一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟：（1）Hb粉制備；（2）黑曲霉種子液的制備；（3）血紅蛋白Hb多肽的制備：將黑曲霉種子液接種入含有Hb粉的發酵培養基中進行發酵，在發酵過程中加入表面活性劑，混勻后繼續發酵至發酵結束，再經后續處理得Hb多肽。該方法以雞血血紅蛋白（Hb）為發酵底物，通過添加食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽的得率，使雞血能回收利用，環保，且提高了黑曲霉的利用率，提高了Hb多肽得率，降低了成本。
【專利說明】
一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法
技術領域
[0001]本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法。
【背景技術】
[0002]根據美國農業部統計，2014年全球雞肉產量在8529.2萬噸左右。中國雞肉的年產量位居世界第二，年產1270萬噸。大量活雞宰殺的同時會產生大量的副產物——雞血，由于雞血血腥味大、色澤鮮艷、適口性差、難消化等特點，加上雞血收集難、不容易儲存等原因，導致其大部分作為廢棄物排放，不僅浪費了寶貴的資源，還對環境造成污染。雞血是一種有益于人體的功能性食品，營養價值高，含大量的蛋白質和豐富的氨基酸以及微量元素、維生素、酶類和其他一些生物活性物質。其蛋白質主要是Hb，占全血蛋白質65%以上。近年來許多研究者利用生物酶水解Hb(血紅蛋白)從中分離出ACE抑制肽、抗氧化肽、抗菌肽等生物活性肽，無疑為Hb的高值化利用提供廣闊的前景。
[0003]目前，將Hb轉化為小分子多肽的方法主要有化學法、酶解法以及微生物降解法。化學法水解程度不易控制、副反應多、營養破壞嚴重等原因，已很少應用于生產Hb多肽。近年來，大部分研究利用生物酶水解Hb獲取Hb多肽，但是利用生物酶法降解率低、成本高。而用微生物降解因其投入低、操作簡單、降解效果好，為制備Hb多肽提供一個好的研究方向。
[0004]黑曲霉是公認的食品安全菌株，能產生多種蛋白酶，尤其是酸性蛋白酶和中性蛋白酶。利用黑曲霉降解血紅蛋白(Hb)，可以省去大量的成本和酶的費用，提高Hb多肽的得率，對于獲取功能性多肽生產具有重要的意義，但目前尚未有人進行這個方面的研究。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，該方法以雞血血紅蛋白(Hb)為發酵底物，通過添加食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽的得率，使雞血能回收利用，環保，且提高了黑曲霉的利用率，提高了 Hb多肽得率，降低了成本。
[0006]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
(I )Hb粉制備:選取雞血，離心后棄上清液，得下層沉淀，將下層沉淀洗滌后，再經破壁處理，靜置后離心，取上清液干燥后得Hb粉；
(2)黑曲霉種子液的制備:選取黑曲霉，經活化、斜面培養后得黑曲霉孢子懸液，將黑曲霉孢子懸液接種到種子培養基中培養后，制得黑曲霉種子液；
(3)血紅蛋白Hb多肽的制備:將黑曲霉種子液接種入含有Hb粉的發酵培養基中進行發酵，在發酵過程中加入表面活性劑，混勻后繼續發酵至發酵結束，再經后續處理得Hb多肽。
[0007]在上述利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法中:步驟(I)中在雞血中還添加有檸檬酸鈉，其添加量優選為IL雞血中添加有5?8g檸檬酸鈉。
[0008]步驟(I)中離心后棄上清液時，離心優選在4°C、轉速為10000?12000r/min條件下離心15?20min。
[0009]對轉速做單因素實驗結果表面，低轉速離心不干凈，高轉速雜質太多，因此離心時，優選在40C、轉速為10000?12000r/min條件下離心15?20min。
[0010]步驟(I)中將下層沉淀洗滌時優選采用等體積生理鹽水洗滌，破壁處理優選為在洗滌后下層沉淀中加入超純水在超聲波中溶脹破壁10?15min，超聲波功率優選為3000W。[0011 ] 靜置后離心時，離心優選在4°C、轉速為5500?6500r/min條件下離心15?20min。
[0012]步驟(2)中選取黑曲霉，經活化、斜面培養5天后得黑曲霉孢子懸液;將黑曲霉孢子懸液接種到種子培養基中培養18?22h后，最好是培養20h，制得黑曲霉種子液。
[0013]選取黑曲霉，經活化、斜面培養5天后即可長出大量孢子，具有很強的活力，無需多培養，以防孢子變老影響活力。
[0014]將黑曲霉孢子懸液接種到種子培養基中培養20h后，以剛剛進入生長期為對數期的菌絲球為小米粒狀的黑曲霉種子液為佳。
[0015]步驟(2)中斜面培養時斜面培養基為麥芽汁瓊脂培養基，IL種子培養基的主要成分優選為鹿糖10 g、蛋白胨5 g、酵母膏5 g、KH2P04 I g、NaCl lg，pH調至6。
[0016]步驟(3)中將黑曲霉種子液接種入含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基中進行發酵時，接種量優選占含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基總體積的8?10%。最好是9%。
[0017]步驟(3)中IL發酵培養基的主要成分優選包括蔗糖20.0g、Hb粉8 g,MgSO4 0.4g^ZnSO4 0.005 g^KH2PO4 2 g^NaCl 5g、FeS〇4 0.001 g^MnSO4 0.005 g、VBi 0.001 g， pH調至6.0，最后在121 °C、0.IMPa下滅菌20min。
[0018]步驟(3)中將黑曲霉種子液接種入含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基中進行發酵，發酵時間優選為36?48h。
[0019]步驟(3)中所述的表面活性劑為食品級表面活性劑，所述的食品級表面活性劑是體積百分含量為50%的十二烷基葡萄糖苷溶液，其在發酵體系中的濃度為6?8g/L。
[0020]在發酵過程中加入表面活性劑，可以是種子液加入到發酵培養基培養36?48h這一期間的任何時間點加入。
[0021]步驟(3)中混勻后繼續發酵12?18h至發酵結束，最好是16h，發酵溫度優選為30°C，搖床轉速優選為120?180 rpm，最好是150rpm。
[0022]步驟(3)中所述后續處理優選包括過濾、離心取上清液，再采用TCA溶液除去發酵液中的蛋白質。
[0023]本發明方法主要以血紅蛋白Hb為底物輔以其他的碳源、無機鹽等作為發酵培養基，通過黑曲霉(AspergiIIus niger)發酵過程中添加食品級表面活性劑提高血紅蛋白Hb降解效率的生物轉化工藝。該工藝過程操作簡單、成本低，不需要添加酶，且蛋白降解效果好，有效的抑制微生物吸收多肽產物，不僅節約了成本，而且極大程度上提高了酶的生產效率及利用率，使多肽的得率高達0.638 mg.N/mL，具有經濟可行性，而且可以廢物利用，解決Hb轉化效率低以及雞血造成的環境污染問題。
[0024]本發明的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法可廣泛應用于微生物轉化Hb制備小分子肽中。
[0025]本發明的機理為:本發明將雞血中的血紅蛋白提取出來，血紅蛋白的含量高達90%以上，有利于產酶微生物的降解獲取Hb多肽，但是Hb利用率較低和Hb多肽的得率低，通過添加食品級表面活性劑能夠有效促進Hb水解和抑制微生物的生長提高Hb多肽的得率。利用該工藝以Hb為底物結合食品級表面活性劑，不僅很大程度上提升了底物的利用率以及節省了原材料的費用，而且極大程度上提高了酶的生產效率及利用率，具有經濟可行性的特點，而且可以變廢為寶，解決Hb降解率低和Hb得率低以及雞血對環境污染問題，具有極大的示范和推廣作用。
[0026]相對于現有技術，本發明具有如下優點:
(1)本發明方法中所用的發酵原料是目前利用較少的大部分當作廢棄物處理的雞血，經處理獲取血紅蛋白Hb粉，它由四個亞基組成蛋白質四級結構，每個亞基由一條α-鏈或一條β-鏈和血紅素組成，α-鏈由141個氨基酸組成，β-鏈由146個氨基酸組成，經高溫后解聚成四個單獨的亞基，有利于產酶微生物的直接水解獲取小分子多肽；
(2)本發明方法選用的黑曲霉是安全性菌株，遺傳背景清晰，是重要的工業發酵微生物，在工業酶制劑方面應用廣泛，可生產酸性蛋白酶等30多種酶制劑，此外，黑曲霉具有強大的聚合物降解酶系，能在極低的PH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能適應工業發酵中粗放的物料和理化環境；
(3)本發明方法通過優化黑曲霉的發酵工藝節省了成本、簡化操作，縮短了發酵時間，提高了底物的利用率和Hb多肽的得率，可以有效降低投資費用和生產成本；
(4)本發明方法利用表面活性劑的疏水作用可以有效減少水解酶對Hb的非生產性吸附，通過低濃度的添加能夠抑制黑曲霉的生長以及促進酶的合成和提高酶解效率，進而提高底物利用率，從而提高生產效率并降低成本，同時對Hb多肽的得率無顯著影響。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發明實施例1-9中利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法流程圖；
圖2是實施例1-9的對照未添加表面活性劑時發酵過程中Hb多肽得率以及酶活力的變化；
圖3是實施例1-9發酵36?48h后添加表面活性劑的量為6?8g/L繼續發酵時不同的取樣時間中Hb多肽得率以及酶活力的變化。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例僅用于闡述本發明，并不限制本發明的保護范圍。本技術領域的普通技術人員依據以上公開的范圍，均可實現本發明的目的。
[0029]實施例1
如圖1中所示，本實例提供的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
(I)Hb粉的制備:在接收新鮮雞血的儲存罐中添加檸檬酸鈉5g/L(進行抗凝處理)，采集后置4°C、12000r/min離心15min，棄上清液，得到下層沉淀加等體積的生理鹽水洗滌2次，再加等體積的超純水在超聲波儀(功率為3000W)中溶脹破壁lOmin，放置lOmin，然后在4°C、6000r/min離心15min，棄沉淀獲得Hb上清液，真空冷凍干燥得到Hb粉；
(2)黑曲霉種子液的制備:選取黑曲霉(中國普通微生物菌種保藏中心、廣東省微生物菌種保藏中心、中國工業微生物菌種保藏中心或者其它商業機構出售的均可)，經活化后，接種在斜面上，培養5d，制備孢子懸液，用血球計數板記錄每毫升中孢子的數量，再加入到種子培養基中培養20h;
(3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入發酵培養基中發酵36h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為6g/L，震蕩混勻繼續發酵16h，在搖床轉速150rpm，溫度30 °C條件下培養。
[0030]在上述步驟(2)~(3)中斜面、種子培養基、發酵培養基的制備以及滅菌如下:
斜面培養基指麥芽汁瓊脂培養基；
IL種子培養基的主要成分包括:蔗糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g,KH2PO4 I g，NaCllg，pH 調至 6;
IL發酵培養基的主要成分包括:蔗糖20.0 g，Hb粉8 g,MgSO4 0.4 g,ZnSO4 0.005 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5g,FeSO4 0.001 g, MnSO4 0.005 g，VBl 0.001 g，pH 調至6.0，最后在121 °C、0.IMPa下滅菌 20min。
[0031 ] (4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.638mg.N/mLο
[0032]實施例2
如圖1中所示，本實例提供利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
(1)Hb粉的制備:在接收新鮮雞血的儲存罐中添加檸檬酸鈉5g/L，采集后置4°C、12000r/min離心15min，棄上清液，得到下層沉淀加等體積的生理鹽水洗滌2次，再加等體積的超純水在超聲波儀中溶脹破壁lOmin，放置lOmin。然后在4°C、6000r/min離心15min，棄沉淀獲得Hb上清液，真空冷凍干燥得到Hb粉；
