一種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其構建方法

一種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其構建方法
【專利摘要】本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其制備與應用。本發明首先通過質粒表達的方法解決了枯草芽孢桿菌A164轉化效率低的問題，然后通過誘導轉化的方法將含有comk表達框的線性片段整合到A164基因組上，借助cre/lox特異重組系統消除抗性，得到了不含抗性標記的、易于操作的、高轉化效率和高分泌能力的枯草芽孢桿菌A164S。本發明的枯草芽孢桿菌A164S，研究結果表明，其轉化效率為A164的1000倍以上；A164S能有效攝取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的重組表達方面有著較大的應用潛力。
【專利說明】
一種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其構建方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其制備與 應用。
【背景技術】
[0002] 枯草芽孢桿菌被認定為是一般安全(GRAS，Generally Recognized as Safe)的生 物，因其無致熱源、高分泌、易培養，其產物可直接用于人們的日常使用等優點，成為工業多 肽類產品、藥劑和酶制劑分泌表達的首選。枯草芽孢桿菌A164(ATCC 6051a)相比于模式菌 株A168,其生長特性、分泌能力等生化特征非常優異，是發酵工業生產菌構建的理想出發菌 株。但是A164由于DNA轉化效率極抵，基因操作困難，使得A164工程菌改造的工作限制大，影 響了其在工業生產應用的前景。
[0003] 枯草芽孢桿菌的攝取外源DNA的能力，即感受態效率受到信號轉導網絡嚴密的調 控。感受態轉錄因子Comk在其中扮演著重要的作用，Comk的編碼基因 comk的表達也在轉錄 和轉錄后水平上受到嚴格調控。comk的表達受到至少三個轉錄因子，包括AbrB、Rok(Ykuw) 和CodY的抑制，同時也受到DeqSu雙組分調控系統及Comk本身的正向調控。因此，提高枯草 芽孢桿菌的感受態效率，可以從兩個方面著手，其一是敲除comk基因的抑制因子，其二就是 過表達Comk正向調控因子。事實證明，這兩種方式均切實可行，通過失活Rok的編碼基因 rok，可以使枯草芽孢桿菌BD630的轉化效率提高5倍;而通過將含有木糖啟動子xylA的comk 基因導入枯草芽孢桿菌1A751，得到的枯草芽孢桿菌1A976對DNA的轉化效率可以提高1000 倍。
[0004] 另一方面，經基因工程改造的微生物通常含有抗生素基因以用于遺傳操作篩選， 但用于多肽、工業酶生產的領域對抗生素的添加及抗生素基因的存在十分敏感，因此，一般 要求生產菌株不含抗生素基因。因此，在對枯草芽孢桿菌進行分子改造時，通常會使用反向 篩選標記，利用細胞自身的同源重組系統將抗性基因敲除，但這種方式下的重組效率不高， 菌株二次篩選時的工作量比較大，也比較耗時；因此近年來多利用位點特異性重組系統，比 如cre/lox系統，通過外源重組酶的催化，大大提高重組效率，使得基因無痕敲除/敲入的操 作省時高效。
[0005] 但是即使是利用現代的遺傳操作工具，雖然它們對枯草芽孢桿菌A168、1A976等模 式菌株十分有效，但是對于有生產應用前景的A164而言，依舊十分困難，因為A164的轉化效 率極低，幾乎不接受外源DNA的轉化。同時，為了保證外源基因在枯草芽孢桿菌的遺傳穩定 性，會通過同源重組整合到宿主的染色體中，利用線性DNA往往可以一次性完成這種分子改 造，但對于A164而言，這種由線性DNA介導的分子改造工作十分困難，耗時耗力。

【發明內容】

[0006] 為了克服目前野生型枯草芽孢桿菌轉化效率低的問題，本發明的目的在于提供一 種高轉化率的枯草芽孢桿菌及其制備與應用。
[0007] 為了實現上述目的以及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] 本發明的第一方面，提供了一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌的基因組中含 有xylR-Pxy lA-comk表達單元，所述xylR-PxylA-comk表達單元的序列包括5 '至3 '方向依次 排列的xylR基因序列、xylA啟動子基因序列、comk基因序列。
[0009] 優選地，所述枯草芽孢桿菌的基因組中整合有xylR-Pxy lA-comk表達單元，所述 xylR-PxylA-comk表達單元的序列包括5'至3'方向依次排列的xyIR基因序列、xyIA啟動子 基因序列、comk基因序列。
[0010] 優選地，所述xylR-PxylA-comk表達單元的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。
[0011]優選地，所述枯草芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌A164改造獲得。
[0012]優選地，所述枯草芽孢桿菌是將枯草芽孢桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除 并替換為xylR-PxylA-comk表達單元構建獲得。
[0013]優選地，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的基因序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0014]進一步地，所述枯草芽孢桿菌除了中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換之外，還可 經過其他基因改造。
