專利名稱:表征生物學流體的細胞組分的方法和裝置的制作方法
本發明涉及表征生物學流體的細胞組分及定量生物學流體中的細胞群和亞群的方法，以及可以用于施行該方法的裝置。
在本發明的范圍內，術語“生物學流體”指包含細胞組分或可能包含此類組分的任何天然流體或生物制品，例如血液、骨髓、腦脊液、胸膜液，和術語“細胞組分”指任何在其最傳統意義上的細胞，例如紅細胞和白細胞，以及存在于生物學流體中的任何其他細胞類型，例如血小板。同樣地，術語“群體”指同一類別的一組細胞，例如，嗜堿性粒細胞、淋巴細胞等，和術語“亞群”指同一類型的一亞組特殊細胞，例如淋巴細胞群的B、T4、T8淋巴細胞等，但還指未成熟或變化的形式。
確定并計數在不同生物學流體例如血液中的全部細胞群，在臨床診斷方面具有非常大的重要性。生物學流體的細胞學分析的傳統方法利用各種常規設備例如基于流式細胞術的血液學自動裝置，其用于區分并精確地自動計數在生物學流體樣品中存在的所有細胞，所述細胞隨后可以進行分群。這些設備通常包括一般為電學和/或光學測量裝置的測量裝置，其與可能存在的各種不同的試劑和染色劑相容，產生如上所述的分析結果。因此，對于血液樣品，這些自動裝置使得能夠形成血像，它提供血細胞計數、白細胞分類計數和血小板計數的常規參數。利用相互不同的另外設備，可以獲得關于網織紅細胞、成紅細胞、未成熟細胞等的鑒定的補充結果以便補全全部血像數據。例如，可以參考由本申請人提交的專利申請FR0102489，它涉及通過利用流式細胞術的多參數測量方法來鑒定并計數生物細胞的方法和試劑。
因此可以由此推斷出關于每種生物細胞種類的信息，從而產生其分類。
在絕大多數情況下，所有細胞組分的精確自動化計數及每種細胞組分群體的區分足以給從業醫師提供關于存在細胞學失調或紊亂的信息。然而，當利用常規細胞學分析自動裝置分析生物學流體時，與正常期望的那些相比，某些異常的細胞計數結果可以驗證額外的調查以便改善一個或多個這些結果。此外，此類分析不能使得能夠精確定量同一群體或家族中的不同細胞群，這是一個很大的缺點，特別是對于檢測患者中的某些病理學狀況或對于監測其發展。
因此補充分析被證實對于獲得血液樣品中的所選細胞(例如白細胞)亞群的計數的更精確結果來說是必需的。某些病理學狀況(免疫反應或白血病)的出現可以與白細胞類型的細胞群的異常水平相關。
這種補充分析與利用常規自動裝置進行的那些不同，其可以是進行手工涂片隨后在顯微鏡下觀察。在這種情況下，細胞組分的鑒定和計數一般用于對由自動裝置獲得的那些進行補充或替代。
它們還可以由特異性細胞標記組成，所述細胞標記通過被選擇用于區別經標記的所選細胞群的抗體(可選地包括熒光染料)來進行，或通過本領域已知的任何其他標記方法來進行。例如，可以提及專利申請EP0552707，它公開了利用例如抗-CD45和抗-CD71單克隆抗體進行標記，以便在流式細胞儀中區分所有白細胞。專利申請WO00/16103描述了通過利用抗體或抗體試劑盒進行區別并經熒光測量術進行檢測來定量嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。同樣地，用抗-CD19、抗-CD14和抗-CD8抗體標記淋巴細胞群使得能夠分別分開B淋巴細胞、T輔助淋巴細胞和抑制性T細胞(T Suppressor)的亞群。
盡管這些分析使得能夠監督和/或校正由常規自動裝置獲得的結果，但它們經常導入不準確度并只允許與經自動裝置獲得的結果的統計學相關。使用更高效的方法例如流式細胞術幾乎產生相同的結果，但與利用自動裝置獲得的結果直接相關是不可能的，因為進行的是兩種分開的分析，這降低了全部結果的準確性。
實際上，當生物學流體的等分試樣中的細胞組分的分析揭示所述細胞組分的精確計數中的異常時，使用者利用兩種獨立的分析系統對同一生物學流體的不同等分試樣進行第二個獨立分析，因此在分開的基礎上進行測量，即，每次測量提供不同的結果，這因而需要通過每次測量獲得的結果的數學相關性以便最終獲得具有誤差的結果。這導致具有主觀性的結果解釋，因為它不允許可靠地鑒定異常結果的真實原因，所述異常結果可以是由于樣品自身或設備所引起的，并且還可以顯示是病理學狀況的精確診斷(如果需要的話)所不能接受的。
