一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于功能高分子與蛋白質工程技術領域，具體涉及一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法。
【背景技術】
[0002]胰蛋白酶是存在于動物胰臟中的一類蛋白水解酶，是一種堿性蛋白質。其屬于肽鏈內切酶，對肽鏈中的精氨酸、賴氨酸的肽鍵處具有選擇性的水解作用，能夠把各類蛋白質水解為多肽或氨基酸。胰蛋白酶不僅在食品、醫藥、工業上有著重要及廣泛的應用，還在蛋白質的測序及序列分析上有著廣闊的應用。
[0003]胰蛋白酶由動物胰臟中提取，然后再進行分離純化。在蛋白質的各種分離純化技術中，吸附法具有簡便、高效與低成本的優點。由于堿性蛋白質在一般的pH條件下，其大分子鏈攜帶正電荷，故分離堿性蛋白質常用的吸附材料為陽離子交換樹脂。陽離子交換樹脂雖然對堿性蛋白質可產生吸附作用，但在水介質中只能發生一定程度的溶脹，對蛋白質大分子鏈的吸附不但傳質阻力大，而且吸附容量受限。
[0004]對于水介質中蛋白質的吸附而言，具有聚電解質接枝刷結構的固體微粒是最適合的固體材料[Wang S-Y, Chen K-M, Kayitmazer A B, Li L, Guo X-H.Colloids andSurfaces B: B1interfaces, 107 (2013) 251 - 256]。在水介質中，聚電解質接枝刷可以充分地伸展開來，從而可與蛋白質大分子鏈保持充分接觸，憑借主-客體之間的強靜電相互作用力，對蛋白質發生高效的吸附作用，而且還能維持蛋白質的構象，保持蛋白質的功能[Wittemann A, Ballauff M.Analytical Chemistry, 76 (2004) 2813 - 2819]ο
【發明內容】
[0005]針對上述現狀，本發明的目的在于提供一種新型的、具有接枝刷結構的固體吸附微球的制備方法，使其制備的吸附微球具有良好的吸附胰蛋白酶的特性，同時還能夠維持其構象，保持其功能。
[0006]為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是，提供一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，通過甲基丙烯酰氯與羥基之間快速的酯化反應，使在聚乙烯醇微球表面形成大量的可聚合的雙鍵；利用在水溶液中過硫酸銨/亞硫酸氫鈉氧化還原引發體系作用下，使微球表面的雙鍵與水溶液中對苯乙烯磺酸鈉之間發生聚合反應，簡捷地實現單體對苯乙烯磺酸鈉在微球表面發生接枝聚合，快捷地制得了接枝吸附微球CPVA-^PSSS。
[0007]—種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，具體步驟如下:
步驟一，將含有4%?9%的交聯聚乙烯醇微球浸泡在無水丙酮溶液中12h，使微球充分的溶脹，然后再加入5%?10%的甲基丙烯酰氯以及一定量的縛酸劑無水碳酸鈉，在30°C?45°C條件下反應6h?12h。制得表面鍵合有大量可聚合雙鍵的改性微球。
[0008]步驟二，在裝有攪拌器、冷凝管及溫度計的四口燒瓶中，加入含量為0.5%?2%的改性微球MA0-CPVA，在蒸餾水中浸泡溶脹12 h ;然后加入10%?20%的對苯乙烯磺酸鈉333，通N2氣30min以排除空氣；升溫至25°C?40°C后，再加入0.05%?0.1%的亞硫酸氫鈉和0.1%?0.2%的過硫酸銨，攪拌并在隊保護條件下使對苯乙烯磺酸鈉SSS發生接枝聚合反應Sh?14h。反應結束后，過濾、蒸餾水沖洗，然后真空干燥至恒重，得到接枝吸附微球CPVA-廣PSSS0
[0009]本發明的有益效果是:所制備的具有接枝刷結構的固體吸附微粒，吸附微球CPVA-^PSSS上充分伸展開的陰離子聚電解質接枝刷可與胰蛋白酶分子保持充分的接觸，憑借兩者之間的強靜電相互作用力，對胰蛋白酶產生高效的吸附作用，同時還能夠維持胰蛋白酶的構象，保持其功能。本發明的研究結果為胰蛋白酶的分離純化提供了新的方法，在胰蛋白酶的分離與純化領域具有積極的參考價值。
【附圖說明】
[0010]圖1是改性微球MAO-CPVA化學反應過程；
圖2是接枝微球CPVA-^PSSS化學反應過程。
【具體實施方式】
[0011]如圖1、2所示，以具體實施例對制備方法進行說明。
[0012]實施例1
將2 g交聯微球CPVA置于40 mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶脹，加入2 mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量縛酸劑碳酸鈉，恒溫于40 °C，使MAC的酰氯基團與CPVA微球表面的羥基發生酯化反應，8 h后結束反應，制得表面鍵合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA0
[0013]在裝有攪拌器、冷凝管及溫度計的四口燒瓶中，加入65 mL蒸餾水和0.5 g改性微球MAO-CPVA浸泡溶脹12h ;然后加入9.8 g對苯乙烯磺酸鈉SSS，通N2氣30min以排除空氣；升溫至35 °C后，再加入0.049 g亞硫酸氫鈉和0.098 g過硫酸銨，攪拌并在隊保護條件下使SSS發生接枝聚合反應10 h后結束反應；過濾收集產物微球，然后用蒸餾水反復洗滌，真空干燥至恒重，即制備得到接枝吸附微球CPVA-^PSSS，接枝度為17mg/g。
[0014]實施例2
將4 g交聯微球CPVA置于60mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶脹，加入5 mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量縛酸劑碳酸鈉，恒溫于35 °C，使MAC的酰氯基團與CPVA微球表面的羥基發生酯化反應，10 h后結束反應，制得表面鍵合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA0
[0015]在裝有攪拌器、冷凝管及溫度計的四口燒瓶中，加入80 mL蒸餾水和2g改性微球MAO-CPVA浸泡溶脹12 h ;然后加入18 g對苯乙烯磺酸鈉氣30min以排除空氣；升溫至30°C后，再加入0.09g亞硫酸氫鈉和0.17 g過硫酸銨，攪拌并在N2保護條件下使SSS發生接枝聚合反應14 h后結束反應；過濾收集產物微球，然后用蒸餾水反復洗滌，真空干燥至恒重，即制備得到接枝吸附微球CPVA-^PSSS，接枝度為15.5mg/go
[0016]實施例3
將3 g交聯微球CPVA置于55 mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶脹，加入5 mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量縛酸劑碳酸鈉，恒溫于30 °C，使MAC的酰氯基團與CPVA微球表面的羥基發生酯化反應，12 h后結束反應，制得表面鍵合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA0
[0017]在裝有攪拌器、冷凝管及溫度計的四口燒瓶中，加入SOmL蒸餾水和I g改性微球MAO-CPVA浸泡溶脹12h ;然后加入15 g對苯乙烯磺酸鈉555，通N2氣30min以排除空氣；升溫至40°C后，再加入0.055 g亞硫酸氫鈉和0.12 g過硫酸銨，攪拌并在N2保護條件下使SSS發生接枝聚合反應8 h后結束反應；過濾收集產物微球，然后用蒸餾水反復洗滌，真空干燥至恒重，即制備得到接枝吸附微球CPVA-^PSSS，接枝度為16mg/g。
[0018]將20 mL濃度不同的胰蛋白酶磷酸鹽緩沖液分別置于若干個50 mL的具塞錐形瓶中，加入準確稱取的質量為0.05 g的功能接枝微球CPVA-^PSSS，于25 °(:恒溫振蕩6.5 h后，離心分離，測定上清液中胰蛋白酶的濃度，計算得接枝微球CPVA-^PSSS對胰蛋白酶的飽和吸附量為66mg/g。
[0019]經過對吸附性能的測試可明確利用本發明所提供的制備方法所制備的接枝微球CPVA-^PSSS吸附效率高，為胰蛋白酶的分離純化提供了新的方法，在胰蛋白酶的分離與純化領域具有積極的參考價值，同時也可類比本領域內其他蛋白酶的吸附微粒的制備。以上雖然已參照典型實施例描述了本申請，但應當理解，所用的術語是說明和示例性、而非限制性的術語。由于本申請能夠以多種形式具體實施而不脫離發明的精神和實在，所以應當理解，上述實施例不限于任何前述的細節，而應在隨附權利要求所限定的精神和范圍內廣泛地解釋，因此落入權利要求或其等效范圍內的全部變化和調整都應為隨附權利要求所涵至
ΠΠ ο
【主權項】
1.一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，其步驟如下: 步驟一，使交聯聚乙烯醇微球在無水丙酮中浸泡數小時，使其充分溶脹后，使其與甲基丙烯酰氯及定量的縛酸劑發生酯化反應，從而形成表面含有大量可聚合雙鍵的改性微球MAO-CPVA ； 步驟二，將改性微球MAO-CPVA浸泡在裝有蒸餾水的四口瓶中數小時，再加入對苯乙烯磺酸鈉，然后通氮氣以排除空氣；將亞硫酸氫鈉、過硫酸銨分別加入到上述體系中，在一定溫度下進行接枝聚合反應數小時，過濾后用蒸餾水沖洗，然后烘干至恒重，得到具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球CPVA-^PSSS。2.根據權利要求1所述一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，其特征在于:步驟一中所述交聯聚乙烯醇微球的含量為4~9%，交聯聚乙烯醇溶脹時間為12h ;所述甲基丙烯酰氯的含量為5~10% ;所述縛酸劑選用無水碳酸鈉；所述酯化反應溫度為30~45°C，反應時間為6~12h。3.根據權利要求1所述一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，其特征在于:步驟二中所述改性微球MAO-CPVA的含量為0.5~2%，對苯乙烯磺酸鈉的含量為10~20% ；所述反應溫度為25~40°C，反應時間為8~14h ;所述體系中亞硫酸氫鈉含量為0.05-0.1%，過硫酸銨含量為0.1-0.2%。
【專利摘要】本發明屬于功能高分子與蛋白質工程技術領域，提供了一種具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制備方法，通過甲基丙烯酰氯與羥基之間快速的酯化反應，使在聚乙烯醇微球表面形成大量的可聚合的雙鍵；利用在水溶液中過硫酸銨/亞硫酸氫鈉氧化還原引發體系作用下，使微球表面的雙鍵與水溶液中對苯乙烯磺酸鈉之間發生聚合反應，簡捷地實現單體對苯乙烯磺酸鈉在微球表面發生接枝聚合，快捷地制得了接枝吸附微球CPVA-<i>g</i>-PSSS。該吸附微球可以簡便、高效的分離提取胰蛋白酶，對于胰蛋白酶的分離提取具有積極的參考價值。
【IPC分類】B01J20/26, B01J20/28, B01J13/14, B01J20/30, C12N9/76, C08F8/14, C08F261/04, C08F16/06, C08F212/14, C08F4/40
【公開號】CN105175639
【申請號】
【發明人】陳濤, 高寶嬌, 史楠
【申請人】中北大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年11月2日