖基的不同，人參皂巧中常見的糖巧結構包括葡萄糖巧、木糖巧、乳糖巧、阿 拉伯糖巧等。但是，現有的用于人參皂巧生物轉化的酶大部分具有高度專一性，即僅可W特 異性作用于某一種糖巧結構，而無法滿足同時作用于一種W上糖巧結構的要求，從而導致 轉化率較低。因此，急需研發可W同時作用于一種W上糖巧結構的酶，W提高生成人參皂巧 CK的生物轉化率。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種新型的具有木糖巧酶和/或 葡萄糖巧酶雙功能的酶及其編碼基因和它們的應用W及制備人參皂巧化合物K的方法。
[0008] 為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種酶，其中，該酶為(a)或(b):
[0009] (a)由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成的酶；
[0010] (b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶 活性不變的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或簇 基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。
[0011] 第二方面，本發明提供了編碼第一方面所述酶的基因。
[0012] 第Ξ方面，本發明提供了含有第二方面所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞 系或重組菌。
[0013] 第四方面，本發明提供了一種組合物，其中，該組合物含有第一方面所述的酶作為 活性成分。
[0014] 第五方面，本發明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第Ξ方面所述 的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，W及第四方面所述的組合物中的任意一項在 降解糖巧類化合物中的應用。
[0015] 第六方面，本發明提供了一種制備人參皂巧化合物Κ的方法，該方法包括:在酶解 條件下，將含有糖巧類化合物的原料與酶接觸，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由 第四方面所述的組合物提供。
[0016] 通過上述技術方案，將本發明提供的酶用于降解人參皂巧肺3、絞股藍皂巧IX和Ξ 屯葉總皂巧時，其可能能夠作用于人參皂巧肺3和絞股藍皂巧IX中C20位的木糖糖巧結構， 同時也可將其C3位的兩個葡萄糖水解下來，從而獲得人參皂巧CK，并且人參皂巧CK的轉化 率在84% W上。
[0017] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0018] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0019] 圖1為本發明的實施例1獲得的重組質粒的雙酶切驗證結果，其中，1為DNA標記物， 2-5為重組質粒；
[0020] 圖2為本發明的實施例1獲得的重組酶SDS-PAGE電泳圖，其中，Μ為蛋白標記物，1為 粗酶液，2為純化的酶液；
[0021] 圖3為本發明的實施例1中酶活力測定的標準曲線圖；
[0022] 圖4為本發明的實施例2和3中經由實施例1獲得的酶液水解的人參皂巧肺3和絞股 藍皂巧IX反應結果的化C分析圖，其中，1為人參皂巧CK純品對照，2為人參皂巧肺3純品對 照，3為絞股藍皂巧IX純品對照，4為經實施例1獲得的酶液水解的人參皂巧肺3，5為經實施 例1獲得的酶液水解的絞股藍皂巧IX;
[0023] 圖5為本發明的實施例2中人參皂巧CK的HPLC色譜圖，其中，A為轉化前的結果，Β為 轉化后的結果；
[0024] 圖6為本發明的實施例3中人參皂巧CK的HPLC色譜圖，其中，A為轉化前的結果，B為 轉化后的結果；
[0025] 圖7為本發明的實施例4中人參皂巧CK的HPLC色譜圖，其中，A為轉化前的結果，B為 轉化后的結果。
【具體實施方式】
[0026] W下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0027] 在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，運些范圍或 值應當理解為包含接近運些范圍或值的值。對于數值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各 個范圍的端點值和單獨的點值之間，W及單獨的點值之間可W彼此組合而得到一個或多個 新的數值范圍，運些數值范圍應被視為在本文中具體公開。
