專利名稱:一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法
一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法技術領域：
[0001]一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法，具體的說是在發酵過程中，不同的發酵階段采取不同的體積傳質系數(κ^)，從而提高凝乳酶的發酵水平，本發明屬于微生物發酵技術領域：
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背景技術：
[0002]凝乳酶是乳酪生產中的關鍵酶，它使原奶凝固分為兩個階段酪蛋白微膠粒中 α-酪蛋白和酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不會發生自發凝結，首先凝乳酶專一性的將 κ -酪蛋白分解為ρ- κ -酪蛋白和一種巨肽，使酪蛋白的微膠粒失去穩定性；然后在Ca2+作用下ρ-Κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之間形成化學鍵從而形成沉淀。[0003]目前凝乳酶的主要來源有動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。傳統上，凝乳酶是利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，隨著乳酪產業不斷擴大，單純靠宰殺幼畜的方法來生產凝乳酶已經不能滿足現代工業對凝乳酶的需求。動物性凝乳酶的短缺以及植物性凝乳酶自身特性的缺點，使得微生物凝乳酶成為未來凝乳酶行業的發展趨勢。微生物凝乳酶又可分為真菌和細菌來源的凝乳酶，與真菌固體發酵相比，細菌液體發酵生產凝乳酶具有生長周期短、生產成本低、易于控制生長條件等諸多優點，近幾年得到研究者更多的關注。但是，如何提高發酵水平，縮短發酵時間還處在進一步的研究當中。
發明內容
[0004]本發明的目的在于提供一種基于兩階段溶氧控制策略的用以提高解淀粉芽孢桿 ■ iBaciUus amyloliquefacines)產凝乳酶發酵水平、縮短發酵時間的方法。[0005]本發明的技術方案一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法，采用解淀粉芽孢桿菌(feci/^As amyloliquefacines) CCTCC NO =M 2011045 為生產菌株，所用發酵培養基以克/升計為葡萄糖15，麩皮25，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然，121 °C滅菌30 min;接種量為體積百分比0. ，發酵溫度為 35°C ；發酵第一階段0-1 將氧體積傳質系數控制在72. 2 h—1，發酵第二階段16 h以后，將氧體積傳質系數K^控制在33. 9 h—1。[0006]本發明采用的菌種為解淀粉芽孢桿菌(Mcillus amyloliquefacines^ JNU002, 在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC NO =M 2011045。該菌株由本發明的部分發明人選育，該菌株以及利用該菌株發酵生產凝乳酶的方法已申請中國專利，申請號 201110091892. 7，公開號CN 102191203 A。[0007]本發明中Kp值的測定采用參考文獻(倫世儀主編，堵國成副主編，《生化工程(第二版)》，中國輕工出版社，2008年)所述的動態法用溶氧電極測定K^。[0008]本發明所涉及的培養與發酵所用的斜面培養基、種子培養基、發酵培養基，以及斜面培養和種子培養的條件采用公開號為CN 102191203 A所提供的方法。[0009]本發明在發酵過程中所采用的發酵溫度為35°C，接種量為0. 2%(體積百分比)。[0010]凝乳酶活力的測定用O.Olmol/L氯化鈣溶液配制質量濃度12%脫脂奶粉溶液，室溫放置40min后使用，當天配制。取5 mL 12%的脫脂奶粉溶液在35°C水浴鍋中保溫lOmin， 加適量35°C預熱IOmin的酶液(發酵液5000rpm離心5min獲得之清液)，立即搖勻，開始計時，把試管傾斜45°，旋轉試管，觀察壁上出現絮狀沉淀時為凝乳終點，記錄凝乳時間。 40min凝固ImL脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxhlet Unit，SU)。te—.4·, 2400>: Κ iHBftitiiIR (isl)秘聯位粘‘賭乳對同(u ^tsM ^mL)[0011]本發明的有益效果采用本發明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢桿菌發酵產酶水平，同時縮短發酵時間18小時以上。此外，氧體積傳質系數(Kp)是本領域進行規模放大的重要參數，本發明以氧體積傳質系數(Kp)作為控制指標所建立的溶氧控制策略， 同其它的溶氧控制方法相比，在實際的工業放大過程中提供了一種更為有效的方法。
具體實施方式
