T-2毒素的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬納米生物傳感以及生物檢測技術領域，具體地說，是提供一種Τ-2毒素的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]Τ-2毒素(trichothecenes，TS)主要由三線鐮刀菌等多種真菌產生的單端孢霉烯族化合物之一。1973年聯合國糧農組織(FAQ)和世界衛生組織(WHO)在日內瓦召開的聯席會議上，把這類毒素同黃曲霉素一樣作為自然存在的最危險的食品污染源，它廣泛分布于自然界，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大。T-2毒素在室溫條件下非常穩定，放置6?7年或加熱至100?120°C1小時不能破壞其毒性。目前還沒有對T-2毒素中毒的特異性防治辦法，唯一有效的預防辦法是避免接觸或減少接觸。因此，對Τ-
2毒素的檢測非常必要。
[0003]目前，檢測Τ-2毒素的方法主要有:色譜法、免疫層析法、色譜-質譜聯用法等方法。最近，中國專利CN 105021593 A公開了一種基于足點域和雜交鏈式反應測定Τ-2毒素的方法。
[0004]但是，這些方法的各有其缺點:如色譜-質譜聯用法，不僅儀器價格昂貴，且需藥專門技術人員才能勝任，難于普及;免疫法試劑貴且易于失活;基于足點域和雜交鏈式反應測定Τ-2毒素的方法，需要使用價格昂貴的通過標記的DNA等不足。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種檢Τ-2毒素的方法。本發明采用的技術方案:一種檢Τ-2毒素的方法，包括如下步驟:
(Α)Τ-2毒素核酸適體(Apt)與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈；
(B)將待測樣品溶液加入到該雜交鏈溶液，當待測樣品中有T-2毒素時，雜交鏈選擇性地與T-2毒素反應釋放出單鏈信號探針ssDNA;
(C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而清除雙鏈DNA，留下單鏈信號探針ssDNA;
(D)利用T-2毒素核酸適體-T-2毒素結合體不能誘導銀離子還原成近紅外熒光的銀納米簇，只有單鏈信號探針ssDNA能誘導銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，在銀離子還原檢測體系中檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。
[0006]所述銀離子還原檢測體系包括先后添加的銀離子和使銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇的硼氫化物還原劑，例如硼氫化鈉。步驟(D)的檢測，例如包括依次先后向體系中加入銀離子溶液和硼氫化鈉溶液，反應后生成近紅外熒光銀納米簇。
[0007]所述T-2毒素核酸適體為
5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-
3，。
[0008]所述可與T- 2毒素核酸適體雜交的單鏈信號探針s s D N A為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。
[0009]本發明的檢測原理如下:先讓Apt與ssDNA雜交(下劃線部分)；當有T-2毒素存在時，雜交鏈與T-2毒素反應釋放出ssDNA;體系中存在Apt- ssDNA (剩余的)，Apt_T_2毒素和ssDNAjpt-T-2毒素不能誘導銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，Apt-T-2毒素存在對測定無干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸，從而清除體系中的雙鏈DNA。此時體系中只留下可誘導生成近紅外熒光銀納米簇的ssDNA，通過檢測體系的熒光強度，可以測定T-2毒素的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，提高了檢測的靈敏度和精度。
[0010]本發明另外提供了一種檢測T-2毒素的試劑盒，其至少包括:T-2毒素核酸適體、可與Τ-2毒素核酸適體雜交的單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、外切酶、銀離子還原檢測體系O
[0011 ]所述 T-2 毒素核酸適體為 5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3，。
[0012]所述的單鏈信號探針ssDNA為5’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3 ’。
[0013]所述DNA擴增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶；所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成。
[0014]所述外切酶為Exo III核酸外切酶。
[0015]所述的銀離子還原檢測體系中還原劑為硼氫化物。
[0016]所述硼氫化物為硼氫化鈉。
[0017]本發明還提供了一種可用于檢測T-2毒素的T-2毒素核酸適體，其堿基序列為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACAC
ATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3，。
[0018]本發明的優點
根據本發明的檢測方法和試劑盒，消除了背景熒光的干擾，提高了 T-2毒素的檢測靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0019]圖1為ssDNA-Ag納米簇熒光強度與T_2毒素的濃度關系。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
一種檢測Τ-2毒素的試劑盒至少包括:Τ-2毒素核酸適體、單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銀離子還原檢測體系。T - 2毒素核酸適體為5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3 ’。單鏈信號探針ssDNA為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3 ’。DNA擴增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶;所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成。核酸外切酶為Exo III核酸外切酶。所述的銀離子還原檢測體系中的還原劑為硼氫化物，如硼氫化鈉。[0021 ] 實施例2