本發明提出了現有技術缺點的補救。
為此目的，本發明提出了區分并計數在生物學流體樣品中存在的細胞組分的方法，包括-一般通過流式細胞術施行的初步細胞學分析步驟，以獲得一組初步結果，使得能夠將樣品中的所有細胞組分區分成不同的群體并計數；以及-基于所鑒定的細胞特性，對特定類型細胞組分進行補充細胞學分析步驟，以獲得補充結果，使得能夠區分并計數樣品的至少一種細胞群或亞群從而鑒定所述細胞特性。
因此，根據本發明的方法包括對生物學流體或生物學流體等分試樣進行常規細胞學分析的第一個步驟，其通常通過流式細胞儀來施行，包括電學和/或光學類型的測量手段(moyen)和試劑，所述試劑為本領域技術人員已知的細胞裂解劑、細胞內材料的染色劑、水性稀釋劑及其混合物。來自上述測量手段的信號通常進行處理并轉化為“標準化系列結果”，即，整合了分析常規參數的一組結果。因此這使得能夠鑒定細胞組分并精確計數，這些細胞組分隨后被分為不同群，如在例如專利申請FR9701090中所述的。
第二個步驟，或補充步驟，使得能夠獲得補充結果，這些補充結果使得能夠鑒定細胞特性。
關于特定種類的細胞組分或關于多個群體的異常計數結果使得能夠鑒定一種或多種異常。在根據本發明的方法中，這些異常可以例如與異常高數目的胚細胞或異常結構的淋巴細胞相關。
在一個優選實施方案中，首先施行單獨的初步步驟，并且如果初步結果允許鑒定至少一種與所鑒定的細胞特性相關的異常，那么同時施行被重復以重新獲得該組初步結果的初步步驟和用于獲得與這種細胞特性相關的補充結果的補充步驟。
有利地，所述方法進一步包括基于所鑒定的細胞特性的特異性細胞標記步驟，隨后為細胞學分析步驟，這使得能夠獲得用于鑒定樣品中包含的所有群體的全部初步結果以及用于鑒定與所鑒定的細胞特性相關的群體或亞群的補充結果。
因此，這些特性產生特殊類型細胞組分的特異性標記步驟，例如血液中的淋巴細胞的亞群，它在血液等分試樣中的數目與正常預期的相比是異常的，因此驗證了更深入的研究，用于區分并計數這種特殊群體以便嘗試確定其不同的亞群。
因此，一旦進行細胞組分標記，那么必需揭示被特異性標記的細胞組分，或者需要時，揭示未被標記的那些。這通過施行補充細胞學測量步驟來完成，所述補充步驟導致用于定量并區分細胞群或亞群細胞組分的額外結果，所述細胞群或亞群細胞組分是與它們的數目或它們的存在相關的異常的根源。如已提及的，操作者施行與經標記的細胞組分的補充步驟相關聯并且同時的初步分析的重復分析。因此，這些補充測量的結果聯合對于相同生物學流體等分試樣而獲得的初步分析步驟的重復結果為目標亞群提供了區分和計數結果，所述結果建立在與使得能夠建立標準化系列結果的那個等同的參照基礎上。因此消除了在連續分析中、在不同分析方法中、在未整合的設備中所固有的所有誤差或不精確。
因此，可以對于相同細胞組分測量不同的物理化學特征，特別是利用由于其對至少一種物理化學特征特異的親和力而選擇出的標記物，例如細胞內材料(DNA、RNA)、特殊蛋白或酶、膜結構等。這使得能夠區分每種經標記的細胞組分與未標記的細胞組分。因此，隨后通過已知方法檢測經標記的或未標記的細胞組分(參見下文)。同樣地，細胞標記使得能夠非常精確地定量細胞組分的不同亞群，例如淋巴細胞群的B、T4、T8淋巴細胞等。
因此，在同一生物學流體樣品中，施行根據本發明的方法使得能夠表征與對于某些病理學狀況來說特有的某些細胞組分存在相關或與其異常低或高的數目相關的特性。因此，允許在確定的群體或亞群中進行細胞內研究。根據本發明的方法使得能夠為具有以前從未達到的精確度和可靠性的結果提供可能性，因為對應這些可能性的補充分析與導致標準化系列結果的分析同時并聯合進行，由此確保存在所有補充結果和標準化系列結果所共有的參照基礎，并由此特別消除了分開的分析的所有缺點。