[0012]在下面所述的所有具體實施例中，所有的發酵均在7升發酵罐中進行 (Bioflo-415 New Brunswick Scientific Co., U. S. A)，在發酵過程中攪拌轉速保持在 500 轉/分鐘。如無特殊說明，所用方法均為本領域常用方法。[0013]對照實施例1 解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在氧體積傳質系數(Kp)為 33. Qh-1條件下發酵產凝乳酶。[0014](1)斜面培養解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045接種于斜面培養基上，在 32°C下培養M小時。所用斜面培養基為(單位為克/升):葡萄糖20，酵母膏10，瓊脂條20， 用自來水配制，pH值自然，115°C滅菌20分鐘。[0015](2)種子培養將斜面長好的菌種用接種環取一環接入種子培養基中，在35°C培養12小時，搖床轉速150轉/分鐘。所用種子培養基為(單位為克/升)麩皮30，氯化鈉 5，七水硫酸鎂5，磷酸二氫鉀2，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然；每250毫升三角瓶裝 30毫升種子培養基，121°C滅菌30分鐘。[0016](3)液體發酵培養將培養好的種子9毫升接入發酵罐中，其中發酵培養基為4. 5 升，控制氧體積傳質系數(Kp)在33. 9 h—1，在35°C培養。所用發酵培養基為(單位為克/升): 葡萄糖15，麩皮25，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH 值自然，121 °C滅菌30 min0發酵培養60 h，發酵液中的凝乳酶活力達到最高值6366 SU/mLo[0017]對照實施例2 解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在氧體積傳質系數(Kp)為 72. 2 h—1條件下發酵產凝乳酶。[0018]將培養好的種子9毫升接入發酵罐中，其中發酵培養基為4. 5升，控制氧體積傳質系數(Kp)在72. 2 h—1。其他條件同對照實施例1。發酵培養M h，發酵液中凝乳酶活力達到最高值5896 SU/mL。[0019]實施例解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO =M 2011045在二級溶氧控制條件下發酵產凝乳酶。[0020]將培養好的種子9毫升接入發酵罐中，其中發酵培養基為4. 5升，發酵前16 h控制氧體積傳質系數(Kp)在72. 21^,16 h后控制氧體積傳質系數(Kp)在33. 9 h—1。其他條件同對照實施例1。發酵培養36 h，發酵液中凝乳酶活力達到最高值6590 SU/mL。 以上已詳細描述了本發明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯然可以做很多改進和變化而不會背離本發明的基本精神。所有這些變化和改進都在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1. 一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法，其特征在于采用解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefacines)CCTCC NO =M 2011045 為生產菌株，所用發酵培養基以克 / 升計為葡萄糖5-20，麩皮10-30，氯化鈉6，七水硫酸鎂4. 5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，PH值自然，121 °C滅菌30 min;接種量為體積百分比0.2%，發酵溫度為35°C;發酵第一階段0-1 將氧體積傳質系數K盧控制在72. 2 h—1，發酵第二階段16 h以后，將氧體積傳質系數Kp控制在33. 9 h—1。
專利摘要
一種基于兩階段溶氧控制策略生產凝乳酶的方法，屬于微生物發酵技術領域：
。本發明采用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacines)CCTCCNOM2011045為生產菌株，所用發酵培養基以克/升計為葡萄糖5-20，麩皮10-30，氯化鈉6，七水硫酸鎂4.5，磷酸二氫鉀1，碳酸鈣3，用自來水配制，pH值自然，121℃滅菌30min；在發酵第一階段(0-16h)將氧體積傳質系數(KLa)控制在72.2h-1，發酵第二階段(16h以后)，將氧體積傳質系數(KLa)控制在33.9h-1。采用本發明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢桿菌發酵產酶水平，縮短發酵時間18小時以上，同時也為在實際的工業放大過程中提供了一種更為有效的方法。
文檔編號C12R1/07GKCN102517269SQ201110420007
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日
發明者丁明亮, 丁重陽, 張梁, 王博達, 石貴陽, 顧正華 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan