一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]大量文獻(xiàn)證明，多倍體植株較二倍體植株在營(yíng)養(yǎng)器官上具有更高產(chǎn)量。因此，為獲得更高的產(chǎn)量科技工作者們常常對(duì)植株進(jìn)行多倍體育種并已獲得成功，如四倍體草莓、八倍體小麥等。在多倍體育種中，難點(diǎn)之一在于如何有效地建立組織培養(yǎng)體系。常用的帶芽莖段組織培養(yǎng)具有工作量大，突變率小，篩選麻煩，死亡率高等缺點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域亟需提供一種能夠通過(guò)繼代培養(yǎng)將微小的突變放大，并通過(guò)核型分析檢測(cè)出來(lái)的愈傷組織，以進(jìn)行多倍體育種和細(xì)胞學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明提供了一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，該方法首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)金花葵進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，解決了目前對(duì)于金花葵組織培養(yǎng)所需條件的探究，填補(bǔ)了對(duì)金花葵研究的空缺。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法中利用無(wú)菌苗子葉為外植體和適宜的激素濃度來(lái)縮短培養(yǎng)周期。
[0004]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(I)、種子消毒:將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒；
[0006](2)、將消毒后的種子接種在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，接種后放置于恒溫黑暗環(huán)境中，使種子萌發(fā)，萌發(fā)后移至恒溫溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)；所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、蔗糖和瓊脂組成，pH為5.8?6.0 ;
[0007](3)、選取播種后10?15天的無(wú)菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，用雙層石蠟封口膜封口 ；
[0008](4)、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；
[0009](5)、切下愈傷組織轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至愈傷組織生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，完成培養(yǎng)；所獲得的愈傷組織形態(tài)穩(wěn)定，用于研究多倍體育種和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0010]步驟(I)中浸種具體為將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min，氯氣消毒時(shí)間為4h。
[0011]步驟(2)中無(wú)菌苗培養(yǎng)基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規(guī)格，50mL和10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基中蔗糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。
[0012]步驟(2)中培養(yǎng)溫度為25°C。
[0013]所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基成分相同，由MS培養(yǎng)基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH 為 5.8 ?6.0，其中 2，4-D 濃度為 2.lmg/L，6_BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L0
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):目前在本領(lǐng)域中，查閱現(xiàn)有的文獻(xiàn)和專利，尚無(wú)有人對(duì)金花葵進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，因此本發(fā)明最先對(duì)金花葵愈傷組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，較秋葵屬其他物種如黃秋葵、紅秋葵等而言具有培養(yǎng)周期短、誘導(dǎo)成功率高、有效縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程等特點(diǎn)。本方法獲得的愈傷組織形態(tài)穩(wěn)定、易于培養(yǎng)，是多倍體育種和細(xì)胞學(xué)研究的良好材料。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法中，種子消毒簡(jiǎn)單、消毒效果優(yōu)良、對(duì)環(huán)境污染小，外植體獲取容易。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)本方法對(duì)種子和外植體的毒副作用小，實(shí)驗(yàn)容易成功。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明。
[0016]本實(shí)施例中所用的器材和試劑如下:材料:金葵花種子
[0017]器材:干燥器、1mL EP管、移液管、洗耳球、錐形瓶、“Z”型鑷子、水浴鍋、超凈臺(tái)、酒精燈、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱。
[0018]試劑:濃鹽酸，高樂(lè)氏漂白液，MS培養(yǎng)基干粉，質(zhì)量濃度均為5mg/L的2，4_D(2，4 一二氯苯氧乙酸)、6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤或細(xì)胞分裂素)、KT (激素)。
[0019]本實(shí)施例中提供的具體培養(yǎng)方法如下:
[0020]1、種子消毒:將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒4h。
[0021]消毒步驟如下:首先將待滅菌的種子放入1mL EP管中，然后將EP管放入干燥器內(nèi)的支架上；然后在干燥器內(nèi)放入燒杯，在燒杯中加入高樂(lè)氏漂白液，然后按照高樂(lè)氏漂白液:濃鹽酸=100:3的體積比在燒杯中加入濃鹽酸，加入濃鹽酸后迅速將容器密閉，使種子在容器內(nèi)產(chǎn)生的氯氣作用下滅菌。
[0022]2、將消毒后的種子接種在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，接種后放置于25°C恒溫黑暗環(huán)境中，使種子萌發(fā)，萌發(fā)后移至25°C恒溫溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)；所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、蔗糖和瓊脂組成，pH為5.8?6.0 ;無(wú)菌苗培養(yǎng)基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規(guī)格，50mL和10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基中蔗糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。
[0023]3、選取播種后10?15天的無(wú)菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，用雙層石蠟封口膜封口 ；誘導(dǎo)培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中2，4-D濃度為 2.lmg/L，6-BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L。
[0024]4、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后出現(xiàn)愈傷組織；
[0025]5、切下愈傷組織轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)40天后愈傷組織生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，完成培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中2，4-D濃度為2.lmg/L, 6-BA濃度為0.75mg/L，KT濃度為2.0mg/L。所獲得的愈傷組織形態(tài)穩(wěn)定，用于多倍體育種和細(xì)胞學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟:(I)、種子消毒:將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒； (2)、將消毒后的種子接種在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，接種后放置于恒溫黑暗環(huán)境中，使種子萌發(fā)，萌發(fā)后移至恒溫溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)；所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、蔗糖和瓊脂組成，.pH 為 5.8 ?6.0 ; (3)、選取播種后10?15天的無(wú)菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，用雙層石蠟封口膜封P ; (4)、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織； (5)、切下愈傷組織轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至愈傷組織生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，完成培養(yǎng)；所獲得的愈傷組織形態(tài)穩(wěn)定，用于研究多倍體育種和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)中浸種具體為將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min，氯氣消毒時(shí)間為4h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中無(wú)菌苗培養(yǎng)基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規(guī)格，50mL和.10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基中鹿糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中培養(yǎng)溫度為25 °C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基成分相同，由MS培養(yǎng)基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中.2，4-D 濃度為 2.lmg/L，6-BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種金葵花愈傷組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒；將消毒后的種子接種在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，接種后放置于恒溫黑暗環(huán)境中，使種子萌發(fā)，萌發(fā)后移至恒溫溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)；選取接種后的無(wú)菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，用雙層石蠟封口膜封口；外植體接種后放置在恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；切下愈傷組織轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至愈傷組織生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，完成培養(yǎng)。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法中利用無(wú)菌苗子葉為外植體和適宜的激素濃度來(lái)縮短培養(yǎng)周期。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105165615
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】余光輝, 李林, 宋港港, 覃瑞, 劉虹, 李剛, 龔漢雨
【申請(qǐng)人】中南民族大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月26日