根據本發明的方法還使得能夠消除對于標準化系列結果所觀察到的偏差的最大多數的解釋誤差(erreur d′interprétation)，作為異常這可以接受標準化的系統處理。
根據本發明的方法在單次施行中產生完整和總體的結果，這避免了需要依靠連續、多次和分開的分析，這樣的分析可能是從業醫師為了獲得精確的病理狀況診斷而要求的。這個的優點在于它降低了與這些分析有關的成本。
相似地，在鑒定了病理狀況以為了監控其發展或治療有效性的情況下，從業醫師有更大的選擇來以保證一組與唯一參照基礎相關的結果的可靠性的方式來規定待施行的分析。
最后，根據本發明的方法在檢測并表征標準化系列結果的細胞特性方面給了從業醫師更大的可靠性。
初步細胞學分析步驟有利地包括利用第一種測量手段，其使得能夠通過至少一種電學區分手段或光學區分手段來區分樣品中存在的所有細胞組分，所述電學區分手段包括阻抗，所述光學區分手段包括衍射、漫射、透射和熒光。
此外，這個初步步驟可以包括利用使得能夠區分樣品中存在的所有細胞組分的一種或多種試劑。
補充細胞學分析步驟有利地包括利用第二種測量手段，其使得能夠區分和計數在生物學流體樣品中存在的至少一種細胞群或亞群。
第二種測量手段優選包括利用至少一種光學區分手段。因此，這些第二種測量手段優選包括一種或多種測量通道(canal)，所述測量通道以光學方式運作并能夠以單一或組合方式測量選自衍射、透射、熒光或吸光度的光學參數，特別是在某些波長處或波長范圍內。
第二種測量手段可以由至少一種測量途徑組成，所述測量途徑以熒光方式運作并利用一個或多個合理選擇的波長。特別地，第二種測量手段在選自從紫外到紅外的波長上是可有效運作的。
優選地，特異性細胞標記步驟包括利用至少一種使得能夠區分所述細胞特性的標記物，而補充細胞學分析步驟包括利用第二種測量手段，它包括至少一種能夠與該組測量同時地鑒定標記物的測量途徑。
測量信號的處理可以利用計算機來進行，所述計算機包括用于處理數據和重建結果的適當手段。這些手段可以為兩個計算軟件，其中一個用于處理信號以便提供結果的圖形顯示，和另一個用于處理由結果分析獲得的信號。計算機可以與指導特異性細胞標記步驟的控制手段相連。
為了施行標記步驟，可以利用至少一種為分子探針的細胞標記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
作為標記物而選擇出的染色劑必須與預定測量中的細胞內材料的染色劑不同，即它必須能夠通過光學測量技術在與對于檢測預定測量中的染色劑所需的波長不同的波長上被檢測。
采用至少一種抗體或抗體混合物或抗體試劑盒的標記通常通過抗原/抗體反應來施行，其優選利用單克隆抗體來進行，所述單克隆抗體有利地接合了常規染色劑或熒光染料，例如熒光素或藻紅蛋白-花青苷5(PC5)。
此外，對于分析步驟，電學和光學類型的測量手段分別為直流電或交流電的細胞阻抗測量手段，以及選自光衍射、光漫射、光透射或熒光的測量手段。
在本發明的范圍內，生物學流體優選為稀釋或未稀釋的全血、血清、稀釋或未稀釋的骨髓、腦脊液、尿液、滑液、胸膜液等。
當生物學流體樣品為血液樣品時，初步細胞學分析步驟有利地包括產生血像所需的測量，包括細胞計數、白細胞分類計數和血小板計數的全部或部分參數。
在這種情況下，可以利用特異性抗體來標記血液樣品的細胞組分，這些抗體選自紅細胞、白細胞和血小板群體。因此，可以通過在紅細胞上進行靶向標記并連同在白細胞或血小板上進行靶向標記來施行根據本發明的方法，在分析中沒有彼此相互作用和干擾的風險。
標記步驟有利地利用特異性抗體來進行，所述特異性抗體用于在血液樣品細胞群中存在的至少一種特殊亞群的細胞標記。
優選地，標記步驟通過利用用于標記至少一種亞群的特異性抗體來進行，所述亞群選自淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、紅細胞、血小板及其所有前體。