[0028] 在本發明中，在未作相反說明的情況下，使用的術語"酶活力"的大小即酶含量的 多少，用酶活力單位化)表示，本發明中酶活力單位的定義是:在抑4.5和45°C的條件下，W 對硝基苯基-β-D-木糖巧為底物，每分鐘水解產生ΙμL?ο?對硝基苯酪的酶量為一個酶活力單 位。
[0029] 第一方面，本發明提供了一種酶，其中，該酶為(a)或(b):
[0030] (a)由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成的酶；
[0031] (b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶 活性不變的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或簇 基末端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。其中，酶活性不變是指在相同的測定條件下，由 (a)衍生的蛋白質的底物轉化率與(a)的底物轉化率之間的百分比（相對活性)不低于95% (或96%，或97%，或98%，或99%，或 100% )。
[0032] 組成蛋白質的20種氨基酸殘基，按照側鏈極性可W分成四類：1、非極性的氨基酸： 丙氨酸（Ala)、鄉氨酸（Val)、亮氨酸化eu)、異亮氨酸（lie)、甲硫氨酸（Met)、苯丙氨酸 (Phe)、色氨酸（Trp)和脯氨酸（Pro); 2、極性不帶電荷的氨基酸：甘氨酸（Gly)、絲氨酸 (Ser)、蘇氨酸(Thr)、半脫氨酸(切S)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酷胺(Gin)和酪氨酸(Tyr);3、帶 正電荷的氨基酸:精氨酸(Arg)、賴氨酸化ys)和組氨酸化is) ;4、帶負電荷的氨基酸:天冬氨 酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見"生物化學"（第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教 育出版社，1990年12月）。蛋白質中如果發生同屬一個類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取 代Lys或由Leu取代lie,所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用（比如提供正電荷或形成疏 水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質的立體結構并不會產生影響，因此仍然可W實 現蛋白的功能。所述同屬一個類別的氨基酸殘基取代可W發生在上述酶的任意一個氨基酸 殘基位置上。
[0033] 如前所述，本發明提供的酶還可W進行修飾或突變，得到衍生的蛋白質。本發明所 述"衍生的蛋白質"指與具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差異，也可W有不影 響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。運些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。所述 誘導變異體可W通過各種技術得到，如福射或誘變劑等產生的隨機突變，也可W通過如定 點突變法或其他已知分子生物學的技術。所述"衍生的蛋白質"還包括具有天然L型氨基酸 的殘基的類似物(如D型氨基酸），W及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、丫- 氨基酸等)的類似物。
[0034] 修飾(通常不改變一級結構，即不改變氨基酸序列）形式包括:體內或體外的蛋白 的化學衍生形式如乙酷化或簇基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或 進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白。運種修飾可W通過將蛋白暴露于進行糖 基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有憐酸化氨基 酸殘基(如憐酸酪氨酸，憐酸絲氨酸，憐酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋 白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。