[0015] 基因改造具體是指通過生物或化學或物理的手段使基因相比改造前在結構上發 生變化。這種變化主要是指堿基對組成的變化，包括但不限于一個或多個堿基對的替換、增 添、缺失引起的改變。
[0016] 本發明的第二方面，提供了前述枯草芽孢桿菌的制備方法，包括步驟:將枯草芽孢 桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除，并替換為xylR-PxylA-comk表達單元。
[0017]相比中性蛋白酶基因 nprE未被敲除替換的枯草芽孢桿菌，本發明的枯草芽孢桿菌 轉化效率更高。
[0018] 優選地，采用基因重組介導的基因操作敲除和替換中性蛋白酶基因 nprE。
[0019] 可以采用現有的基因重組方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。在優選地實 施例中，采用Cre-LoxP重組酶系統介導的基因重組方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。還可采用其他方法實現基因敲除和替換，并不限于實施例所列舉的方式。
[0020] 基于中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替換，nprE的完整序列從染色體DNA中去除和 被替換。
[0021] 進一步的，所述枯草芽孢桿菌還經過其他基因改造。
[0022]所述的其他基因改造是指除中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替換以外的基因改造。 所述其他基因改造可以是單個目標基因的改造或者為多個感興趣目標基因的改造。感興趣 目標基因并不特指，可以根據研究需要設定并改造。例如，可以是一個、兩個、三個以上目標 基因的改造。由于本發明中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換的苦草芽孢桿菌可在體外傳 代，因此理論上可以不斷對其進行基因改造，對于目標基因的改造數量可以按照需要操作， 沒有特別限制。
[0023]所述基因改造包括但不限于目標基因的敲入、目標基因的敲除、目標基因的替換 等。目標基因的敲入、目標基因的敲除、目標基因的替換可以采用基因打靶、同源重組等技 術來完成，包括但不限于基于Cre-LoxP重組酶系統、ZFN(鋅指核酸酶）、TALEN(轉錄激活樣 效應因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(成簇規律間隔短回文重復技術)等的基因操作。
[0024]凡是可以實現中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換及其他基因突變的其他生物技 術手段均可用于構建中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換且經其他基因改造的枯草芽孢桿 菌。
[0025] 優選地，還包括對所述枯草芽孢桿菌進行了單個或者多個感興趣目標基因的改 造。
[0026] 本發明的第三方面，提供了前述枯草芽孢桿菌的用途，為將所述枯草芽孢桿菌作 為表達宿主。
[0027] 進一步地，將所述枯草芽孢桿菌作為表達宿主用于外源基因的高效表達。
[0028] 進一步地，還可將所述枯草芽孢桿菌作為表達宿主用于工業多肽類產品、蛋白類 產品、藥劑和酶制劑等的高效表達。
[0029] 本發明的第四方面，提供了一種表達外源基因的方法，包括如下步驟：
[0030] 1)構建含有外源基因的重組表達載體；
[0031] 2)將步驟1)獲得的重組表達載體轉染本發明前述枯草芽孢桿菌，并在合適表達所 述外源基因的條件下培養所述宿主。
[0032]通過常規的重組DNA技術即可構建含有外源基因的重組表達載體，例如將目的外 源基因片段插入所述表達載體的多克隆位點。所述目的外源基因片段應當至少包含所要表 達的外源基因的完整編碼區。
[0033] 獲得的轉有重組表達載體的枯草芽孢桿菌可以用常規方法培養，表達外源基因。 根據所用的枯草芽孢桿菌的具體情況，培養中所用的培養基可選用已知的各種合適的培養 基或培養液，在適于宿主細胞生長的條件下進行培養并表達外源基因。如果需要，可利用其 物理的、化學的和其它特性或添加純化標簽通過各種分離方法分離和純化外源基因表達所 得產品。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉 淀劑處理(鹽析方法）、離心、滲透破壁、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
[0034] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0035]本發明首先通過質粒表達的方法解決了枯草芽孢桿菌A164轉化效率低的問題，然 后通過誘導轉化的方法將含有comk表達框的線性片段整合到A164基因組上，借助cre/lox 特異重組系統消除抗性，得到了不含抗性標記的、易于操作的、高轉化效率和高分泌能力的 枯草芽孢桿菌A164S。本發明的枯草芽孢桿菌A164S，研究結果表明，其轉化效率為A164的 1000倍以上;A164S能有效攝取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的表達方面有著較 大的應用潛力。
【附圖說明】
[0036] 圖1:重組質粒pMK4_cre的質粒圖譜。
[0037] 圖2:重組質粒pGSNE-nprlR-comk的質粒圖譜。
[0038] 圖3:重組質粒pMK4_comk的質粒圖譜。
