包含腺伴隨病毒構建體的靶向傳導氣道細胞組合物的制作方法

專利名稱:包含腺伴隨病毒構建體的靶向傳導氣道細胞組合物的制作方法
包含腺伴隨病毒構建體的靶向傳導氣道細胞組合物 關于聯邦資助的研究或開發的聲明
本工作中部分是在國立衛生研究院(National Institutes of Health)資助下進行(P01-HL051746)。美國政府可享有本發明的某些權利。
發明背景
腺伴隨病毒(AAV)是細小病毒(Parvovirus)家族的成員，它是小的無包膜、二十面體病毒，具有4. 7千堿基(1Λ)到61Λ的單鏈線性DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發現的，所以AAV指定為依賴病毒屬(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV基因組在感染后整合入宿主基因組)，感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后，整合的AAV基因組隨之得到解救、復制并包裝入感染的病毒)。非致病性，廣泛的宿主感染范圍，含有非分裂細胞和整合性的特點使AAV成為具有吸引力的輸送載體。
AAV衣殼含有三個病毒蛋白(VP)VPl、VP2和VP3的60個拷貝(總共)，預測比例為1 1 10，以T = 1排列的二十面對稱體。[H-J Nam等，J Virol. ,81(22) 12260-12271 (2007年11月)]。這三個VP蛋白由同一 mRNA翻譯，VPl除了 C末端含有完整VP2序列外，還包括獨特的N末端結構域[Nam等，如前引用]。VP2除了其C末端的VP3外，還包括額外的N末端序列。在AAV2[Q. Xie等，Proc Natl. Acad. Sci. USA 99: 10405-10410(2002)]和 AAV4[L. Govindasamy 等，J. Virol. ,80 :11556-11570]衣殼的 X 射線晶體結構和所有其它已確定的細小病毒衣殼的結構中，僅觀察到AAV衣殼蛋白(約530 個氨基酸)內的C末端多肽序列。VPl的N末端獨特區域，VPl和VP2的重疊區和VP3的前 14-16個N末端殘基是雜亂的[L.Govindasamy等，和Q.Xie等，如前引用]。冷凍電子顯微鏡和圖像重構數據說明在完整的AAV衣殼中，VPl和VP2蛋白的N末端區域序列定位在衣殼內[EJadron等，J.Virol. 79 =5047-5058(2005) ；Q. Xie等，如上引用]，受體和抗體都無法接近結合該區域[S. Kronenberg等，J. Virol.，79 =5296-5303 (2005)]。因此，認為受體連接和轉導表型由VP1-VP3的常見C末端結構域內的氨基酸序列決定[Nam等，如上引用]。除了包含靶向細胞核的核定位序列，已證明VPl獨特區域包含功能性的磷脂酶A2，該酶為受體連接后通往細胞核期間內涵體逃逸所需[JC Grieger等，J. Virol. 80 =5199-5210(2006)； F.，Sonntag 等，J. Virol. ,80 11040-11054 (2006) ]
許多年以來，本領域僅已知6個不同序列的AAV，大部分作為腺病毒制備培養中的污染物分離得到。最近，研究者描述了獲自組織的大量不同序列的AAWG. Gao等，Proc Natl Acad Sci USA, 100(10) :6081-6086 U003 年 5 月 13 日)；US-2003-0138772-A1 (2003 年 7 月M日)]，并且將這些AAV表征為不同的血清型和分化體⑴.Gao等，J.Virol.，78 (12) 6381-6388 (2004年6月)；國際專利公開號WO 2005/033321]。已報道不同的AAV表現出不同的轉染效率，也表現出對不同細胞或組織的趨向性。