細胞標記步驟可以通過至少一種與熒光染料綴合的抗體或抗體混合物來進行，和補充細胞學分析步驟采用通過正交(orthogonal)熒光類型(FL2)的細胞熒光的測量手段。
細胞標記步驟有利地通過至少一種選自下列的抗體來進行CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。
細胞標記步驟還可以利用至少一種為分子探針的細胞標記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
根據本發明的另一個特征，初步細胞學分析步驟以及補充細胞學分析步驟同時測量同一流中的相同細胞組分的不同物理特征。
根據本發明的方法可以包括下述步驟將試劑和細胞標記物與生物學流體混合，并將由此獲得的混合物轉移到分析池中，這使得能夠對于相同生物學流體或生物學流體等分試樣進行總體和同時的分析，如上文所解釋的。
根據本發明的方法使得能夠例如為血液樣品建立完整的血像，即超越標準化系列結果并包括血液中細胞群的區分和計數的詳細鑒定，所述細胞群即淋巴細胞、單核細胞、紅細胞、粒細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞、成紅細胞、未成熟的顆粒細胞、血小板及其他胚細胞，并且在如果需要時還有可能檢測和計數淋巴細胞群中的異常胚細胞亞群，它不具有與所預期的一致的淋巴細胞分布。例如，這些淋巴母細胞根據其對抗-CD45抗體的非陽性而與其他淋巴細胞群分離。
在另一個方面，本發明涉及施行上述方法的裝置，該裝置包括以流式細胞術進行運作的設備，具有第一種測量手段，包括至少一種能夠測量選自光學參數和電學參數的參數的測量通道，所述光學參數選自衍射、漫射、透射和熒光，以及所述電學參數包括阻抗；第二種分析手段，包括至少一種能夠測量選自衍射、透射、熒光和吸光度的光學參數的測量通道；以及用于處理從第一種測量手段和第二種測量手段獲得的結果的計算機。
在一個優選實施方案中，第一種測量手段包括軸向衍射(FSC)的傳感器、正交漫射(SSC)的傳感器、正交熒光(FL1)的傳感器和用于測量電阻率的電極，以及所述第二種測量手段包括用于測量正交熒光(FL2)的傳感器。
因此，根據本發明的設備包括整合到流式細胞儀中的預定的第一種常規分析手段。有利地，這些手段為生物學流體樣品或等分試樣的至少一種選自軸衍射(FSC)、正交漫射(SSC)、正交熒光(FL1)和電阻率(RES)的測量或通道參數，如申請人在專利申請EP0425381中所描述的。因此，這些第一種分析手段導致細胞組分的區分及其精確計數，使得能夠將其進行分群。
有利地，如申請人在專利申請FR0102489中所述的，初步手段被布置用于引入至少一種用于區分并計數生物學流體的所有細胞組分的試劑，所述試劑選自細胞裂解劑、細胞內材料的染色劑、水性稀釋劑及其混合物。
例如利用離子型和/或非離子型去污劑來進行生物學流體的某些細胞組分特別是紅細胞的裂解，所述去污劑可以為伯胺、膽酰胺等。裂解劑的選擇取決于生物學流體的性質，并且將因此可容易地由本領域技術人員來決定。
細胞組分的染色劑用于與細胞內的DNA或RNA結合。它通常可以為噻唑橙、噻唑藍等。所述試劑可以任選包括細胞組分的固定劑(agentde fixation)，其是本領域技術人員已知的。
根據本發明的設備的一個實施方案，其進一步包括-至少一種細胞特性的鑒定手段，其對應于某些細胞群或某些細胞組分的存在或數目的，-根據所鑒定的特性的特異性細胞標記手段。
所述標記手段優選包括至少一種為分子探針的細胞標記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體，并且更優選地，它們為其上接合有熒光染料的至少一種抗體或抗體混合物。
根據本發明的設備的一個實施方案，適合于所述標記手段為一種或多種測量通道，其分別為直流電或交流電的細胞阻抗測量手段以及選自在從紫外到紅外波長上經標記的細胞的衍射、光透射和熒光或吸光度的至少一種測量手段。
優選地，通過細胞熒光的測量手段為接合在特異性抗體上的熒光染料的正交熒光(FL2)。
根據本發明的裝置的一個優選實施方案，它包括計算機，其被布置用于將來自第一種測量手段和第二種測量手段的結果相關聯，并形成來自第一種測量手段和第二種測量手段的結果的圖形。
有利地，計算機被布置用于根據其家族或其物理特征對所述細胞組分進行解釋和分類。
如上所述，計算機被布置用于處理測量信號，并進一步包括處理數據和重建結果的適當手段。它優選包括儲存通過各種分析獲得的結果的存儲器。
可以想象，在涉及施行這樣的分析是否適當時，此類設備可以具有自動決策能力，所述分析是對常規分析的補充，是鑒定和計數被搜尋或被懷疑應對所揭示的異常負責的成分所必需的。
本發明的特征和優點由于下文中的詳細描述以及由于非限制性實施例將變得更為明顯，其中參考其后所附的圖，其中
-圖1顯示構成根據一個優選實施方案的分析設備的具體元件(élément)的圖；-圖2-19顯示通過多參數測量法FSC、RES、SSC、FL1和FL2而獲得的細胞分布或二維矩陣的圖。
在圖1中，以功能圖的形式顯示了組成根據本發明的設備1的具體元件，所述設備1用于分析生物學流體等分試樣。該圖部分地采用了專利申請FR0102489中所描述的參數。設備1是基于流式細胞術的自動裝置，其具有下述參數和元件-單色激光10，-用于形成光束的裝置11，-通過電阻率和通過光學測量來測量細胞體積的循環池12，-用于收集軸向衍射(FSC)的輻射的光學系統13，-提供大小解釋的軸向衍射(FSC)的傳感器14，-表示所觀察到的細胞結構的正交漫射(SSC)的傳感器15，-測量細胞內RNA和DNA表達的正交熒光(FL1)的傳感器16，-測量與熒光染料接合的抗體的反應性的正交熒光(FL2)的傳感器17，-用于收集正交輻射的光學系統18，-整合在池12中的電阻率(RES)測量電極19，-計算機20，-顯示結果的系統21。
在包括光學測量通道的設備1上分析生物學流體等分試樣，通過細胞的軸向衍射、正交漫射和正交熒光來進行，其原理在下文中得到簡要闡述。
在第一種情況下，將生物學流體的細胞置于測量池12中并且被由源10發出并經設備11調整的光輻射穿透，這些細胞引起入射輻射的衍射，其強度取決于細胞的大小。用于收集衍射輻射的光學系統13被放置成與輻射在一直線上。被衍射的輻射在傳感器14上收集，其響應取決于細胞衍射。
正交漫射的原理基于測量穿過細胞組分的光輻射的漫射。輻射在傳感器15上被收集并且響應與漫射成正比，所述傳感器15與在池12的出口處漫散的輻射成直角。
正交熒光FL1和FL2的測量分別基于這樣的原理，即染色細胞在特定波長上激發而發射出具有不同于激發波長的波長的熒光輻射，而接合在特異抗體上的熒光染料的激發反過來又發射出特定的熒光輻射。
用于收集正交輻射FL1和FL2的光學系統18被放置成與由輻射源10所發射的輻射成直角。
設備1還包括通過電阻率(RES)的電學測量通道。這種測量基于下述原理，在其中電流是恒定的電場中，將待測物(élément)放置在池12中，根據歐姆定律該電場中由這個待測物呈現的電阻率導致維持恒流所需的電壓增加。
整合在池12中的電極19測量元件的電阻率，從而使得能夠評測其體積。
實施例1如專利申請FR 0102489所述，在基于流式細胞術的常規自動分析裝置上分析一等分試樣的正常血液以便表征和定量白細胞成分(élément)。
以二維矩陣的形式觀察這種分析的結果，所述二維矩陣代表從每種測量通道獲得的測量結果的不同組合。為了清晰起見，每個矩陣中代表每種細胞成分的點已被省去。只有界定所獲得的每個群體的輪廓線被畫出。
圖2顯示了通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到4個群體L為淋巴細胞、M為單核細胞、E為嗜酸性粒細胞和N為嗜中性粒細胞。在這個圖2中，群體N和E沒有明顯分開。