[0039]圖4:枯草芽孢桿菌164S的構建流程圖。
[0040]圖5:枯草芽孢桿菌164S淀粉酶基因的敲的功能鑒定。
【具體實施方式】
[0041]在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法， 通常按照常規條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0042]當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0043] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領 域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及 相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY?John Wiley&Sons?New York?1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY ,Academic Pressman Diego ； Wolf fe ? CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition?Academic Pressman Diego?1998；METH0DS IN ENZYM0L0GY，Vol·304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.ll9，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等〇
[0044] 實施例1表達質粒pMK4_cre、表達質粒pMK4_comk和重組質粒pGSNE-nprlR-comk 的構建
[0045] I .pMK4_cre的構建
[0046] pMK4-cre是在pMK4載體的基礎上連接了含有一個Pspac啟動子的Cre酶表達基因 cre，用于在苦草芽孢桿菌中表達Oe酶。pMK4-cre的序列如SEQ N0.1所示，具體為：
[0047] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactgaaattatgg gtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaagaagatttatttgaggtagcccttgcc tacctagcttccaagaaagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctg ctaaaattcctgaaaaattttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagc ggataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccg gtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatac ctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcag aacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttg ggccagctaaacatgctteatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcg 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[0048] 其中的PSpac-cre片段以質粒pDGC為模板，以Pc re-F(SEQIDN0.5)為上游引物， 以Pcre-R(SEQIDN0.6)為下游引物PCR擴增得到。
[0049] Pcre_F(SEQ ID NO·5)，具體為：taccgaattctacacagcccagtccaga〇
[0050] Pcre_R(SEQ ID NO·6)，具體為：ctaggaattcgcatgcctaatcgccatcttccag〇
[0051] PCR反應體系如下：
[0052] 5x PS buffer (購自 TaKLaRa 公司，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2,5 mM) 3μ【 PcF 上游引物（10: μΜ) 3.0 rL Pcre-R 下游引物(ΙΟμΜ) 3.0 LiL DNA 模板 Ι.ΟμΙ PrimeSTAR..聚合酉每（.2,5 U/μΙ) LOpL 加水至 50 μL。
[0053] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運行以下程序：
[0054] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，1π?η 30sec;(5)循環從 (2)到(4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0055] PCR產物經Axygen PCR清潔試劑盒回收純化后，以限制性內切酶Eco RI酶切，與經 Eco RI和去磷酸化處理的線性質粒pMK4以T4DNA連接酶連接，連接液轉入大腸桿菌DH5a，從 大腸桿菌中分離得到重組質粒pMK4-cre。所述重組質粒pMK4-cre的結構示意圖如圖1所示D
[0056] 2. pMK4_comk 的構建
[0057] pMK4-comk是在pMK4載體的基礎上連接了含有啟動子xylA及其抑制基因 xylR的 comk表達基因，pMK4_comk用于在枯草芽抱桿菌中表達Comk
[0058] pMK4_comk的序列如SEQ NO. 3所示，具體為：
[0059] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatgg caagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctecta aagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaa acttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatc aaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacat catttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgct ttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatg acccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatat taatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagct 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[0060] 其中的xylR-PxylA-comk片段以質粒pMD19T-kan-comk-lacA(SEQIDN0.4)為模 板，以Comk-psF(SEQIDN0.7)為上游引物，以Comk-psR(SEQIDN0.8)為下游引物PCR擴增 得到。
[0061 ] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID Ν0.4)具體為：
[0062] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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tgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcg agtcagtgagcgaggaagcggaaga 〇
[0063] Comk_psF(SEQ ID NO·7)具體為：cgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcag〇
[0064] Comk_psR(SEQ ID N0.8)具體為：cagtctgcaggatatggtgcaagtcagcacgaac。
[0065] PCR反應體系如下：
[0066] 5x PS buffer (購自 TaKaRa 公…，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Comk-psF 上游引物（10 μΜ) 3.0 tuL Comk-psR 下游引物（10 μΜ) 3.0 [!L DNA 模板 I 0 tuL PrimeSTAR 聚合晦 C2.5 U/μΙ) LO 加水至 5:0 μΙ
[0067] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運行以下程序：
[0068] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，2π?η;(5)循環從（2)到 (4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0069] PCR產物經Axygen PCR清潔試劑盒回收純化后，以限制性內切酶Pst I酶切，與經 PstI和去磷酸化處理的線性質粒pMK4以T4DNA連接酶連接，連接液轉入大腸桿菌DH5a，從大 腸桿菌中分離得到重組質粒pMK4_comk。所述重組質粒pMK4_comk的質粒圖譜如圖3所示D
[0070] 3 .pGSNE-nprlR-comk 的構建
[0071] pGSNE-nprlR-comk是在pGSNE-nprlR載體的基礎上連接了含有啟動子xylA及其抑 制基因 xylR、Kan基因表達框、Comk編碼基因和兩個Iox位點，pGSNE-nprlR-comk是一種整合 型重組質粒。
[0072] pGSNE-nprlR-comk的序列如SEQ NO. 2所示，具體為：
[0073] agctctcgagaagatgatagctcatcaaaaatcccgccattgccaaataaatcgtatatggcattactgcaccataa tcttttgagatttgattgggatatggcgcaagcagcaagacaagcagtccgataatcagcgtataaaataagcctag taagatcttatccgttctccaatacagcttgaaaaacactacattcaacgcaatgggaagagtgatgatgaaaaaca gaaacacgaatgcaatcggctccatcccatccgggtattccttccaatacgaaaagaaactaaaaatcatttgtacg atcggcaaactgacaacagcaaggtcgaacgtataaaacttaccctttccgccatgatcacgcggcatcagcatata gtgaaaagccgtcagcagcacatatccgtataacaaaaaatgcagcagcggcagcagttcttttccgtcctctctta agtaagcgctggtgaagtttgttgattgcacctggtgaataagttcaacagacactcccgccagcagcacaatccgc aatataacacccgccaagaacattgtgcgctgccggtttattttgggatgatgcaccaaaagatataagcccgccag aacaacaattgaccattgaatcagcagggtgctttgtctgcttaatataaaataacgttcgaaatgcaatacataat gactgaataactccaacacgaacaacaatcctttacttcttattaaggcctcattcggttagacagcggacttttca aaaagtttcaagatgaaacaaaaatatctcatcttccccttgatatgtaaaaaacataactcttgaatgaaccacca catgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaaacaaacacaggacaatactatcaattttgtctagttatgt 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[0074]其中的kan-lox-comk片段以質粒pMD19T-kan-comk_lacA(SEQ ID NO.4)為模板， 以Ck-npr-KpnF(SEQIDN0·9)為上游引物，以Ck-npr-NheR(SEQIDN0·10)為下游引物PCR 擴增得到。
[0075] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID N0.4)具體為：
[0076] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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tgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcg agtcagtgagcgaggaagcggaaga 〇
[0077] Ck-npr-Kpn F(SEQ ID N0.9)具體為：cttttcctaatattacaatccggtaccgtcgcgatga ttaattaattcagaacg〇
[0078] Ck-npr-Nhe R(SEQ ID NO. 10)具體為：Gggatttattgtgggtgctagctctaccgttcgtat aatg〇
[0079] PCR反應體系如下： 5x PS buffer (購自 TaKaRa 公司，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Ck-npr-KpnF 丨-·.游引物（ΙΟμΜ) 3.0 μL
[0080] Ck-npr-NheR 下游引物（1()μΜ) 3.0 μΙ_. DNA 模板 1.0 liL PrimcSTAR 聚介丨姆（2.5 U/μΙ) 1.0 μL. 加水至 5? μL
[0081 ] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運行以下程序：
[0082] (1)98Γ，2π?η;(2)98Γ，158θ(：;(3)55Γ，158θ(3 ;(4)72Γ，3π?η 30sec;(5)循環從 (2)到(4)，30次；（6)72°C，10min; (7)4°C，保存。
[0083] PCR產物經Axygen PCR清潔試劑盒回收純化。以限制性內切酶Nhe I和Kpn I雙酶 切質粒pGSNE-npr IR，酶切產物經Axygen PCR清潔試劑盒回收純化。上述純化產物經 Infusion試劑盒(購自TaKaRa)進行連接，連接液轉入大腸桿菌DH5a，從大腸桿菌中分離得 到重組質粒pGSNE-npr lR-comk。所述重組質粒pGSNE-npr lR-comk的質粒圖譜如圖2所示。 [0084]實例2枯草芽孢桿菌164S的構建
[0085]米用質粒口]/〇(4-(3〇1111<：463呢-即1'11?-(3〇1111<:、。]\0(4-(^6改造枯草芽抱桿菌4164(厶164 基因組序列的DDBJ/EMBL/GenBank獲取號為no.CPOlll 15)，最終得到一株易于操作的高轉 化效率的枯草芽孢桿菌164S，流程圖見圖4。
[0086] 具體操作如下：
[0087]首先，把pMK4-comk轉化進入枯草芽孢桿菌A164。轉化采用高滲法電擊轉化的方 法，
[0088] a)接種枯草芽孢桿菌A164于3mL LB培養基中，過夜培養；
[0089] b)取2.6mL過夜培養菌液轉接到40mL(LB+0.5M山梨醇）中，37°C，200rpm培養至 0D600 = 0.8；
[0090] c)將菌液冰水浴IOmin，然后5000g，5min，4Γ離心收集菌體；
[0091] d)用30mL預冷的電轉培養基(0.5Μ山梨醇，0.5Μ甘露醇，10%葡萄糖），重新吹懸菌 體，5000g，5min，4°C離心去上清，如此漂洗3次；
[0092] e)漂洗三次后，利用未完全除去的電轉培養基將菌體吹懸后分裝，每EP管分裝60μ L；
[0093] f)將60yL感受態細胞中加入50ng質粒pMK4-comk，冰上孵育2min，加入預冷的電轉 杯（Imm)中，設置電壓2kV，電擊一次；
[0094] g)電擊完畢取出杯子并立即加入lmLRM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37°C， 200rpm，復蘇3hr后，涂5yg/mL的氯霉素抗性板;37°C，過夜培養篩選得到含有pMK4-comk質 粒的枯草芽孢桿菌A164C。
[0095] 然后，通過限制性內切酶Nco I酶切線性化質粒pGSNE-nprlR-comk，通過誘導轉化 的方法將線性化質粒pGSNE-npr lR-comk轉化進入A164C，具體方法如下：
