一種從鈍頂螺旋藻制備高純度葉綠三酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及光動力學療法天然光敏劑技術領域，尤其涉及一種第二代光敏劑葉綠三酸Chlorin e6的高效高純度制備方法。
【背景技術】
[0002]葉綠三酸Chlorin e6及其衍生物屬于光動力學療法的第二代光敏劑。Chlorine6是源自葉綠素的天然分子，具有光激發三線態壽命長，在可見光的紅區具有較高的摩爾吸光系數，與其他卟啉類光敏劑相比價格低廉，其研究應用處于臨床試驗階段。
[0003]Chlorin e6 一般通過葉綠素a堿性水解轉化獲得，商品化的Chlorin e6的制備方法中涉及葉綠素的柱層析法分離提純，葉綠素a的得率較低，獲得的Chlorin e6純度一般93%?98%。
[0004]本發明不需要采用柱層析法分離提純葉綠素或葉綠三酸，無柱層析損失，葉綠素a利用效率高，最終獲得的葉綠三酸Chlorin e6產率高。
[0005]鈍頂螺旋藻是藍藻的一種，本發明以鈍頂螺旋藻為原料，制備的Chlorin e6不含葉綠素a以外的其它葉綠素轉化的葉綠酸，HPLC純度大于99.5%。
【發明內容】
[0006]本發明針對商品化葉綠三酸Chlorin e6產率和純度較低的問題，提出了一種高效高純度Chlorin e6的制備方法。
[0007]本發明采取的技術方案是:
[0008]本發明高純度葉綠三酸Chlorin e6制備方法的具體步驟如下:
[0009]⑴以培養至對數生長期末期的鈍頂螺旋藻為原料，離心收集藻體。
[0010]⑵藻體用乙醇萃取數次，萃取液合并。
[0011]⑶萃取液中加入適量石油醚(沸程60?90°C )混勻，再加入萃取液1/5?1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復萃取數次，含色素的石油醚相用水一乙醇溶液(體積比1:1)洗滌數次。
[0012]⑷石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液，攪拌反應0.5?6h。
[0013](5)往上述混合液中加入去離子水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌數次，至洗滌液無色。
[0014](6)滴加5mol/L鹽酸中和，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌數次。
[0015](7)沉淀用少量去離子水分散懸浮，_80°C速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末。
[0016]⑶在上述步驟(6)中，5mol/L鹽酸中和后，加入二氯甲烷溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數次。
[0017](9)采用旋轉蒸發的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorin e6固體。
[0018]本發明制備的Chlorin e6不含葉綠素a以外的其它葉綠素轉化的葉綠酸，HPLC純度大于99.5% ο
【附圖說明】
[0019]圖1為實施例4所得葉綠三酸Chlorin e6的結構圖。
[0020]圖2為實施例4堿催化反應后石油醚相類胡蘿卜素溶液的吸收光譜。
[0021]圖3為實施例4堿催化反應后水-乙醇相含鎂葉綠三酸鈉鹽的吸收光譜。
[0022]圖4為實施例4所得產品葉綠三酸鈉鹽乙醇溶液的吸收光譜。
[0023]圖5為實施例4所得產品葉綠三酸乙醇溶液的吸收光譜圖。
[0024]圖6為實施例4所得產品的基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALD1-T0F)質譜圖。基質中的三氟乙酸使得葉綠三酸帶正電，分子離子峰([M+H]+)的質荷比m/z為597.541，與葉氯三酸的理論分子量596.67 一致。
【具體實施方式】
[0025]下面的實施例是對本發明的進一步描述。
[0026]實施例1
[0027]本發明的高純度葉綠三酸Chlorin e6的制備方法的具體步驟如下:
[0028]取生長至對數生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在I個離心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0029]萃取液中加入20mL石油醚(沸程60?90°C )混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復萃取兩次，含色素的石油醚相用20mL水一乙醇溶液(體積比1:1)洗滌兩次。
[0030]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，攪拌反應0.5h。
[0031]往上述混合液中加入1mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。
[0032]滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌兩次。
[0033]沉淀用少量去離子水分散懸浮，_80°C速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorin e6固體粉末。
[0034]實施例2
[0035]本發明的高純度葉綠三酸Chlorin e6的制備方法的具體步驟如下:
[0036]取生長至對數生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在I個離心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0037]萃取液中加入15mL石油醚(沸程60?90°C )混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復萃取兩次，含色素的石油醚相用0.5mol/L NaOH的水一乙醇溶液(體積比1:1) 15mL快速洗滌兩次。
[0038]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，攪拌反應2h。
[0039]往上述混合液中加入1mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。
[0040]滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌兩次。
[0041]沉淀用少量去離子水分散懸浮，_80°C速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorin e6固體粉末。
[0042]實施例3
[0043]本發明的高純度葉綠三酸Chlorin e6的制備方法的具體步驟如下:
[0044]取生長至對數生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在I個離心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0045]萃取液中加入20mL石油醚(沸程60?90°C )混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復萃取兩次，含色素的石油醚相用20mL水一乙醇溶液(體積比1:1)洗滌兩次。
[0046]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，攪拌反應3h。
[0047]往上述混合液中加入1mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。
[0048]滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，加入二氯甲燒溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數次。
[0049]采用旋轉蒸發的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorin e6固體。
[0050]實施例4
[0051]本發明的高純度葉綠三酸Chlorin e6的制備方法的具體步驟如下:
[0052]取生長至對數生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在I個離心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0053]萃取液中加入15mL石油醚(沸程60?90°C )混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復萃取兩次，含色素的石油醚相用0.5mol/L NaOH的水一乙醇溶液(體積比1:1) 15mL快速洗滌兩次。
[0054]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，攪拌反應6h。
[0055]往上述混合液中加入1mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。
[0056]滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，加入二氯甲燒溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數次。
[0057]采用旋轉蒸發的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorin e6固體。
[0058]盡管已經示出了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以根據上述說明對這些實施例進行改進或變換，而這些改進或變換都應屬于本發明所述權利要求的保護范圍。
【主權項】
1.一種制備葉綠三酸的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)以鈍頂螺旋藻為原料，離心收集藻體，藻體用乙醇萃取數次，每次萃取10?30min，萃取液合并； (2)萃取液中加入石油醚混勻，再加入萃取液1/5?1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，上層含色素的石油醚相用水一乙醇溶液洗滌數次； (3)石油醚萃取液中加入lmol/LNaOH的95%乙醇溶液，攪拌反應0.5?6h ; (4)往上述混合液中加入去離子水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水一乙醇溶液用石油醚洗滌數次，至洗滌液無色； (5)滴加5mol/L鹽酸中和至微酸性，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌數次； (6)沉淀用去離子水分散懸浮，_80°C速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(5)中用5mol/L鹽酸中和至微酸性后，加入二氯甲烷溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數次。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟￠)中還包括采用旋轉蒸發的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorin e6固體。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述鈍頂螺旋藻為培養至對數生長期末期的鈍頂螺旋藻。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述石油醚的沸程為60?90°C。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中水一乙醇溶液的水與乙醇的體積比約為1:1。7.如權利要求1和2所述的方法，其特征在于:所述微酸性是指pH值的范圍約為5?6o8.如權利要求1-7所述的方法，其特征在于:獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末不含葉綠素a以外的其它葉綠素轉化的葉綠酸，純度大于99.5%。
【專利摘要】本發明公開了一種從新鮮鈍頂螺旋藻制備高純度葉綠三酸Chlorin？e6的方法，所述方法的步驟如下：(1)以乙醇為溶劑從鈍頂螺旋藻中萃取色素，萃取液中加入適量石油醚混勻，再加水分相，旋蕩后進行反萃取，用石油醚重復萃取數次；(2)石油醚相用水－乙醇溶液洗滌數次；(3)石油醚萃取液中加入NaOH的95％乙醇溶液，攪拌反應；(4)往上述混合液中加水，旋蕩后靜置分離，下層水－乙醇溶液用石油醚洗滌數次；(5)滴加鹽酸中和至微酸性，離心分離沉淀或用二氯甲烷萃取，沉淀用少量去離子水分散懸浮后冷凍干燥，或二氯甲烷溶液旋轉蒸發回收溶劑，即可獲得高純度的葉綠三酸Chlorin？e6固體。本發明制備的Chlorin？e6不含其它葉綠酸，HPLC純度大于99.5％。
【IPC分類】C07D487/22
【公開號】CN105175425
【申請號】
【發明人】于道永, 李泉, 李富強, 吳晨露, 張宏玉, 葛保勝, 黃方
【申請人】中國石油大學(華東)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月10日