(2)黑曲霉種子液的制備:選取黑曲霉(中國普通微生物菌種保藏中心、廣東省微生物菌種保藏中心、中國工業微生物菌種保藏中心或者其它商業機構出售的均可)，經活化后，接種在斜面上，培養5d，制備孢子懸液，用血球計數板記錄每毫升中孢子的數量，再加入到種子培養基中培養20h;
(3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵36h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為7g/L，震蕩混勻繼續發酵16h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0033]在上述步驟(2)~(3)中斜面、種子培養基、發酵培養基的制備以及滅菌如下:
斜面培養基指麥芽汁瓊脂培養基；
IL種子培養基的主要成分包括:蔗糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g,KH2PO4 I g，NaCllg，pH 調至 6; IL發酵培養基的主要成分包括:蔗糖20.0 g，Hb粉8 g,MgSO4 0.4 g,ZnSO4 0.005 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5g,FeSO4 0.001 g, MnSO4 0.005 g，VBl 0.001 g，pH 調至6.0，最后在121 °C、0.IMPa下滅菌 20min。
[0034](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.652mg.N/mLο
[0035]實施例3
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0036](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵36h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為8g/L，震蕩混勾繼續發酵16h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0037]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0038](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.663mg.N/mLο
[0039]實施例4
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0040](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵40h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為6g/L，震蕩混勾繼續發酵12h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0041]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0042](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.658mg.N/mLο
[0043]實施例5
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0044](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵40h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為7g/L，震蕩混勻繼續發酵18h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0045]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0046](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.647mg.N/mLο
[0047]實施例6
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0048](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵40h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為8g/L，震蕩混勾繼續發酵18h，在搖床轉速180rpm，溫度30°C條件下培養。
[0049]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0050](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.641mg.N/mL。
[0051 ] 實施例7
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0052](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以8%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵48h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為6g/L，震蕩混勾繼續發酵16h，在搖床轉速120rpm，溫度30°C條件下培養。
[0053]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0054](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.655mg.N/mLο
[0055]實施例8
