中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針及檢測用試劑盒。
【背景技術】
[0002] 中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，是我國特有的水產養殖珍品，但隨 著養殖集約化和規模化發展，各種病害已經成為危害養蟹業的重要難題。近幾年，在江蘇省 興化市、鹽城市鹽都區和泗洪縣等地的河蟹主養區廣泛流行微孢子病，該疫情給當地的河 蟹養殖產業造成了巨大損失。主要癥狀為河蟹附肢長期空癟，雖能繼續蛻殼，但生長緩慢， 解剖見肝胰臟顏色由金黃色逐漸變淺，直至灰白色，部分還出現"拉黃"（排泄肝胰腺）的癥 狀。至今為止，關于該病的診斷仍然是主要采用解剖觀察的方法，具有明顯的局限性，因此 開發出更加高效、準確和便捷的診斷方法將有非常顯著的現實意義和廣闊的應用前景。
[0003] 原位雜交技術是利用帶有標記物的特征性核酸序列作為探針，與樣品中互補的核 酸序列雜交，然后通過抗原-抗體反應和酶-底物的化學顯色反應將檢測信號逐級擴大，顯 示檢測結果。原位雜交假陽性率低，從直觀性、準確性和靈敏度綜合考慮是一種其它任何方 法都無法替代的檢測方法，且至今未見有關中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測方法的報 道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種用于高靈敏度、高可信度同時又非常直觀的中華絨螯 蟹微孢子蟲檢測的探針，并提供檢測試劑盒。
[0005] 本發明根據中華絨螯蟹微孢子蟲18S SSU rDNA(HE584635)設計一對特異性引物， PCR擴增，以地高辛進行標記，制備特異性檢測中華絨螯蟹微孢子蟲的探針，所述探針如SEQ ID NO. 1所示，該探針的引物序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0006] 本發明公開了中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針，序列如SEQ ID NO. 1所 示。該序列以地高辛進行標記可制備成檢測中華絨螯蟹微孢子蟲的特異性探針，用于檢測 試劑盒中。
[0007] 本發明還公開了 SEQ ID NO. 1所示序列作為中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測 探針的應用。
[0008] 本發明公開了上述中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針在制備中華絨螯蟹 微孢子蟲的原位雜交檢測試劑盒中的應用。
[0009] 此外，本發明還提供一種用于中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測試劑盒，該試 劑盒包括原位雜交檢測試劑，還含有由上述中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針制備 的特異性探針。具體地，該試劑盒由多個試劑瓶組成，所述的試劑瓶包括含特異性探針A液 (探針濃度100 μ g/ml)，所述特異性探針是指經地高辛進行標記的SEQ ID NO. 1，含蛋白酶 K (10 μ g/ml)的B液，用于促進探針結合的C液（Dig Easy Hyb Granules, Roche)，封閉非 特異性蛋白位點的D液（10X ,Blocking solution，Roche)，含有堿性磷酸酶標記地高辛抗 體的E液，用于顯色的F液（50XNBT/BCIP)。
[0010] 本發明具有如下有益效果：
[0011] (1)能直觀地將微孢子蟲與其引起的病理變化結合起來；
[0012] (2)在高效、準確檢測微孢子蟲的同時可根據樣本切片分析感染率和感染強度；
[0013] (3)由于探針的雜交是特異的，且信號經過了逐級放大，所以較常規的染色檢測靈 敏、精確；
[0014] (4)本發明中，顯色后的切片可以長期保存。
【附圖說明】
[0015] 圖1，健康中華絨螯蟹陰性對照；
[0016] 圖2,輕度微孢子蟲感染的中華絨螯蟹原位雜交檢測結果；
[0017] 圖3,重度微孢子蟲感染的中華絨螯蟹原位雜交檢測結果。
[0018] 圖中標尺=100μηι。
【具體實施方式】