圖3顯示了通過兩種通道FSC和FL1獲得的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L和M之間存在部分重疊。
圖4顯示了通過測量通道SSC和FL1形成的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L和M互相完全分開。
圖5也顯示了通過兩種通道RES和FSC形成的矩陣，根據這個安排，群體L和E是分開的，但群體N和M沒有分開。
實施例2利用專利申請FR 0102489中所述的測量通道，在基于流式細胞術的常規自動分析裝置上分析一等分試樣的血液以便表征和定量白細胞組分。
圖6顯示了利用兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。盡管群體L和N具有與圖2中的外形相似的外形，但群體L與圖2中所示的正常的那種相比異常擴展。這還可以在圖7-9中看出，所述圖7-9分別對應于圖3-5中的矩陣視圖。在這些分析結束時，看起來可能的是，在圖中的分布比正常淋巴細胞群的分布更為擴展的淋巴細胞群具有異常的細胞成分例如胚細胞成分。
實施例3利用設備1根據本發明的方法分析一等分試樣的實施例2的血液。
該分析如下進行抽取50μl的人類血液樣品等分試樣，將其與包含PC5作為熒光染料的50μl抗-CD45單克隆抗體溶液混合。將由此獲得的溶液在沒有任何光輻射的情況下并在環境溫度下孵育數分鐘，大約3-30分鐘。由此獲得的溶液隨后與包含噻唑橙作為細胞內染色劑的試劑混合以裂解紅細胞并固定細胞成分，這是進行初步分析步驟所必需的。
在這種情況下，利用激光10發出的噻唑橙的激發波長為488nm，和發射波長為530nm。在這個實施例中，抗-CD45抗體用于特異性標記成熟且正常的白細胞，以表達減少的順序為淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞和嗜中性粒細胞。
隨后將溶液轉移到分析設備1的循環池12中。使用者開始以四個通道來分析等分試樣從而提供用于區分和計數不同細胞群的常規結果，并且利用計算機20以第五個通道FL2(PC5的激發波長為488nm，和發射波長為660nm)同時進行分析。軟件處理來自通過上述通道的每種測量的結果。
圖10顯示通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到5個群體L為淋巴細胞、M為單核細胞、E為嗜酸性粒細胞和B為對于抗-CD45抗體來說是陰性的胚細胞。
在該圖10中，群體N和E沒有明顯分開，并且在群體L、M和B之間可以觀察到部分重疊。
圖11顯示通過兩種通道FSC和FL1獲得的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L、M和B之間存在部分重疊。
圖12顯示通過測量通道SSC和FL1而形成的矩陣。群體N和E同樣也混在一起，并且盡管群體M與其他群體分開，但是可以看出群體B和L沒有完全分開。
圖13也顯示了通過兩種通道RES和FSC而形成的矩陣。在這個安排中，存在的群體沒有一個明顯地分開。
圖14顯示通過兩種通道FL2和SSC而形成的矩陣。這個矩陣視圖使得能夠分開異常胚細胞群B與淋巴細胞群。
通過利用設備1施行根據本發明的方法，使得能夠表征和定量在所分析的血液等分試樣中胚細胞B(對于抗-CD45來說為陰性)的存在。圖14中顯示的補充測量使得能夠明確區分胚細胞B，這用血像的所有預定測量是不可能實現的。
實施例4這個實施例用于提供血液樣品中非胚性細胞組分的精確計數，所述血液樣品中的胚細胞群在監控對于患者的治療的范圍內是已知的。先前的分析已顯示了淋巴細胞群的異常分布，驗證了補充的檢查。
隨后的分析用于鑒定淋巴細胞成分以對它們進行精確計數。
這個鑒定將利用與相同熒光染料PC5綴合的抗-CD19和抗-CD3抗體并且通過經通道FL2檢測標記的淋巴細胞來完成。
