一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，特別是涉及一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法。
【背景技術】
[0002]植物來源的天然產物曾是藥物或其先導化合物的主要來源，但因天然植物生長緩慢、活性成分含量低，致使這類化合物的來源難以得到保障，難以滿足現實需求。為了解決這個矛盾，科學工作者進行了廣泛研究，主要集中在以下幾方面:(I)采用化學方法進行全合成；(2)以容易獲得的化工原料或天然前體為基礎，半合成某些結構復雜的化合物；(3)在微生物中表達天然產物的合成途徑，采用基因工程技術發酵方式生產某些活性成分；(4)植物組織培養，定向生產目標成分。盡管這些方法都已有許多成功的案例，然而，由于很多天然產物化學結構非常復雜和獨特，涉及的生物合成途徑也非常多，而且生物合成多涉及一系列繁雜的酶促反應，化學合成則常常需要多達數十步反應；植物培養技術在適應工業化生產過程中，也面臨著很多問題:如脫分化細胞中的二次代謝產物豐度非常低，甚至根本沒有；植物細胞長期培養時，由于細胞不均一、基因突變、環境因素影響等原因，其生理、生化以及遺傳性狀逐漸發生變化等等。
[0003]由韓國和英國學者開發的植物分生組織細胞(干細胞)培養技術，為解決上述問題提供了一個全新的方案。根據目標干細胞的不同，目前較為成功的植物分生組織細胞(干細胞)培養方法主要有以下幾種:紅豆杉維管形成層分生組織細胞，人參儲藏根的維管形成層分生組織細胞，水稻、玉米的靜止中心。
[0004]大蒜作為一種可食用或供調味，亦可入藥的重要經濟作物，關于它的分生組織細胞的分離及培養目前尚未見報道。
【發明內容】
[0005]發明目的:為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，即建立一種采用大蒜未分裂的鱗莖分生組織細胞進行無限增殖的方法。
[0006]技術方案:為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0007]一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，包括如下步驟:
[0008]I)大蒜鱗莖分生組織細胞分離
[0009]大蒜鱗莖洗凈去皮，經乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生組織細胞，接種于培養基上;
[0010]2)大蒜鱗莖分生組織細胞培養
[0011]所述培養基是以去硫酸銨的1/2B5培養基為基礎，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗壞血酸、檸檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、結冷膠而制成；培養條件為在25°C下避光培養。結冷膠是一種凝膠，作用就是支撐，使液體培養基成為固體培養基。
[0012]進一步的，在本發明中，所述步驟I)中具體的方法為:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升汞浸泡1min ;在經過去皮、乙醇消毒、汞浸泡步驟后均用無菌水沖洗。
[0013]進一步的，在本發明中，所述步驟I)中，沿縱軸切開大蒜鱗莖的蒜瓣，切取所述大蒜鱗莖基部分生組織細胞。
[0014]進一步的，在本發明中，所述步驟2)中，所述培養基添加的物質為:I?2mg/L毒莠定、0.01 %活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗壞血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%結冷膠。
[0015]進一步的，在本發明中，所述培養條件為:25 °C下避光培養，首次培養一個月后，每兩周繼代一次。
[0016]有益效果:本發明提供的一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，是一種新的培養方法，這種技術在大蒜的領域至今沒有應用，可作為一種技術儲備，用于新的其他研究應用用途。主要目的是建立植物細胞銀行，這不僅可以為植物細胞培養的穩定性提供一個切實有效的解決方法，而且將在植物種質資源的保存方面發揮關鍵作用。
【附圖說明】
[0017]圖1為大蒜鱗莖分生組織細胞在培養基上形成的增殖團塊的示意圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
[0019]如圖1所示為根據本發明申請的大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法得到的大蒜鱗莖分生組織細胞在培養基上形成的增殖團塊的示意圖，可以看出，此增殖團塊生長良好且具有良好的成型特性。
[0020]結合具體的實施例對本發明進行進一步的闡述。
[0021]實施例1
[0022]I)大蒜鱗莖分生組織細胞分離
[0023]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺內，剝去蒜皮，無菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無菌水沖洗2次；再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無菌水沖洗3后；用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細胞，接種于培養基上。
[0024]2)大蒜鱗莖分生組織細胞培養
[0025]培養基:以去硫酸銨的1/2B5培養基為基礎，添加lmg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結冷膠。
[0026]培養條件:25°C下暗處培養。
[0027]實施例2
[0028]I)大蒜鱗莖分生組織細胞分離
[0029]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺內，剝去蒜皮，無菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無菌水沖洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無菌水沖洗3后，用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細胞，接種于培養基上。
[0030]2)大蒜鱗莖分生組織細胞培養
[0031]培養基:以去硫酸銨的1/2B5液體培養基為基礎，添加1.5mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結冷膠。
[0032]培養條件:25°C下暗處培養。
[0033]實施例3
[0034]I)大蒜鱗莖分生組織細胞分離
[0035]將大蒜鱗莖用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺內，剝去蒜皮，無菌水沖洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用無菌水沖洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再無菌水沖洗3后，用解剖刀沿縱軸切開蒜瓣、切取基部分生組織細胞，接種于培養基上。
[0036]2)大蒜鱗莖分生組織細胞培養
[0037]培養基:以去硫酸銨的1/2B5培養基為基礎，添加2mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗壞血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%結冷膠。
[0038]培養條件:25 °C下避光培養。
[0039]在各種添加成分中，毒莠定是一種除草劑，可抑制細胞的分化。經3個實施例對毒莠定進行了定性評估，以改變濃度后能否生長為指標，結果表明:3個實施例均能得到大蒜鱗莖分生組織細胞在培養基上形成的增殖團塊，實驗結論說明不同濃度的毒莠定對實驗結果的影響不大，均能得到理想的結果。
[0040]至于在各種添加成分中的其他成分，主要作用是脫色，抗污染等作用。
[0041]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)大蒜鱗莖分生組織細胞分離 大蒜鱗莖洗凈去皮，經乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生組織細胞，接種于培養基上； 2)大蒜鱗莖分生組織細胞培養 所述培養基是以去硫酸銨的1/2B5培養基為基礎，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗壞血酸、檸檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、結冷膠而制成；培養條件為在25°C下避光培養。2.根據權利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，其特征在于:所述步驟I)中具體的方法為:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升萊浸泡1min ;在經過所述去皮、乙醇消毒、汞浸泡步驟后均用無菌水沖洗。3.根據權利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，其特征在于:所述步驟I)中，沿縱軸切開大蒜鱗莖的蒜瓣，切取所述大蒜鱗莖基部分生組織細胞。4.根據權利要求1所述的大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，其特征在于:所述步驟2)中，所述培養基添加的物質為:1?2mg/L毒莠定、0.01%活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗壞血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%結冷膠。5.根據權利要求1至4任一所述的大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，其特征在于:所述培養條件為:25°C下避光培養，首次培養一個月后，每兩周繼代一次。
【專利摘要】本發明公開了一種大蒜鱗莖分生組織細胞的分離及培養方法，培養的細胞為大蒜鱗莖基部分生組織細胞；所用培養基是以去硫酸銨的1/2？B5培養基為基礎，添加了毒莠定，活性碳，赤霉素，抗壞血酸，檸檬酸，甘氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，精氨酸。建立此方法主要目的是建立植物細胞銀行，這不僅可以為植物細胞培養的穩定性提供一個切實有效的解決方法，而且將在植物種質資源的保存方面發揮關鍵作用。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165619
【申請號】
【發明人】鞠秀云, 蔣繼宏, 曹小迎, 張健, 姜素平
【申請人】江蘇師范大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月9日