腺伴隨病毒血清型6(AAV6)可有效轉導小鼠肺部的傳導氣道上皮和人氣道上皮 (HAE)細胞培養物。CL Halbert等，“腺伴隨病毒6型(AAV6)載體相較AAV2載體的介導小鼠肺部氣道上皮細胞的有效轉導”(Adeno-associated virus Type 6 (AAV6) Vectors Mediate Efficient Transduction of Airway Epithelial Cells in Mouse Lungs Compared to
4That of AAV2 Vectors)，J. Virol.，75 (14) :6615-6624 QOOl 年 6 月)。還可參見，CL Halbert 等，J Virol, 74 (3) 1524-1532 (2000 年 2 月)(比較不同的假型 AAV2/6，AAV2/3 和 AAV2)和 EA Rutledge 等，J Virol, 72(1) :309-319 (1998 年 1 月)(比較 AAV6，AAV2, AAV3和AAV4的感染性克隆)。基于大量新AAV序列的載體轉導效率已在小鼠氣道上皮(體內)和人纖毛氣道上皮(體外)進行評估[MP Limberis等，Molecular Therapy, 17(2) 四4-301(2009年2月)]。雖然3個載體都能在小鼠肺部表現出有效的轉導能力，但小鼠中觀察到的高轉導性在人細胞中只有兩個載體是可重復的。
將治療基因輸送到染病的體內氣道上皮是很有希望用于基因治療各種肺部疾病的選擇，所述疾病包括囊性纖維化氣道病(CF)、a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、慢性阻塞性肺病和肺動脈高壓[MK Aneja 和 C Rudolph, Curr Opin Mol Ther, 8 :432-438(2006)； PE Cruz φ, Pharmacogenomics,8 :1191-1198(2007) ；TR Flotte 等，Mol Ther, 15 229441(2007)]。然而，目前獲得安全有效的治療載體還是很難。
發明概述
本發明提供了一種分離肽，該肽允許修飾AAV衣殼以優選靶向肺部傳導氣道細胞和肺泡上皮細胞(優先于其他非肺細胞)。
一方面，本發明提供一種含有異源氣道傳導靶向肽的人工AAV衣殼，該靶向肽源自AAV分支A衣殼的可變環區IV和V的衣殼區域。在一個實施方式中，分支A衣殼選自 AAVU AAV6 和 hu48R3。
另一方面，本發明提供了含有如前所述人工衣殼的AAV載體，以及包裝于該衣殼的表達盒。
在另一個方面，本發明提供了含有如前定義的人工AAV衣殼的傳導氣道靶向部分，其中該人工AAV衣殼與能將之輸送到氣道傳導上皮中的分子相連。在另一方面，本發明提供了包含氣道靶向部分和生理相容性載體的藥物組合物。
在另一方面，本發明提供了改變親本AAV不能天然靶向傳導氣道細胞這一特異性的方法，以使之能夠靶向傳導氣道細胞。在另一方面，本發明提供了改變親本AAV不能天然靶向傳導肺泡上皮細胞這一特異性的方法，以使之能夠靶向這些細胞。
又一方面，本發明提供了一種培養的宿主細胞，該細胞包含人工的AAV衣殼或含人工的AAV衣殼的AAV載體。
另一方面，本發明提供了包含AAV載體和生理相容性載體的組合物。
在另一方面，本發明提供了優選靶向傳導氣道細胞和肺泡上皮細胞(優先于非肺細胞)的方法。該方法涉及將細胞與本文所述的AAV載體接觸。
另一方面，本發明提供通過輸送靶向部分或具有本文所述人工衣殼的AAV載體給需要的對象用于治療囊性纖維化(CF)氣道病，a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺動脈高壓的方法。
從下述發明詳述很容易了解本發明的上述和其他優勢。
附圖簡要說明