[0035] 為了方便純化，還可W采用本領域常見的標簽對(a)進行添加修飾，舉例來說，（b) 可W通過在(a)的氨基末端和/或簇基末端連接下表1所示的標簽(如Poly-Arg、Poly-化S、 化AG、Strep-tag Π 和c-myc中的至少一種）而獲得。所述標簽不會影響本發明提供的酶的 活性，在實際應用過程中，可W根據需求選擇是否添加標簽。
[0036] 表1
[0037]
[0038] 上述酶可W通過人工合成得到，也可W先合成其編碼基因，再通過生物表達獲得。
[0039] 第二方面，本發明提供了編碼第一方面所述的酶的基因。相應地，所述基因可W為 如下的（1)或(2):
[0040] (1)核巧酸序列如SEQ ID ^:2所示的0臟分子；
[0041] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼的酶的酶活性不變的DNA分子。 其中，所述嚴格條件可W為:在6 X SCC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SCC， 0.1 % SDS和1 X SCC，0.1 % SDS各洗膜一次。酶活性不變是指在相同的測定條件下，由（2)編 碼的蛋白質的底物轉化率與（1)編碼的蛋白質的底物轉化率之間的百分比（相對活性)不低 于95% (或96%，或97%，或98%，或99%，或 100% )。
[0042] 本領域公知，組成蛋白質的20種不同的氨基酸中，除Met(ATG)或化p(TGG)分別為 單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉 港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989,見950頁附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡并性， 決定一個氨基酸的密碼子大多不止一個，Ξ聯體密碼子中第Ξ個核巧酸的置換，往往不會 改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核巧酸序列可W不同。本領域人員根據公 知的密碼子表，從本發明公開的氨基酸序列，W及由所述氨基酸序列得到的酶活性不變的 氨基酸序列，完全可W推導出能夠編碼它們的基因的核巧酸序列，通過生物學方法(如PCR 方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核巧酸序列，因此該部分核巧酸序列都應該包括 在本發明范圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可W通過本領域公知的方法，例如 Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過 修改本發明提供的核酸序列，得到與本發明所述酶的活性一致的氨基酸序列。
[0043] 優選地，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0044] 如上所述，相應地，核巧酸序列的5'端和/或3'端還可W連接有上表1所示的標簽 的編碼序列。
[0045] 本發明提供的核巧酸序列通常可W用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法、重組法、或人 工合成的方法獲得。例如，本領域技術人員根據本發明所提供的核巧酸序列，可W很容易得 到模板和引物，利用PCR進行擴增獲得有關序列。
[0046] -旦獲得了有關核巧酸序列，就可W用重組法大批量的獲得有關氨基酸序列。通 常將所得核巧酸序列克隆入載體，再轉入基因工程菌中，然后通過常規的方法從增殖后的 宿主細胞分離得到有關核巧酸序列。
[0047] 此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關核巧酸序列。
[0048] 第Ξ方面，本發明還提供了含有第二方面所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細 胞系或重組菌。
[0049] 在本發明中，所述重組載體可W含有本發明提供的基因。重組載體中使用的"載 體"可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒、粘粒、隧菌體及反轉錄病毒等，本發 明優選pPICZoA質粒。重組載體的構建可采用能夠在載體多克隆位點具有切割位點的各種 核酸內切酶(如對于pUC18,可用Sal I、BamH I、EcoR I等;對于pPICZoA，可用Nde I、Mie I、 EcoRI、BamH、化ndm等)進行酶切獲得線性質粒，與采用相同核酸內切酶切割的基因片段連 接，獲得重組質粒。本發明優選采用EcoR I和Xba I雙酶切pPICZoA及與其連接的基因片段， 經連接酶連接，構建得到重組載體。