在早先所述的設備1上就已知的胚細胞群體分析50μl的血液等分試樣，并對其實施實施例3中所述分析步驟和試劑。
圖15顯示通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到3個群體L為對于經抗-CD3和抗-CD19標記來說為陽性的淋巴細胞，N為嗜中性粒細胞和B為對于這兩種抗體來說為陰性的淋巴細胞成分。群體N并非與其他兩種群體L和B完全不同，所述群體L和B被觀察到有一定程度的群體間重疊。這還可以在圖16-18中被看出，所述圖16-18分別對應于根據圖3-5中的安排的矩陣視圖。
圖19顯示通過兩種通道FL2和SSC形成的矩陣。這個矩陣視圖使得能夠分開所考慮的3個群體，并且特別是在整個白細胞分類計數中分開對于抗-CD3和抗-CD19來說為陽性的淋巴細胞與陰性的淋巴細胞，從而使得能夠進行精確計數。圖19中顯示的補充測量使得能夠明確區分對于CD3抗體和對于CD19抗體來說為陽性的淋巴細胞，這用血像的所有預定測量是不可能實現的。
權利要求
1.區分并計數在生物學流體樣品中存在的細胞組分的方法，其特征在于，所述方法包括-一般通過流式細胞術施行的初步細胞學分析步驟，以獲得一組初步結果，使得能夠將樣品中的所有細胞組分區分成不同的群體并計數，以及-基于所鑒定的細胞特性，對特定類型細胞組分進行補充細胞學分析步驟，以獲得補充結果，使得能夠區分并計數樣品的至少一種細胞群或亞群從而鑒定所述細胞特性。
2.根據權利要求
1的方法，其特征在于，首先施行單獨的初步步驟，并且如果初步結果允許鑒定至少一種與所鑒定的細胞特性相關的異常，則隨后同時施行被重復以重新獲得該組初步結果的初步步驟和用于獲得與這種細胞特性相關的所述補充結果的補充步驟。
3.根據權利要求
2的方法，其特征在于，所述方法進一步包括基于所鑒定的細胞特性的特異性細胞標記步驟，隨后為細胞學分析步驟，這使得能夠獲得用于鑒定樣品中包含的所有群體的該組初步結果以及用于鑒定與所鑒定的細胞特性相關的群體或亞群的補充結果。
4.根據權利要求
1-3中任一項的方法，其特征在于，所述初步細胞學分析步驟包括利用第一種測量手段，所述第一種測量手段使得能夠通過至少一種電學區分手段或光學區分手段來區分在所述樣品中存在的所有細胞組分，所述電學區分手段包括阻抗，和所述光學區分手段包括衍射、漫射、透射和熒光。
5.根據權利要求
4的方法，其特征在于，所述初步細胞學分析步驟包括使用使得能夠區分在所述樣品中存在的所有細胞組分的一種或多種試劑。
6.根據權利要求
1-5中任一項的方法，其特征在于，所述補充細胞學分析步驟包括利用第二種測量手段，所述第二種測量手段使得能夠區分并計數在生物學流體樣品中存在的至少一種細胞群或亞群。
7.根據權利要求
6的方法，其特征在于，所述第二種測量手段包括使用至少一種光學區分手段。
8.根據權利要求
7的方法，其特征在于，所述第二種測量手段包括一種或多種測量途徑，所述測量途徑以光學方式運作并能夠以單一或組合方式測量選自衍射、透射、熒光或吸光度的光學參數，特別是在某些波長處或波長范圍內。
9.根據權利要求
8的方法，其特征在于，所述第二種測量手段由至少一種測量途徑組成，所述測量途徑以熒光方式運作并利用一個或多個合理選擇的波長。
10.根據權利要求
9的方法，其特征在于，通過以熒光方式運作的所述第二種測量手段在選自從紫外到紅外的波長上是可有效運作的。
11.根據組合在一起的權利要求
3和6的方法，其特征在于，所述特異性細胞標記步驟包括利用至少一種使得能夠區分所述細胞特性的標記物，和所述補充細胞學分析步驟包括利用第二種測量手段，它包括至少一種能夠與該組測量同時地鑒定標記物的測量途徑。
12.根據權利要求
1-11中任一項的方法，其特征在于，所述生物學流體樣品選自下列-稀釋或未稀釋的全血或非全血，-血清，-稀釋或未稀釋的骨髓，-腦脊液，-尿液，-滑液，-胸膜液。
13.根據權利要求
