一株產α-L-鼠李糖苷酶的菌株及采用該菌株發酵生產α-L-鼠李糖苷酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株產α-L-鼠李糖苷酶的菌株，及采用該菌株發酵生產α-L-鼠李糖苷酶的方法，具體涉及一種互隔交鏈孢(Al ternaria al terna ta ) SK37.002生產a -L-鼠李糖苷酶的方法，屬于食品生物技術領域。
【背景技術】
[0002]a -L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是一種水解酶，它能夠水解結合于底物末端非還原性的a -L-鼠李糖苷鍵，同時釋放出鼠李糖和相應的配基。a -L-鼠李糖苷酶的來源比較廣，廣泛分布于自然界的細菌和真菌、動物肝臟中，另外a-L-鼠李糖苷酶是植物細胞壁果膠多糖、糖蛋白以及二級代謝物如花青苷、類黃酮和三萜烯類等化合物的一種組分，也常存在于細菌雜多糖、鼠李糖脂和細菌外膜脂多糖抗原結構的重復單位中。
[0003]a -L-鼠李糖苷酶在食品中的應用主要是改善飲料和酒的香氣成分和生產食品添加劑。很多水果都含有柚皮苷、橘皮苷、云香苷和萜烯基糖苷等黃酮苷類化合物。a-L-鼠李糖苷酶可以水解蕓香科水果中的柚皮苷和檸檬苦素以去除果汁中的苦味，從而使果汁酸甜可口，口味宜人。a -L-鼠李糖苷酶還可以提高黃酮類化合物的生物利用度，可用于生產功能飲料。a -L-鼠李糖苷酶可以水解橘皮苷生產甜味劑的前體物，使食品獲得新的高聚物成分從而改善食品的流變特性，因而在食品添加劑中具有重要作用。
[0004]迄今為止，由于菌種、發酵條件等限制，a -L-鼠李糖苷酶仍未大規模生產，因此純酶價格昂貴，限制了該酶的應用發展。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服上述不足之處，提供一株產a -L-鼠李糖苷酶的菌株及采用該菌株發酵生產a -L-鼠李糖苷酶的方法。
[0006]本發明的技術方案:一株產a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分類命名為互隔交鏈孢{Al ternaria al terna ta ) SK 37.002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2015 年 5 月 17 日，保藏編號為 CCTCC NO:M 2015309。
[0007]所述產a-L-鼠李糖苷酶的菌株，該菌株的核糖體DNA ITS序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]用所述產a -L-鼠李糖苷酶的菌株發酵生產a -L-鼠李糖苷酶的方法，步驟為:以柚皮苷和鹿糖為碳源的發酵培養基中對互隔交鏈孢(WJferaaria alternata),CCXCC NO:M2015309進行發酵，以得到含有a -L-鼠李糖苷酶的菌體；然后對含a -L-鼠李糖苷酶的菌體進行破碎，最后對a -L-鼠李糖苷酶進行分離純化。
[0009]具體步驟為:
(l)a-L-鼠李糖苷酶的制備:對互隔交鏈孢CCTCC NO:M 2015309，進行斜面、種子、發酵三級培養生產，培養基各組分以g/L計: a、斜面培養:采用PDA培養基:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15~20，pH自然，使用去離子水配制，115°C滅菌30min ;斜面培養條件為:培養溫度25~35°C，培養時間3~8天；
b、種子培養:種子培養基=NaNO32，K2HPO4 LKCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖 30，pH自然，使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;種子培養條件:于30°C、200rpm搖床培養12h ；
c、發酵培養:發酵培養基:柚皮苷1，蔗糖5，硝酸鈉5，磷酸氫二鉀0.8，氯化鈣0.7，氯化鉀0.5，硫酸鎂0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;發酵條件:接種量5%、轉速200rpm、溫度30°C的條件下在發酵培養基中發酵4_5d，得到a -L-鼠李糖苷酶菌體；
(2)a -L-鼠李糖苷酶的純化:對步驟(I)所得a -L-鼠李糖苷酶菌體進行菌體過濾、洗滌，在緩沖液中溶解后采用1cm探頭超聲破碎10min，10000r/min離心lOmin，采用20%~70%硫酸銨分離沉淀目的蛋白，緩沖液透析，DEAE-FF 16/10離子交換層析，Superdex75凝膠過濾層析后，最后將得到的液體冷凍干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
[0010]本發明中的a -L-鼠李糖苷酶，是通過使酶作用于柚皮苷，分解柚皮苷的消耗量。該酶的單位定義為在酶反應條件下每分鐘消耗I μ g柚皮苷的量。
[0011]本發明的有益效果:本發明為首次報道互隔交鏈孢(Wteraaria al terna ta )作為a -L-鼠李糖苷酶的產生菌。該菌株培養方便；發酵工藝簡單；酶活高，酶性質穩定；具有廣闊的市場應用前景。
[0012]生物材料樣品保藏:一株產a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分類命名為互隔交鏈孢(Al ternaria al terna ta ) SK 37.002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址:中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2015309，保藏日期2015年5月17日。
【具體實施方式】
[0013]以下是互隔交鏈孢(Wteraaria al terna ta ) SK 37.002進行發酵產a-L-鼠李糖苷酶的實施例，但本發明的技術范圍并不限于所列出的幾個實例，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進行實施。另外，本發明的技術范圍延及均等的范圍。
[0014]實施例1