[0096] a)把平板活化的單菌落接種到3mL LB試管中，37°C、200rpm培養10~12h;
[0097] b)b)然取300yL培養液轉接到預熱的3mL LB試管中，加入濾膜滅菌的的木糖溶液 至木糖終濃度為1%，37°C、200rpm培養3h;
[0098] c)分裝到2mL Eppendorf管中，按比例100ngDNA/100yL培養液加入線性化的質粒 后孵育，37 °C、200rpm培養1.5h;涂lOyg/mL的卡那霉素抗性板;37 °C，過夜培養篩選得到含 有comk整合到基因組上的含有卡納抗性片段的菌。
[0099] 然后通過在無氯霉素添加的LB培養基中傳代，篩選到消除質粒pMK4-c〇mk的枯草 芽抱桿菌A164K。
[0100] 最后，采用誘導轉化的方法把pMK4-cre轉化進入枯草芽孢桿菌A164K，在ere酶的 作用下使兩個Iox位重組，通過印章法利用lOyg/mL的卡那霉素抗性板反向篩選，得到了丟 失兩個Iox位點間的kan基因。通過在無抗生素添加的LB培養基中傳代，最終篩選到消除質 粒pMK4_cr e的枯草芽孢桿菌164S。
[0101 ] 亦即，本發明本質上是用comk cassette(即xylR-PxylA-comk片段，序列參考SEQ NO. 2)替換了A164的中性蛋白酶編碼基因 nprE的部分序列。具體的，本發明的是枯草芽孢桿 菌164S將枯草芽孢桿菌A164中如SEQ NO. 11所示的序列敲除，并替換為如SEQ NO. 12所示的 序列。
[0102]亦即，被敲除的序列如SEQ ID NO.11所示，具體如下：
[0103] ttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggctgc tgaaggtcatcagcttaaagagaatcaaacaaatttcctctccaaaaacgcgattgcgcaatcagaactctctgcac caaatgacaaggctgtcaagcagtttttgaaaaagaacagcaacatttttaaaggtgacccttccaaaaggctgaag cttgttgaaagcacgactgatgcccttggatacaagcactttcgatatgcgcctgtcgttaacggagtgccaattaa agattcgcaagtgatcgttcacgtcgataaatccgataatgtctatgcggtcaatggtgaattacacaatcaatctg ctgcaaaaacagataacagccaaaaagtctcttctgaaaaagcgctggcactcgctttcaaagctatcggcaaatca ccagacgctgtttctaacggagcggccaaaaacagcaataaagccgaattaaaagcgatagaaacaaaagacggcag ctatcgtcttgcttacgacgtgacgattcgctatgtcgagcctgaacctgcaaactgggaagtcttagttgacgccg aaacaggcagcattttaaaacagcaaaataaagtagaacatgccgccgccactggaagcggaacaacgctaaagggc gcaactgttcctttgaacatctcttatgaaggcggaaaatatgttctaagagatctttcaaaaccaacaggcaccca aatcatcacatatgatttgcaaaacagacaaagccgccttccgggcacgcttgtctcaagcacaacgaaaacattta catcttcatcacagcgggcagccgttgacgcacactataacctcggtaaagtgtacgattatttttattcaaacttt aaacgaaacagctatgataacaaaggcagtaaaatcgtttcttccgttcactacggcactcaatacaataacgctgc atggacaggagaccagatgatttacggtgatggcgacggttcattcttctctccgctttccggctcattagatgtga cagcgcatgaaatgacacatggcgtcacccaagaaacagccaacttgatttatgaaaatcagccaggtgcattaaac gagtctttctctgacgtattcgggtattttaacgatacagaagactgggacatcggtgaagacattacggtcagcca gcctgctcttcgcagcctgtccaaccctacaaaatacaaccagcctgacaattacgccaattaccgaaaccttccaa acacagatgaaggcgattatggcggtgtacacacaaacagcggaattccaaacaaagccgcttacaacaccatcaca aaacttggtgtatctaaatcacagcaaatctattaccgtgcgttaacaacgtacctcacgccttcttccacgttcaa agatgccaaggcagctctcattcagtctgcccgtgacctctacggctcaactgatgccgctaaagttgaagcagcct ggaatgctgtt。
[0104] 替換為的新序列如SEQ ID NO.12所示，具體如下：
