還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備抑制腦組織炎癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在藥學領域中的應用。更具體地說是還 原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備抑制腦組織炎癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥 物中的應用。
【背景技術】
[0002] 還原態煙醜胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,簡稱NADH)的化學結構式是：
NADH的制備方法主要是以酵母為原料，酵母經沸水提取，醋酸鉛酸化沉淀得粗品，經甲 酸型陽離子交換樹脂柱處理，精制而得。
[0003] 大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide from E. coli，簡稱LPS)是從大腸桿菌中 提取的脂多糖復合物，實驗中常用來誘導炎癥模型。
[0004] 現有技術中尚未披露NADH在抑制LPS誘導的腦組織炎癥反應并減少減少腦組織 炎癥損傷中具有治療的作用。
【發明內容】
[0005] 本發明人在實驗中首次發現：還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在抑制腦組織炎癥反 應并減少炎癥損傷中，該藥物具有明顯的治療作用。
[0006] 本發明的目的是還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為活性成分在制備抑制腦組織 炎癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用。
[0007] 進一步的，還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為唯一活性成分在制備抑制腦組織炎 癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用。
[0008] 進一步的，上述腦組織炎癥損傷，為病理狀態下腦組織有炎癥損傷的人，如腦卒 中、老年癡呆、帕金森等神經科學疾病患者。
[0009] 進一步的，上述腦組織炎癥損傷，腦組織炎癥細胞激活的增加、腦細胞凋亡的增 加。
[0010] 進一步的，所述的還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸制備的藥物劑型是氣霧劑、片劑、 膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、混懸劑、糖漿劑、各種腸溶制劑或注射劑。
【附圖說明】
[0011] 圖I NADH對大腸桿菌脂多糖誘導的腦組織炎癥（CDllb信號)增加具有抑制作用。
[0012] 圖2 NADH對大腸桿菌脂多糖誘導的腦組織凋亡信號（TUNEL)增加有保護作用。
【具體實施方式】
[0013] 本發明對還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備抑制腦組織炎癥反應及減少炎癥 損傷藥物中的應用的實驗內容主要包括以下幾個方面： I. NADH對大腸桿菌脂多糖造成的腦組織炎癥反應增加具有抑制作用。
[0014] 2. NADH對大腸桿菌脂多糖造成的腦組織凋亡增加有保護作用。
[0015] 下面通過藥效學實驗進一步說明NADH在抑制腦組織炎癥反應并減少炎癥損傷中 具有明顯的治療作用。
[0016] 一、實驗方法 1、動物操作 本研究使用的是小鼠，在上海交通大學MED-X研究院進行動物實驗、飼養。所有的操作 流程均符合上海交通大學實驗室動物保護和使用守則。所有的給藥方式均為腹腔注射，預 先注射一定濃度NADH或生理鹽水，Ih后注射一定濃度LPS或生理鹽水。給藥完成后，小鼠 在動物房中進行飼養，條件為22-24°C，12小時的明/暗循環，并可自由進食取水。24h后犧 牲小鼠，取腦。
[0017] 2、取腦 小鼠麻醉后，進行生理鹽水心臟灌注，然后取腦，取出的腦組織置于-80°C預冷的異戊 烷中冷凍，然后用鋁箔紙包裹，凍存于_80°C冰箱。
[0018] 3、腦組織冰凍切片 對上述凍存的小鼠腦組織進行冰凍切片，切好的切片保存于_80°C冰箱。
[0019] 4、腦組織中凋亡信號（TUNEL)檢測 對上述小鼠腦組織冰凍切片進行凋亡信號的相關染色，使用末端脫氧核苷酸轉移酶將 生物素標記的核苷結合到凋亡細胞的斷裂DNA片段上，然后使用辣根過氧化物酶標記的親 和素結合上述核苷，最后辣根過氧化物酶催化顯色底物氨基聯苯胺。具體參照CHEMIC0N公 司的TUNEL凋檢測試劑盒 5、腦組織中激活狀態炎癥細胞(激活態小膠質細胞CDllb表達水平）檢測 對上述小鼠腦組織冰凍切片進行驗證信號CDl Ib的免疫熒光染色，使用4%多聚甲醛固 定上述冰凍切片15min，PBS溶液洗3次，每次lOmin，10%羊血清封閉lh，一抗抗體（1:100稀 釋，rabbit anti mouse)4°C孵育過夜，PBS溶液洗3次，每次IOmin,突光二抗（1:500稀釋， goat anti rabit)室溫孵育 lh，DAPI (1:1000 稀釋）染色 5min，PBS 洗三次，每次 IOmin, 滴加抗熒光淬滅劑，封片。
[0020] 6、拍照、雙盲評分 對上述染色進行顯微鏡拍照，并對染色結果進行雙盲評價。
[0021] 二、實驗結果和討論 UNADH對大腸桿菌脂多糖造成的腦組織炎癥反應增加具有抑制作用。
[0022] 小鼠腹腔注射大腸桿菌脂多糖0. 5mg/kg，24小時后犧牲小鼠，取腦，冰凍切片，染 色，發現腦組織中⑶I Ib信號明顯增加，而這個增加效果，可以由20、100mg/kg的NADH明顯 減輕。結果見圖1。
[0023] 2、NADH對大腸桿菌脂多糖造成的腦組織凋亡增加具有保護作用。
[0024] 小鼠腹腔注射大腸桿菌脂多糖0. 5mg/kg，24小時后犧牲小鼠，取腦，冰凍切片，染 色，發現腦組織中TUNEL凋亡信號明顯增加，而這個增加效果，可以由20、100mg/kg的NADH 明顯減輕。結果見圖2。
[0025] 根據以上結果表明，NADH可以抑制腦組織炎癥反應并減少炎癥損傷，表明NADH在 制備抑制腦組織炎癥并防治腦組織炎癥損傷藥物中有重要應用價值。
[0026] 腦組織炎癥反應在腦卒中、老年癡呆、帕金森等神經科學疾病損傷中起著重要作 用，而本發明可以有效抑制于腦組織炎癥反應并減少炎癥損傷，為以后制作以NADH為主要 成分的藥物在抑制神經科學疾病腦組織炎癥反應并減少炎癥損傷的臨床應用提供了重要 科學依據。
【主權項】
1. 還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸作為唯一成分在制備抑制腦組織炎癥反應及預防或 治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用；所述還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸的化學結構式是：2. 還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸作為活性成分在制備抑制腦組織炎癥反應及預防或 治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用。3. 還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸作為唯一活性成分在制備抑制腦組織炎癥反應及預 防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用。4. 根據權利要求1或2或3所述的還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸在制備抑制腦組織炎 癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用，所述腦組織炎癥損傷，為腦組織中炎 癥細胞激活的增加、調亡信號的增加。5. 根據權利要求1或2或3所述的還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸在制備抑制腦組織炎 癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用，所述的還原態煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸 制備的藥物劑型是氣霧劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、混懸劑、糖漿劑、腸溶制劑或注射 劑。
【專利摘要】本發明公開了還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在制備抑制腦組織炎癥反應及預防或治療腦組織炎癥損傷藥物中的應用。通過現代藥理學實驗證明，NADH給藥可以明顯抑制腦組織炎癥反應及減少腦組織炎癥損傷，提示預防性給藥可以抑制腦組織炎癥并防治腦組織炎癥損傷。
【IPC分類】A61P25/16, A61P25/28, A61P25/00, A61K31/7084
【公開號】CN105640978
【申請號】
【發明人】殷衛海, 王班, 曹威, 馬英鑫, 丁顯廷, 嚴整輝, 林利興
【申請人】上海交通大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月25日