將互隔交鏈孢al terna ta ) SK 37.002在下述條件下進行發酵:
斜面培養:采用PDA培養基(各組分以g/L計):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15~20，pH自然，使用去離子水配制，115°C滅菌30min。培養條件為:培養溫度25~35°C，培養時間3~8天;
種子培養:采用種子培養基(各組分以g/L計)=NaNO3 2, K2HPO4 LKCl 0.5, MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖30，pH自然，使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;種子培養條件:于30°C、200rpm 搖床培養 12h ；
發酵培養:采用發酵培養基(各組分以g/L計):柚皮苷1，蔗糖5，硝酸鈉5，磷酸氫二鉀0.8，氯化鈣0.7，氯化鉀0.5，硫酸鎂0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;發酵條件:接種量5%，轉速200rpm、溫度30°C的條件下在發酵培養基中發酵4-5d，得到含a -L-鼠李糖苷酶的菌體；
實施例2 a -L-鼠李糖苷酶酶粉制備: 將實施例1所得含a -L-鼠李糖苷酶的菌體過濾、洗滌，在緩沖液中溶解后采用1cm探頭超聲破碎lOmin，10000r/min離心lOmin，采用20%~70%硫酸錢分離沉淀目的蛋白，緩沖液透析，DEAE-FF 16/10離子交換層析，Superdex 75凝膠過濾層析后，最后將得到的液體冷凍干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
【主權項】
1.一株產a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分類命名為互隔交鏈孢(AJ ternariaalternata ) SK 37.002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2015309。2.根據權利要求1所述產a-L-鼠李糖苷酶的菌株，其特征在于該菌株的核糖體DNAITS序列如SEQ ID N0.1所示。3.用權利要求1或2所述產a-L-鼠李糖苷酶的菌株發酵生產a -L-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于步驟為:以柚皮苷和蔗糖為碳源的發酵培養基中對互隔交鏈孢CCTCC NO:Μ2015309進行發酵，以得到含有a -L-鼠李糖苷酶的菌體；然后對含a -L-鼠李糖苷酶的菌體進行破碎，最后對a -L-鼠李糖苷酶進行分離純化。4.根據權利要求3所述用產a-L-鼠李糖苷酶的菌株發酵生產a -L-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于具體步驟為: (1)α-L-鼠李糖苷酶的制備:對互隔交鏈孢CCTCC NO:Μ 2015309，進行斜面、種子、發酵三級培養生產，培養基各組分以g/L計: a、斜面培養:采用PDA培養基:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15~20，pH自然，使用去離子水配制，115°C滅菌30min ;斜面培養條件為:培養溫度25~35°C，培養時間3~8天； b、種子培養:種子培養基=NaNO32，K2HPO4 LKCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖 30，pH自然，使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;種子培養條件:于30°C、200rpm搖床培養12h ； C、發酵培養:發酵培養基:柚皮苷1，蔗糖5，NaNO3 5，K2HPO4 0.8，CaCl 0.7，KCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去離子水配制，121°C滅菌20 min ;發酵條件:接種量5%、轉速200rpm、溫度30°C的條件下在發酵培養基中發酵4-5d，得到含a -L-鼠李糖苷酶的菌體； (2)a -L-鼠李糖苷酶的純化:對步驟(I)所得含a -L-鼠李糖苷酶的菌體進行菌體過濾、洗滌，在緩沖液中溶解后采用1cm探頭超聲破碎10min，10000r/min離心lOmin，20%~70%硫酸銨分離沉淀目的蛋白，緩沖液透析，DEAE-FF 16/10離子交換層析，Superdex75凝膠過濾層析后，最后將得到的液體冷凍干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
【專利摘要】一株產α-L-鼠李糖苷酶的菌株及采用該菌株發酵生產α-L-鼠李糖苷酶的方法，屬于食品生物技術領域。本發明公開一株產α-L-鼠李糖苷酶的菌株，其分類命名為互隔交鏈孢（<i>Alternaria</i><i>？alternata</i>？）SK？37.002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC？NO：M？2015309。本發明以蔗糖、柚皮苷為碳源的發酵培養基對互隔交鏈孢（<i>Alternaria</i><i>？alternata</i>？）SK37.002，即CCTCC？NO：M？2015309進行發酵，得到含有α-L-鼠李糖苷酶的菌體；然后對菌體進行破碎和α-L-鼠李糖苷酶進行分離純化。本發明生產的α-L-鼠李糖苷酶安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產品，被廣泛地應用于食品、醫藥、生物等行業。本發明能高效地生產α-L-鼠李糖苷酶，適于進行大規模生產。CCTCC NO：M 201530920150517
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/645, C12N9/24
【公開號】CN105176843
【申請號】
【發明人】張濤, 江波, 袁文博, 沐萬孟, 繆銘
【申請人】江南大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月22日