[0019] 下列實驗及操作實例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。以 下實施例中除特別說明外，均為本領域內的常規試劑、實驗方法和操作步驟。
[0020] 實施例1 :
[0021] 中華絨螯蟹樣品：
[0022] 發病中華絨螯蟹于2014年8月取自江蘇省內發生嚴重死亡的養殖場，平均重量 91. 2g(樣本量η = 30)。健康中華絨螯蟹于2014年9月，取自南京中華絨螯蟹養殖場，平 均重量94. 3g(樣本量η = 24)。健康中華絨螯蟹通過常規光鏡、電鏡觀察和PCR檢測，確定 無微孢子蟲感染，作為陰性對照；發病中華絨螯蟹經光鏡、電鏡觀察和PCR檢測確定是有微 孢子蟲感染后，作為陽性對照。
[0023] 樣品固定及切片制備：
[0024] (1)固定：取中華絨螯蟹易感染組織肝胰腺于含0.1%DEPC的4%多聚甲 醛（1000ml蒸餾水中加 Na2HPO4. 12H20 36g，多聚甲醛干粉40g，加熱攪拌溶解后加 NaH2PO4. 2H20 3g，pH 7. 0 ;趁熱加 DEPC至終濃度0· 1 % )固定2小時后，用PBS洗滌3次， 每次30min，然后脫水、透明、石蠟包埋、切片；
[0025] (2)切片（需同時做陽性和陰性對照）：將組織切成厚度為7-10 μm的組織切片， 并將烘烤后的切片保存于4°C冰箱。
[0026] 探針合成：
[0027] (1)收集微孢子蟲感染的中華絨螯蟹肝胰腺，利用基因組DNA提取試劑盒 (QIAGEN，51304)進行模板DNA的提取，具體步驟參照試劑盒的說明書。
[0028] (2)用于合成探針的DNA片段是根據⑴中提取的模板，由下面一對引物擴增出來 的，引物序列如下：
[0029] W3F :5'-CTGTGAGGCTATTGTTGGGC-3'（SEQ ID NO. 2)
[0030] W3R :5,-TACTGTGCTCCCTGTCCATT-3'（SEQ ID NO. 3)
[0031] 按照以下步驟將上述引物擴增出的目的片段（序列信息如SEQ ID NO. 1所示）經 過膠回收后用地高辛標記過夜即為檢測中華絨螯蟹微孢子蟲的特異性核苷酸探針：
[0032] 具體制備方法為：
[0033] (I)PCR反應體系如下表：
[0035] (2) PCR擴增程序如下：首先95 °C變性4min ;緊接著40個循環的95 °C Imin， 58°C 30s，72°C Imin ;最后是 72°C延伸 5min，4°C保存。
[0036] (3)探針標記步驟如下：1 %瓊脂糖凝膠電泳分析后，切膠回收DNA，Nanodrop 2000紫外分光光度計對濃度進行定量，取I μ g凝膠回收的DNA加入無菌蒸餾水，至總體積 16 μ 1，煮沸變性IOmin后立刻置于冰上，加入4 μ I DNA地高辛標記液，37°C孵育24h，最后 加入2μ1 0. 2M EDTA(pH 8. 5)終止反應，該產物即為標記好的探針，-20°C保存。
[0037] 原位雜交檢測：
[0038] 將上述特異性探針與制備好的切片進行原位雜交，所述的特異性探針與樣本目的 片段結合，并進一步結合堿性磷酸酶標記的抗地高辛Fab片段，通過堿性磷酸酶顯色系統 進行信號放大檢測。本發明提供的試劑盒由多種試劑組成，包括用于含特異性探針的A液 (探針濃度100 μ g/ml)，含蛋白酶Κ(10 μ g/ml)的B液，用于促進探針結合的C液（Dig Easy Hyb Granules, Roche)，封閉非特異性蛋白位點的 D 液（10X ,Blocking solution，Roche)， 含有堿性磷酸酶標記地高辛抗體的E液，用于顯色的F液（50XNBT/BCIP)。
[0039] 具體如下：
[0040] (1)將組織切片進行脫蠟：二甲苯5minX2,二甲苯+無水乙醇（I :l)5min ;
[0041] (2)酒精梯度清洗：無水乙醇101^1^2,95%、90%、80%、70%的乙醇各511^11，最 后 PBS IOmin ;
[0042] (3)Triton X-10010min，PBS 10min，37 cC 下 B 液（蛋白酶 K 50μg/ml)清 洗1511^11，0.2%甘氨酸511^11，？85(似(：188，1((：10.28，似 2冊04 1.448，腿2?04 0 . 248，用 DEPC-H2O配置1L，調整pH為7. 4)5minX2,4%多聚甲醛滴片固定5min ;