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0056](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以9%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵44h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為6g/L，震蕩混勾繼續發酵16h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0057]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0058](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.642mg.N/mLο
[0059]實施例9
如圖1中所示，本實例提供的利用食品級表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，包括以下步驟:
步驟(I)?(2)同實施例1。
[0060](3)食品級表面活性劑的添加:將制備好的種子液以10%(v/v)的接種量加入上述發酵培養基中發酵48h，用移液槍把放置在超凈臺紫外滅菌30min的50%的十二烷基葡萄糖苷添加到發酵培養基，其最終濃度為6g/L，震蕩混勾繼續發酵16h，在搖床轉速150rpm，溫度30°C條件下培養。
[0061]斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。
[0062](4)Hb多肽得率檢測:發酵結束后過濾離心得發酵上清液，用15%的TCA溶液除去發酵液中的蛋白質即為非蛋白氮溶液，通過凱氏定氮儀測量的數值即為Hb多肽的含量，其值為0.671mg.N/mLο
[0063]根據實施例1-9中的發酵36?48h后添加表面活性劑的量為6?8g/L繼續發酵12?18h的Hb多肽得率以及酶活力的變化繪圖，如圖3中所示，同時進行未添加表面活性劑的對照發酵3d試驗，如圖2中所示，圖2和圖3中的對照結果表明，在發酵過程中加入6?8g/L表面活性劑的Hb多肽得率比未添加表面活性劑的Hb多肽得率，顯著增加。
[0064]圖2中結果表明，隨發酵時間的延長，氨基氮、非蛋白氮以及可溶性氮的呈現升高的趨勢，但是非蛋白氮含量增加緩慢。這是因為發酵3d時，黑曲霉生長旺盛，酶系代謝活躍，Hb水解度高，由于黑曲霉自身生長的需要，會吸收利用一些的水解產物，因此Hb多肽的得率不高。隨著發酵的低4?6d，Hb繼續降解，發酵環境的改變，水解度降低，因此非蛋白氮沒有明顯的增加。值得注意的是，發酵后期非蛋白氮含量異常增加，這可能因為生長環境的惡化，營養匱乏導致菌體死亡溶解，釋放菌體自身的含氮物質，但是發酵后期產生的含氮類的物質不是本發明的目標產物Hb多肽。
[0065]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是包括以下步驟: (1)Hb粉制備:選取雞血，離心后棄上清液，得下層沉淀，將下層沉淀洗滌后，再經破壁處理，靜置后離心，取上清液干燥后得Hb粉； (2)黑曲霉種子液的制備:選取黑曲霉，經活化、斜面培養后得黑曲霉孢子懸液，將黑曲霉孢子懸液接種到種子培養基中培養后，制得黑曲霉種子液； (3)血紅蛋白Hb多肽的制備:將黑曲霉種子液接種入含有Hb粉的發酵培養基中進行發酵，在發酵過程中加入表面活性劑，混勻后繼續發酵至發酵結束，再經后續處理得Hb多肽。2.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(I)中在雞血中還添加有檸檬酸鈉，其添加量為IL雞血中添加有5?8g檸檬酸鈉。3.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(2)中選取黑曲霉，經活化、斜面培養5天后得黑曲霉孢子懸液;將黑曲霉孢子懸液接種到種子培養基中培養18?22h后，制得黑曲霉種子液。4.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(2)中斜面培養時斜面培養基為麥芽汁瓊脂培養基，IL種子培養基的主要成分為鹿糖10 g、蛋白胨5 g、酵母膏5 g、KH2P04 I g、NaCl lg，pH調至6。5.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中將黑曲霉種子液接種入含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基中進行發酵時，接種量占含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基總體積的8?10%。6.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中IL發酵培養基的主要成分包括蔗糖20.0 g、Hb粉8 g,MgSO4 0.4g^ZnSO4 0.005 g^KH2PO4 2 g^NaCl 5g、FeS〇4 0.001 g^MnSO4 0.005 g、VBi 0.001 g， pH調至6.0，最后在121 °C、0.IMPa下滅菌20min。7.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中將黑曲霉種子液接種入含有血紅蛋白Hb粉的發酵培養基中進行發酵，發酵時間為36?48h。8.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中所述的表面活性劑為食品級表面活性劑，所述的食品級表面活性劑是體積百分含量為50%的十二烷基葡萄糖苷溶液，其在發酵體系中的濃度為6?8g/L。9.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中混勻后繼續發酵12?18h至發酵結束，發酵溫度為30°C，搖床轉速為120?180 rpm010.根據權利要求1所述的利用表面活性劑提高黑曲霉降解血紅蛋白制備Hb多肽得率的方法，其特征是:步驟(3)中所述后續處理包括過濾、離心取上清液，再采用TCA溶液除去發酵液中的蛋白質。
【文檔編號】C12R1/685GK105861606SQ201610332132
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】劉學銘, 張炫, 程鏡蓉, 陳智毅, 張友勝, 張業輝
【申請人】廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所