[0050] 在本發明中，所述表達盒可W通過將本領域常用的報道基因與本發明所述基因相 連獲得。優選地，所述表達盒還包括啟動子和/或增強子。
[0051] 在本發明中，所述轉基因細胞系可W為含有本發明的重組載體的細胞，例如，可W 通過將本發明的重組載體轉入細胞中獲得。
[0052] 本發明提供的重組菌可W含有本發明提供的重組載體。本發明提供的酶還可W通 過W下方法制得:培養本發明提供的重組菌，誘導編碼所述酶的基因的表達;分離提純所表 達的酶。
[0053] 在本發明中，可W通過本領域常規的方法將所述重組載體轉化、轉導或者轉染到 宿主細胞(菌株）中W獲得重組菌，如氯化巧法化學轉化、高壓電擊轉化，優選電擊轉化。所 述宿主細胞可W為原核細胞或真核細胞，優選為酵母，更優選為畢赤酵母。
[0054] 第四方面，本發明提供了一種組合物，其中，該組合物含有第一方面所述的酶作為 活性成分。
[0055] 在本發明中，W所述組合物的總重量為基準，所述酶的含量為10-90重量％。優選 地，所述組合物中還可W含有本領域技術人員公知的溶劑(如甘油、糖類和蛋白酶抑制劑等 蛋白保護劑）、激動劑等。
[0056] 第五方面，本發明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第Ξ方面所述 的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，W及第四方面所述的組合物中的任意一項在 降解糖巧類化合物中的應用。
[0057] 在本發明中，所述降解的過程可W是使糖巧類化合物中的糖巧鍵發生水解而斷裂 的過程。
[0058] 在本發明中，優選情況下，所述糖巧類化合物選自含有β-木糖殘基的化合物和/或 含有葡萄糖殘基的化合物。更優選地，所述糖巧類化合物為人參皂巧類化合物，進一步優選 為二醇型人參皂巧，最優選為人參皂巧肺3和/或絞股藍皂巧IX。
[0059] 第六方面，本發明提供了一種制備人參皂巧化合物Κ的方法，該方法包括:在酶解 條件下，將含有糖巧類化合物的原料與酶接觸，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由 第四方面所述的組合物提供。
[0060] 在本發明中，W所述原料的總重量為基準，所述酶的用量可W為1-lOU/mg，優選為 1-抓/mg。
[0061] 在本發明中，所述酶解條件可W包括:酶解的溫度為40-70°C，pH值為3-7,酶解的 時間為10-6化;優選為，酶解的溫度為40-50°C，pH值為4.5-5.5，酶解的時間為20-5化。
[0062] 在本發明中，所述糖巧類化合物可W為含有β-木糖殘基的化合物和/或含有葡萄 糖殘基的化合物，優選為人參皂巧類化合物，更優選為二醇型人參皂巧，最優選為人參皂巧 肺3和/或絞股藍皂巧IX。
[0063] 在本發明中，所述含有糖巧類化合物的原料可W由人參、西洋參和Ξ屯中的至少 一種提供。
[0064] W下將通過實施例對本發明進行詳細描述。W下實施例中，人參皂巧CK的轉化率 =轉化產物中CK的實際質量^原料轉化為CK的理論質量X 100%。
[00化]實施例1
[0066] 本實施例用于說明本發明提供的酶的制備。
[0067] (1)基因的獲得
[0068] 根據SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列通過人工化學合成法(委托昆明碩擎生物科 技有限公司)獲得相應的基因。
[0069] (2)表達載體和重組菌株的構建
[0070] 對由步驟(1)獲得的基因 W及畢赤酵母表達載體pPICZoA(購于美國Invitrogen公 司）均進行EcoR I和Xba I雙酶切，然后使用T4連接酶(購于寶生物工程(大連)有限公司）將 上述兩個經酶切后的產物連接，獲得重組質粒，該重組質粒的雙酶切驗證結果如圖1所示， 其中，1為DNA標記物，2-5為重組質粒。
[0071] 將獲得的重組質粒轉化畢赤酵母GS115(購自美國Invi化ogen，貨號為C18100)獲 得重組酵母。
[0072] (3)酶的制備