[0043] (4)PBS 5minX 2,再將切片放入55°C去離子甲酰胺和IX檸檬酸三鈉 -NaCl緩沖 液（SSC，1000ml蒸餾水中加氯化鈉8. 8g，檸檬酸三鈉 4. 4g)的等量混合液中浸泡30min ;
[0044] (5)預雜交：在干的雜交盒底部加20 %甘油20ml以保持濕度，按每張20 μ 1加 A 液，恒溫箱38°C預雜交lh，吸取多余液體，不洗；
[0045] (6)雜交：用C液稀釋A液至50 μ g/ml，每張切片加20 μ 1，蓋上蓋玻片，恒溫箱 42°C，雜交過夜。
[0046] (7)雜交后洗滌：揭去蓋玻片，37°C 2XSSC洗滌2次，每次5min;0.5XSSC洗滌 15min ;0· 2 X SSC 洗滌 15min ;
[0047] (8)滴加稀釋后的D液（使用前10000rpm/min離心5min，吸取上層液體稀釋10 倍），37°C 30min ;
[0048] (9)按照I :2000抗體效價，滴加 E液，37°C 60min，PBS洗4次，每次5min ;
[0049] (10)將玻片放入檢測緩沖液（0· IM Tris-HCl、0.1 M NaCl，pH 9. 0)平衡 2min ;
[0050] (11)顯色：將玻片放到用檢測顯色液稀釋后的F液中避光孵育顯色（40 μ I F液， 2ml檢測緩沖液）顯微鏡下控制顯色；
[0051] (12)顯色完全后，PBS清洗IOmin ;二甲苯脫色，封片，觀察。
[0052] 結果觀察：
[0053] 地高辛標記的特異性探針與細胞內寄生的微孢子蟲特異性地結合，經堿性磷酸酶 染色后呈深藍紫色。所檢測的健康中華絨螯蟹無特異性信號（圖1)，輕度感染微孢子蟲的 中華絨螯蟹陽性信號點較少，零星分散（圖2)，重度感染微孢子蟲的中華絨螯蟹信號聚集， 集中于肝胰腺的上皮中（圖3)。
【主權項】
1. 中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針，序列如SEQIDNO. 1所示 2. SEQIDNO. 1所示序列作為中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針的應用。3. 權利要求1所述中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針在制備中華絨螯蟹微孢 子蟲的原位雜交檢測試劑盒中的應用。4. 一種中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測試劑盒，包括原位雜交檢測試劑，其特征 在于，還含有由權利要求1所述中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針制備的特異性探 針。5. 根據權利要求4所述的中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測試劑盒，其特征在于， 包括： (1) 含特異性探針的A液，所述特異性探針是指地高辛標記的權利要求1所述檢測探 針； (2) 含蛋白酶K的B液， (3) 促進探針結合的C液：DigEasyHybGranules,Roche， (4) 封閉非特異性蛋白位點的D液：10X，Blockingsolution，Roche， (5) 含有堿性磷酸酶標記地高辛抗體的E液， (6) 用于顯色的F液：50XNBT/BCIP。
【專利摘要】本發明公開了中華絨螯蟹微孢子蟲的原位雜交檢測探針及試劑盒。所述探針的序列如SEQ？ID？NO.1所示。所述探針用地高辛標記，與中華絨螯蟹組織切片中的微孢子蟲18S小亞單位核糖體DNA(18S？SSU？rDNA)雜交結合后，經堿性磷酸酶檢測系統顯色，在顯微鏡下觀察即可判斷微孢子蟲的感染。本發明還提供了含有該探針的試劑盒，該試劑盒特異性好，操作簡便，能直觀地將病原檢測與病理變化結合起來；在高效、準確檢測螺原體的同時，由樣本切片上分析感染率和感染強度；由于探針與18S？SSU？rDNA的雜交是特異的，且信號經過了逐級放大，所以較常規的染色觀察檢測靈敏、精確；而且檢測結果雜交顯色后的切片可長期保存。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105177165
【申請號】
【發明人】丁正峰, 薛暉, 劉洪巖, 孫夢玲, 趙彥華
【申請人】江蘇省淡水水產研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月26日