一種檢測T-2毒素的方法，具體操作過程如下:
將各DNA儲備液在95°C下經加熱處理5分鐘，使用前，并在室溫下放置30分鐘。然后，分別取含3.0 μπιο? Τ-2毒素核酸適體(Apt)的雜交緩沖溶液40 y!jP3.0 μπιο?信號探針ssDNA的雜交緩沖溶液40 yL置于2ml離心管中，在37°C下雜交I小時，生成T-2毒素核酸適體-信號探針雜交物(Apt - ssDNA) ο
[0022]在37°C下，分別依次將濃度為O?1.0 ng/mL的T-2毒素添加到Apt- ssDNA溶液中，T-2毒素與T-2毒素核酸適體反應，生成核酸適體-T-2毒素，釋放出ssDNA。這時，體系中有ssDNA、剩余(未反應的)APT- ssDNA和核酸適體-T-2毒素等物質。
[0023]加入10 yL緩沖溶液(緩沖溶液組成為50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.5 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向體系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反應15分鐘，使得以T-2毒素核酸適體-信號探針雜交序列(Ap-ssDNA)為摸板擴增成雙鏈DNA。在65°C下保持10分鐘使Phi29 DNA去活。
[0024]再向該反應體系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反應30分鐘，使選擇性地將雙鏈DNA水解成單核苷酸而清除雙鏈DNA，單鏈探針ssDNA不水解而保留下來。
[0025]向反應液中加入25 yL I mmol硝酸銀和180Λ檸檬酸鈉緩沖液(10 mM，pH7.0)。然后，混合物在室溫下避光或暗室中放置10分鐘后，在快速攪拌下，加入10yL濃度為200μΜ的新制備的硼氫化鈉溶液。然后在45°C下反應5?10 min。將溶液轉移至微量比色皿，測定體系的熒光強度，進行T-2毒素的定量測定，結果如圖1所示。
[0026]線性范圍0.008-0.20 ng/mL，檢測限5pg/mL，回收率在95.5-105.7%。其它真菌毒素、維生素C、葡萄糖等生物小分子T-2毒素的檢測無干擾。
【主權項】
1.一種T-2毒素的檢測方法，其特征是，該方法包括如下步驟: (Α)Τ-2毒素核酸適體與單鏈信號探針DNA( ssDNA)雜交，形成雜交鏈； (B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當待測樣品中有T-2毒素存在時，雜交鏈選擇性地與T-2毒素反應釋放出單鏈信號探針ssDNA; (C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去雙鏈DNA，留下單鏈信號探針ssDNA; (D)利用T-2毒素核酸適體-T-2毒素結合體不能誘導銀離子還原生成近紅外熒光銀納米簇，只有單鏈信號探針ssDNA能夠誘導銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，檢測體系的熒光強度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。2.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述T- 2毒素核酸適體為5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的單鏈信號探針ssDNA為5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3，。4.一種檢測T-2毒素的試劑盒，其特征是，其至少包括:T-2毒素核酸適體、可與T-2毒素核酸適體雜交的單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銀離子還原檢測體系。5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述T-2毒素核酸適體為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述的單鏈信號探針DNA為5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3，。7.根據權利要求4中所述的檢測T-2毒素的試劑盒，其特征是，所述DNA擴增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶;所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)組成。8.根據權利要求4中所述的檢測T-2毒素的試劑盒，其特征是，所述核酸外切酶為ExoIII核酸外切酶。9.根據權利要求4中所述的檢測T-2毒素的試劑盒，其特征是，所述的銀離子還原檢測體系中還原劑為硼氫化物。10.根據權利要求9中所述的檢測T-2毒素的試劑盒，其特征是，所述硼氫化物為硼氫化鈉。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測T-2毒素的方法及試劑盒，該方法包括如下步驟：（A）使T-2毒素核酸適體與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈；（B）使該雜交鏈與待測樣品接觸，當待測樣品中有T-2毒素存在時，雜交鏈與T-2毒素反應釋放出單鏈信號探針ssDNA；（C）利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而清除雙鏈DNA，此時體系中留下ssDNA；（D）在ssDNA誘導下，銀離子還原生成近紅外熒光銀納米簇；檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。該方法具有高靈敏度，操作簡單，低成本等特點。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105606574
【申請號】CN201610041769
【發明人】夏曉東, 冉海寧, 楊陽, 唐春然
【申請人】湖南科技大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月21日