[0105] gctagctcatggcaagcatatcgtatgtaatatgcttgccatcatatgactttggatccaagagaatattttatatt tttgttcatgtaatcactccttcttaattacaaatttttagcatctaatttaacttcaattcctattatacaaaatt ttaagatactgcactatcaacacactcttaagtttgcttctaagtcttatttccataacttcttttacgtttccgcc attctttgctgtttcgatttttatgatatggtgcaagtcagcacgaacacgaaccgtcttatctcccattatatctt tttttgcactgattggtgtatcatttcgtttttcttttgtgctagaggatcaattcttgaagacgaaagggcctcgt gatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatg tgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataa atgcttcaataatattgaaaaaggaagagtgcggccgcccgcggctatttttctaataccgttccccgagctcacgc aaaataaaatcataaatcatcttcgtccgctcttctttcgggtacagcataaattcctgtcttttcggcacgcggtg gtcgattctgtcttggaatttggttctgagccacgctgttcggtatacctggttctcgaacgaattataagagatcg gcagctccatcgttttcccattggaaaacgtcacttccgtatcgtcgaattcagtcgctttgaattcttttacatgc acatgggaaatccagccgcattggggtcttgtcgaagaaagtgtagggaataaaaagatttggttcgaagggtccac catgatcggcggcttgtgtgaaatttttgtcacttcataagttcctgcttttcttcccgcatagcttgatccaaaaa atcggcagcttctgtcgacaatttgcagcggcttcatgtttacataaaacacgcaatctttttcaataattttggaa cagattttgccgtctatttcttctggcagcacggcaattgttgcgccgttcacttcatacgattctaaaggtgcgtc tgttttctgactcatattatggcctcctttggatcccatttccccctttgatttttagatatcactagtttggacca tttgtcatttccccctttgatttaagtgaacaagtttatccatcaactatcttaattgagttagtttgtttatccaa taaactaactttatctcatcatatacaaaataaatgtttatttcaatgttttttttagaaaatttagttataatatt agatatgatacttttaaatatctaattcaagcttcaaaaaacaccaacttagttcggtggataaacaaaggagtggt tattattcaaattgcagatcaagctttagtaaaaaaaatgaatcaaaaattaatattagatgaaattttgaagaact cccctgtctccagggcaactctctctgagattacaggattaaacaagtctactgtctcctctcaagtaaatacactg cttgaaaaagattttatttttgaaattggggcagggcaatctagaggcggcagaagacctgtaatgcttgtttttaa taagaatgcaggctactcgattggtattgatataggagtcgactatcttaacggaattctaaccgacttagaaggaa atattattctcgagaagacttctgacttgtctagttcttccgctagtgaagtaaaagagattttatttgcacttatt catggttttgtaacccatatgcctgagtccccttatggtctagtcggaataggaatttgtgttccaggccttgtaga tcgtcatcagcaaattattttcatgcctaacttaaattggaatatcaaagatttgcagtttttaattgagagtgagt ttaatgttccggtttttgttgaaaatgaagctaatgcaggagcatacggtgaaaaagtatttggtatgacaaaaaac tatgaaaacatcgtttacatcagtattaatatcggaattggaactggacttgttattaacaacgaattgtataaagg tgttcagggtttttctggggaaatgggtcatatgacgatagattttaatggacccaaatgcagctgtggaaatcgag gctgttgggaattatatgcttctgaaaaagcgttactggcttcgctctctaaagaagaaaagaatatttctcgaaaa gagattgtggaacgcgcaaataaaaatgatgtagaaatgttaaatgcacttcaaaactttggcttttatatcggaat tggattaaccaatatccttaatacatttgatatagaagctgttatcttgagaaatcatataattgaatctcatccca ttgttttaaatacgattaaaaacgaagtttcttctagagtccattctcatttagacaataaatgtgaactattgcct tcttcgttaggaaaaaatgcacctgctttaggagcggtttctatcgttattgattcttttttaagtgttacccctat aagttaggagctccccgggacgttcttgccattgctgcataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaattaa ttaatcatcgcgacggtacc〇