1-12中任一項的方法，其特征在于，所述生物學流體樣品為血液樣品，和所述初步細胞學分析步驟包括產生血像所需的測量，包括細胞計數、白細胞分類計數和血小板計數的全部或部分參數。
14.根據權利要求
3-13中任一項的方法，其特征在于，所述生物學流體樣品為血液樣品，和所述細胞標記步驟包括利用用于標記血液樣品的細胞組分的特異性抗體，這些抗體選自紅細胞、白細胞和血小板群體。
15.根據權利要求
14的方法，其特征在于，所述細胞標記步驟包括利用特異性抗體，其用于進行在所述血液樣品的細胞群中存在的至少一種特殊亞群的細胞標記。
16.根據權利要求
14和15中任一項的方法，其特征在于，所述細胞標記步驟包括利用用于標記至少一種亞群的特異性抗體，所述亞群選自淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、紅細胞、血小板及其所有前體。
17.根據權利要求
3-16中任一項的方法，其特征在于，所述細胞標記步驟通過至少一種與熒光染料綴合的抗體或抗體混合物來進行，和所述補充細胞學分析步驟采用通過正交熒光類型(FL2)的細胞熒光的測量手段。
18.根據權利要求
3-17中任一項的方法，其特征在于所述細胞標記步驟通過至少一種選自下列的抗體來進行CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。
19.根據權利要求
3-17中任一項的方法，其特征在于，所述細胞標記步驟利用至少一種為分子探針的細胞標記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
20.根據權利要求
1-19中任一項的方法，其特征在于，所述初步細胞學分析步驟和所述補充細胞學分析步驟同時測量同一流中的相同細胞組分的不同物理特征。
21.用于施行根據權利要求
1-20中任一項的方法的裝置，其特征在于，它包括以流式細胞術進行運作的設備(1)，具有第一種測量手段(14、15、16、19)，包括至少一種能夠測量選自光學參數和電學參數的參數的測量通道，所述光學參數選自衍射、漫射、透射和熒光，以及所述電學參數包括阻抗；第二種分析手段(17)，包括至少一種能夠測量選自衍射、透射、熒光和吸光度的光學參數的測量通道；以及用于處理從第一種測量手段和第二種測量手段獲得的結果的計算機(20)。
22.根據權利要求
21的裝置，其特征在于，所述第一種測量手段包括軸向衍射(FSC)的傳感器(14)、正交漫射(SSC)的傳感器(15)、正交熒光(FL1)的傳感器(16)和用于測量電阻率(RES)的電極(19)，以及所述第二種測量手段包括用于測量正交熒光(FL2)的傳感器(17)。
23.根據權利要求
21和22中任一項的裝置，其特征在于，所述計算機(20)被布置用于將來自第一種測量手段和第二種測量手段的結果相關聯，并形成來自第一種測量手段和第二種測量手段的結果的圖形。
24.根據權利要求
23的裝置，其特征在于，所述計算機(20)被布置用于根據其家族或其物理特征對所述細胞組分進行解釋和分類。
專利摘要
本發明涉及區分并計數在生物學流體樣品中存在的細胞組分的方法，包括一般通過流式細胞術設備(1)施行的初步細胞學分析步驟，以獲得一組初步結果，使得能夠將樣品中的所有細胞組分區分成不同的群體并計數；以及基于所鑒定的細胞特性，對特定類型細胞組分進行補充細胞學分析步驟，以獲得補充結果，使得能夠區分并計數樣品的至少一種細胞群或亞群從而鑒定所述細胞特性。本發明特別適合于血液分析。
文檔編號G01N15/10GK1993610SQ20058002580
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月6日
發明者D·勒費爾 申請人:奧里巴Abx股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan