一種抑制小麥矮腥黑穗病菌生長的化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學結構與細菌的生物活性之間的關系， 更具體的說，是探索化合物對小麥矮腥黑穗病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術】
[0002] 小麥矮腥黑穗病菌屬真菌界、擔子菌亞門、冬孢菌綱、黑粉菌目、腥黒粉菌科、腥黑 粉菌屬。小麥矮腥黑穗病菌在土壤中具有保持多年侵染活性的特點。在無寄主的田間，存 在于土壤中的菌癭，其存活期為4~7年；存在于土表的菌癭，10年之后其中部分孢子仍有萌 發活性。置于土表和埋入土壤中的菌癭萌發率分別達到50%和30%，但埋入土內的分散的冬 孢子經1年后僅有少量萌發，2年后僅有痕量萌發，由此可見，在菌癭內部的小麥矮腥黑穗 病菌冬孢子對不良環境具有更強的抗性。
[0003] 在倉儲條件下，存在于糧食中的小麥矮腥黑穗病菌菌癭碎片經4年后萌發率可達 到34%，含有小麥矮腥黑穗病菌冬孢子的飼料經過家禽類的消化道后存活率平均約為30%。 由此可見，小麥矮腥黑穗病菌冬孢子在不利條件下仍能頑強的存活，加工后的病麥麥麩、下 腳料和農家肥等均含有一定數量的有萌發活性的冬孢子，增加了小麥矮腥黑穗病菌傳播的 機會。
[0004] 散落在田間的小麥矮腥黑穗病菌菌癭和冬孢子是主要的侵染源，同時疫麥加工后 的麩皮、下腳料和洗麥水進入大田也可造成下一年的侵染，粘附在種子表面和混在種子中 的菌癭播種后成為重要的侵染源，染菌的糧食通過出口可以進行遠距離傳播，包裝材料，容 器和運輸工具都可能攜帶病菌，一旦這些病菌進入有寄主的田間，在環境適宜的條件下，冬 孢子萌發后侵入寄主幼苗而引起系統發病。
[0005] 從病三角可以知道，小麥矮腥黑穗病菌侵染需要3個條件，適宜的環境條件；易感 病的寄主；一定數量的有活性的病原菌。通常認為，小麥矮腥黑穗病菌在長期持續的積雪條 件下才可萌發，但這種說法仍存在分歧。
[0006] 不同品種的冬小麥對小麥矮腥黑穗病菌存在著感病性和抗病性的差異。通過人工 接種發現，對易感品種，小麥矮腥黑穗病菌侵染菌絲經芽鞘進入葉原基，而后進入莖節到達 頂端分生組織和分蘗原始細胞，當小麥生長時，病菌菌絲隨同小麥一起生長，在小麥孕穗期 侵入花序，最終形成菌癭而取代整個麥粒。小麥矮腥黑穗病菌侵染菌絲侵入中抗品種后，在 第一及第二葉原基中活動，始終未進入蓮節頂端分生組織，寄主成熟時不發病。對于高抗品 種，菌絲體活動只在第一及第二葉原基，始終遠離壟節分生組織，寄主成熟時無病穗。通過 對易感小麥品種實驗表明，如果病菌侵染發生在小麥生長的初葉期至幼蘗期，則侵染率較 高。在麥株逐漸長大時，致病菌侵入分蘗鞘后，難以抵達分蘗原始細胞，因此在麥苗生長后 期小麥矮腥黑穗病菌的發病率明顯降低。
[0007] 小麥矮腥黑穗病菌雖然可以引起春麥發病，但在小麥矮腥黑穗病發生區，從來沒 有春麥發病的報告，因此小麥矮腥黑穗病菌主要侵染對象為冬小麥。
[0008] 小麥矮腥黒穗病菌是麥類黒穗病中危害最大又極難防治的病害，通常發病率等于 產量損失率，該病在美國西部7個州發病較重，一般流行年份小麥減產20%~50%，嚴重時可 高達75%，甚至絕產。1972年美國西北部7個州發病面積為24萬hm2,均減產17%，損失小 麥1. 2萬kg。
【發明內容】
[0009] 本發明采用體外抗菌試驗，研究化合物對小麥矮腥黑穗病菌的生物活性。
[0010] 本發明的具體技術方案如下： 本發明的創新點是發現化合物對小麥矮腥黑穗病菌有良好的抑菌和殺菌活性，并測量 得到其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0011] 所述化合物結構特征如下式所示：
【具體實施方式】
[0012] 下面結合具體實施實例，進一步詳細地說明本發明。應理解下面實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明范圍。
[0013] 實施實例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0014] (1)營養肉湯的配制：取營養肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0015] (2)營養瓊脂固體培養基的配制：取營養瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0016] (3)菌株的培養：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環挑取一個菌落，加到液體培養基中，放于培養箱內培養，細 菌培養24h，培養溫度為16°C。
[0017] (4)菌液配制及計數：將培養后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養基稀釋，并 用血球計數板在顯微鏡上初步觀察計數，然后將菌液用液體培養基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數法進行計數，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養基的平皿中，培養24h，培養溫度為16°C。培養后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。
[0018] 計算公式為：菌液濃度=nX20X100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0019] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0020] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為1~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于16°C培養24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC，每個實驗重復三次。
[0021] 測得最小抑菌濃度MIC值為1yg/mL。
[0022] 實施實例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0023] (1)營養肉湯的配制：取營養肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0024] (2)營養瓊脂固體培養基的配制：取營養瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0025] (3)菌株的培養：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環挑取一個菌落，加到液體培養基中，放于培養箱內培養，細 菌培養24h，培養溫度為16°C。
[0026] (4)菌液配制及計數：將培養后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養基稀釋，并 用血球計數板在顯微鏡上初步觀察計數，然后將菌液用液體培養基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數法進行計數，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養基的平皿中，培養24h，培養溫度為16°C。培養后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數；計算公式為：菌液濃 度=nX20X100cfu/mL。
[0027] ( 5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0028] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基礎上，從每管吸取 10yL溶液，點于固體培養基上，繼續按MIC培養條件下培養，以完全殺滅細菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數小于等于5)。
[0029] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為l~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于16°C培養24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC。將上述未見生長細菌的各孔中的肉湯取 10yL接種于營養瓊脂平板上，做好標記，于16°C培養24h，以仍無細菌生長的管內藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實驗重復三次。
[0030] 測得最小殺菌濃度MBC值為2yg/mL。
【主權項】
1. 一種抑制小麥矮腥黑穗病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結構特征如下式所示：(2) 其可作為小麥矮腥黑穗病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對小麥矮腥黑穗病菌的最小抑菌濃度MIC值為1 μ g/mL ; (4) 其對小麥矮腥黑穗病菌的最小殺菌濃度MBC值為2 μ g/mL。
【專利摘要】本發明發現對小麥矮腥黑穗病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其小麥矮腥黑穗病菌的最小抑菌濃度MIC值為1μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為2μg/mL。
【IPC分類】A01P1/00, A01N43/86, A01P3/00
【公開號】CN105165849
【申請號】
【發明人】不公告發明人
【申請人】許自協
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年11月2日