[0106] 利用普通的質粒DNA(例如pMK4、pHT01等可在苦草芽孢桿菌中自助復制的穿梭質 粒)對枯草芽孢桿菌164S進行轉化，轉化效率可以達到IO 4~IO5CFUAxg DNA。
[0107] 實例3枯草芽孢桿菌164S淀粉酶基因的敲除
[0108] 采用誘導轉化的方式，可以方便地對枯草芽孢桿菌164S進行基因操作。利用限制 性內切酶Kpn I切割淀粉酶敲除質粒pDG364后，不做產物的清潔，直接轉化枯草芽孢桿菌 164S：
[0109] a)把平板活化的枯草芽孢桿菌164S落接種到3mL LB試管中，37°C、200rpm培養10 ~12h;
[0110] b)然取300yL培養液轉接到預熱的3mL LB試管中，加入濾膜滅菌的的木糖溶液至 木糖終濃度為1%，37°C、200rpm培養3h;
[0111] c)分裝到2mL Eppendorf管中，按比例IOOng DNA/100yL培養液加入線性化的質粒 后孵育，37 °C、200rpm培養1.5h。涂5yg/mL的氯霉素抗性板。37 °C，過夜培養。
[0112]挑取單克隆轉接篩選得到的菌于含2%。(質量分數)可溶性淀粉的LB平板上，37°C 過夜培養，然后用碘液檢測淀粉水解圈的方式鑒定淀粉酶敲除情況，檢測結果見圖5,淀粉 酶基因敲除效率大于90%。由此可見，本發明所得到的新的苦草芽孢具有很強的操作性，具 有廣泛的應用前景。
[0113]以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明任何形式上和實質上的限制， 應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還將可以做出 若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。凡熟悉本專業的技術人員， 在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更 動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對 上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍 內。
【主權項】
1. 一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌基因組中含有xylR-PxylA-comk表達單元，所 述xylR-PxylA-comk表達單元的序列包括5'至3'方向依次排列的xylR基因序列、xylA啟動 子基因序列、comk基因序列。2. 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述xylR-PxylA-comk表達單元 的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。3. 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌由枯草芽孢桿 菌A164改造獲得。4. 根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是將枯草芽孢 桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替換為xylR-PxylA-comk表達單元構建獲得。5. 根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的 基因序列如SEQ ID NO. 11所示。6. 根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌除了中性蛋白 酶基因 nprE被敲除和替換之外，還可經過其他基因改造。7. -種制備如權利要求1~6任一權利要求所述枯草芽孢桿菌的方法，包括步驟:將枯 草芽孢桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替換為xylR-PxylA-comk表達單元。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，采用基因重組介導的基因操作敲除和替換 中性蛋白酶基因 nprE。9. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，采用Cre-LoxP重組酶系統介導的基因重組 方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。10. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，還包括對所述枯草芽孢桿菌進行了單個 或者多個感興趣目標基因的改造。11. 如權利要求1~6任一權利要求所述枯草芽孢桿菌的用途，為將所述枯草芽孢桿菌 作為表達宿主。12. 根據權利要求11所述的用途，其特征在于，將所述枯草芽孢桿菌作為表達宿主用于 外源基因的高效表達。13. 根據權利要求11所述的用途，其特征在于，將所述枯草芽孢桿菌作為表達宿主用于 工業多肽類產品、蛋白類產品、藥劑和酶制劑的高效表達。14. 一種表達外源基因的方法，包括如下步驟： 1) 構建含有外源基因的重組表達載體； 2) 將步驟1)獲得的重組表達載體轉染如權利要求1~6任一權利要求所述枯草芽孢桿 菌，并在合適表達所述外源基因的條件下培養所述宿主。
【文檔編號】C12N15/75GK105861405SQ201610297900
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】孫俊松, 紀明華, 史吉平, 姜標
【申請人】中國科學院上海高等研究院