[0073] 將得到的重組酵母接種于培養基BMGY(將lOg酵母提取物、20g蛋白腺溶解到700mL dd出0中，121°C下滅菌20min。待冷卻至室溫后加入Imol/L憐酸鐘緩沖液(pH 6)100血，10 X YNB 100血、10XG 100血、500XB 2mL，混勻，4°C保存）中，28°C培養2-3d至ODsqqA值在2-6之 間，離屯、收集菌體用BMMY培養基(將lOg酵母提取物、20g蛋白腺溶解到700mL d地2〇中，121 °C下滅菌20min。待冷卻至室溫后加入Imol/L憐酸鐘緩沖液(pH 6)100mL，10XYNB lOOmL、 10 XΜ 1 OOmL、500 X B 2mL，混勻，4°C保存)稀釋至ODsooA = 1.0，在30°C繼續培養，每隔24h添 加0.5%甲醇誘導培養7d，離屯、收集上清，獲得粗酶液。
[0074] 將粗酶液置于冰上，緩慢加入磨碎的硫酸錠粉末，邊加邊攬拌，添加到硫酸錠飽和 為止。在4°C靜置2地左右，12000r/min離屯、50min，棄上清，用少量PBS溶解沉淀。將PBS溶解 的沉淀透析，除去硫酸錠，重懸于含lOmM咪挫的PBS緩沖液中。根據表達出的重組酶含有化S 標簽，利用Ni柱進行親和層析純化:憐酸緩沖液(pH 7.4，50mM化C1，含lOmM咪挫），ImL/min 平衡Ni柱后，W流量0.5mL/min直接將重懸的粗酶液上樣;繼續使用含lOmM咪挫的憐酸緩沖 液ImL/min洗脫未吸附或吸附的非特異性雜蛋白；W憐酸緩沖液(pH 7.4,50mM NaCl，500mM 咪挫)洗脫收集目的蛋白，W獲得純化的酶液。純化的酶液用10%SDS蛋白凝膠電泳檢測，結 果如圖2所示，其中，Μ為蛋白標記物，1為粗酶液，2為純化的酶液。
[0075] (4)酶活力測定
[0076] 分別吸取0.1 mmol/L ρΝΡ溶液（對硝基苯酪，配制方法：準確稱取對硝基苯酪 13.9mg，用蒸饋水定容至 1 OOOmL) 0.1血、0.5mL、ImL、1.5mL、2. OmL、2.5mL至 1 OmL容量瓶中， 用2mol/L碳酸鋼溶液(配制方法:稱取碳酸鋼211.98g，定容至lOOOmL)定容后混勻。W蒸饋 水作為空白，于405nm處比色，測定其吸光值，W對硝基酪濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標， 繪制標準曲線，如圖3所示。
[0077] 將10化上述純化的酶液和90化0.2mol/L憐酸氨二鋼-0.1mol/L巧樣酸緩沖液于 45°C水浴鍋平衡5min，加入平衡后的5mmol/L的pNPX 10化L(4-硝基苯基β-D-化喃木糖巧溶 液:準確稱取pNPX 0.1356g，溶于lOOmLO. 2mol/L憐酸氨二鋼-0.1mol/L巧樣酸緩沖液），反 應lOmin后，加入10化L2mol/L碳酸鋼溶液終止反應，測定405nm處的吸收值。經測定，純化的 酶液的活力為抓/mL。
[007引實施例2
[0079] 本實施例用于說明本發明提供的酶在制備人參皂巧CK中的應用。
[0080] 取2mL由實施例1獲得的純化的酶液，加入人參皂巧肺3純品（云南與諾生物工程有 限責任公司參照文獻(李海舟，張穎君，楊崇仁.Ξ屯葉化學成分的進一步研究.天然產物研 究與開發，2006,18(4) :549-554)報道的方法從Ξ屯葉總皂巧中分離和純化;含量:HPLC> 99%;分子量、iH及1? NMR的化學位移值與該文獻報道的一致），使其終濃度為l.Omg/mL，于 45°C且pH為4.5條件下酶解4她，取處理好的樣品進行化C分析，酶液能水解人參皂巧肺3為 人參皂巧CK(如圖4中1、2和4所示，其中，1為人參皂巧CK純品對照（購于上海源葉生物科技 有限公司），2為人參皂巧肺3純品對照，4為經實施例1獲得的酶液水解的人參皂巧肺3)。取處 理好的樣品20化進高效液相色譜檢測人參皂巧CK的生成量，檢測方法為:采用漢邦C1細PLC 分析柱進行定量檢測分析，分析流動相為甲醇:水=92:8;流動相流速為1. OmL/min;檢測時 柱溫為3(TC;檢測波長203nm，檢測結果如圖5所示，其中，A為轉化前的結果，B為轉化后的結 果。
[0081 ] 結果表明，人參皂巧CK的轉化率為95.41 %。
[0082] 實施例3
[0083] 本實施例用于說明本發明提供的酶在制備人參皂巧CK中的應用。
[0084] 取2血由實施例1獲得的純化的酶液，加入絞股藍皂巧IX(Gypenoside IX，Gyp IX) 純品（云南與諾生物工程有限責任公司參照文獻(李海舟，張穎君，楊崇仁.Ξ屯葉化學成分 的進一步研究.天然產物研究與開發，2006,18(4):549-554)報道的方法從Ξ屯葉總皂巧中 分離和純化;含量:HPLC>99%;分子量、iH及1? NMR的化學位移值與該文獻報道的一致）， 使其終濃度為l.Omg/mL，于45°C且pH為4.5條件下酶解4她，取處理好的樣品進行化(：分析， 酶液能水解絞股藍皂巧IX為人參皂巧CK(如圖4中1、3和5所示，其中，1為人參皂巧CK純品對 照，3為絞股藍皂巧IX純品對照，5為經實施例1獲得的酶液水解的絞股藍皂巧IX)。取處理好 的樣品20化進高效液相色譜檢測人參皂巧CK的生成量，檢測方法同實施例2,檢測結果如圖 6所示，其中，A為轉化前的結果，B為轉化后的結果。
[00化]結果表明，人參皂巧CK的轉化率為98.32%。
[00化]實施例4
[0087]本實施例用于說明本發明提供的酶在制備人參皂巧CK中的應用。
[008引取2mL由實施例1獲得純化的酶液，加入立屯葉總皂巧(購于昆明植物藥業公司，人 參皂巧肺3含量為16.7重量％，絞股藍皂巧IX含量為7.6重量％)，使其終濃度為6.Omg/mL， 于45°C且pH為4.5條件下酶解4她。酶解后的樣品進行減壓蒸干，用2mL甲醇溶解。取處理好 甲醇溶解樣品20化進高效液相色譜檢測人參皂巧CK的生成量，檢測方法同實施例2,檢測結 果如圖7所示，其中，A為轉化前的結果，B為轉化后的結果。
[0089] 結果表明，W人參皂巧肺3和絞股藍皂巧IX的總含量計，人參皂巧CK的轉化率為 84.41%。
[0090] W上實施例的結果表明，將本發明提供的酶用于降解人參皂巧肺3、絞股藍皂巧IX 和Ξ屯葉總皂巧時，其可能能夠作用于人參皂巧肺3和絞股藍皂巧IX中C20位的木糖糖巧結 構，同時也可將其C3位的兩個葡萄糖水解下來，從而獲得人參皂巧CK，并且人參皂巧CK的轉 化率在84% W上。
[0091] W上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中 的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可W對本發明的技術方案進行多種簡單變型，運 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0092] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛 盾的情況下，可W通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0093] 此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可W進行任意組合，只要其不違背本 發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【主權項】
1. 一種酶，其特征在于，該酶為(a)或(b): (a) 由SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列組成的酶； (b) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且酶活性 不變的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末 端連接有標簽的氨基酸序列組成的酶。2. 編碼權利要求1所述的酶的基因。3. 根據權利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID N0:2所示。4. 含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5. -種組合物，其特征在于，該組合物含有權利要求1所述的酶作為活性成分。6. 權利要求1所述的酶、權利要求2或3所述的基因、權利要求4所述的重組載體、表達 盒、轉基因細胞系或重組菌，以及權利要求5所述的組合物中的任意一項在降解糖苷類化合 物中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其中，所述糖苷類化合物選自含有β-木糖殘基的化合物 和/或含有葡萄糖殘基的化合物，優選為二醇型人參皂苷。8. -種制備人參皂苷化合物Κ的方法，該方法包括:在酶解條件下，將含有糖苷類化合 物的原料與酶接觸，其特征在于，所述酶由權利要求1所述的酶和/或權利要求5所述的組合 物提供。9. 根據權利要求8所述的方法，其中，以所述原料的總重量為基準，所述酶的用量為1-101]/11^;所述酶解條件包括 :酶解的溫度為40-70°(：，？!1值為3-7，酶解的時間為10-6011。10. 根據權利要求8或9所述的方法，其中，所述糖苷類化合物選自含有β-木糖殘基的化 合物和/或含有葡萄糖殘基的化合物，優選為二醇型人參皂苷。
【文檔編號】C12R1/84GK106011106SQ201610440705
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月20日
【發明人】韓秀林, 李銘剛, 趙江源, 黃開心, 楊勝江, 馬鳳靈, 包崇卯, 林婷婷, 張孝龍, 文孟良, 艾黎
【申請人】云南與諾生物工程有限責任公司