圖IA是AAV衣殼序列的示意圖，顯示VPl和VP2獨特區域和9個推定的可變環狀結構域。變換方式由A-F表示。圖IB是參考圖IA中鑒定的區域，通過PCR產生獨立片段的圖示。圖IC是重疊延伸拼接(SOE)反應的圖示，該反應在外部引物存在下發生于如圖IB所示產生的片段之間。
圖2是AAV6[SEQ ID NO 1]和AAV9[SEQ ID NO 2]衣殼的氨基酸序列比對，展示 vpl、vp2、vp3、8個β桶狀鏈和9個可變環狀結構域I、II、II、IV、V、VI、VII、VIII和IX的定位。
發明詳述
本發明提供了能將傳導氣道趨向性賦予不具有此趨向性的AAV衣殼的分離肽。該傳導氣道趨向性肽允許人工AAV衣殼靶向傳導氣道上皮和肺泡上皮，優先于非肺細胞和組織。從治療和安全性角度看這都是需要的，因為本文所述構建允許更多染病細胞的特異性靶向且能最小化或消除非靶向、非肺細胞和組織的轉導。
在一個實施方式中，本發明提供了包含異源氣道傳導細胞靶向肽的人工腺伴隨病毒衣殼。該肽源自包含可變環區IV和可變環區V的AAV衣殼區域。從圖2可容易看出，上述可變環區并非彼此直接相鄰，而是之間有其他AAV衣殼序列。按照本發明所述，異源氣道傳導細胞靶向肽可能還包括一些來自功能性分支A-AAV的氨基酸，該分支定位于可變環區IV的氨基末端但在可變環區III之外。雖然這個區域有約57個氨基酸用于功能性分支 A-AAV，但靶向肽可能包含0個、1到5個氨基酸或可變環IV的氨基末端的一些其他片段。 此外，異源氣道傳導細胞靶向肽可能還包括一些來自功能性分支A-AAV的氨基酸，該分支定位于所述肽段的羧基末端但在可變環區VI之外。雖然環V和環VI之間這個區域約有13 個氨基酸用于功能性分支A-AAV，但所述肽可能包含0個、1到5個氨基酸或這個區域的一些其他片段。
在一個實施方式中，功能性分支A AAV選自AAVl、AAV6、hu44R2和hu48R3 [TO 2006/110689]，它們都在此區域有一段相同的氨基酸序列。人工AAV衣殼包含的肽與AAV 可變環IV和/或可變環V區的羧基和/或氨基末端的氨基酸殘基側連，上述氨基酸殘基與親本AAV中側連此區域的氨基酸序列異源。
在一個實施方式中，所述氣道傳導細胞靶向肽設計到AAV衣殼的相應的可變環區中，該區域不是功能性分支A AAV0所述結果是得到了對傳導氣道(和任選的肺泡上皮)有趨向性和/或轉導有效性的人工衣殼，該趨向性與親本(來源)AAV的趨向性不同。這個人工衣殼可由不同的技術生成。
如本文所用，“親本AAV衣殼”指通過本文所述異源氣道傳導細胞靶向肽修飾其天然趨向性的衣殼。在一個實施方式中，親本AAV衣殼序列的來源是分支A以外的AAV，因為該分支的許多成員已表現出一些傳導氣道傾向性水平。功能性分支A AAV包括AAV6、AAV 1、 hu44R2 和 hu48R3。其他分支 A AAV 包括 hu. 44、hu. 46、hu. 43 和 hu. 48 等[W0 2005/033321 和 WO 2006/110689]。
其他AAV分支包括分支B (代表如，分支C (代表如AAV2-AAV3混合型)，分支D (代表如AAV7)，分支E (代表如AAV8)，分支F (代表如人AAV9)。前述的AAV3、AAV5和 rh32/33、rh34彼此顯著不同，但在本文所述的篩選中未檢測到，且沒有包括于這些分支中。 AAV分支的進一步討論可見于G. Gao等，J.Virol.，78 (12) :6381-6388 (2004年6月)和國際專利公開號W02004/(^8817和WO 2005/033321。后一文件還提供了新的人AAV序列，其通過引用納入本文。
然而，在另一個實施方式中，親本衣殼序列來自天然轉導傳導氣道細胞的AAV，其所處的水平會妨礙待用作任何治療或其他產品的載體或運載體的aav的輸送。
在一個實施方式中，傳導氣道靶向肽源自包含功能性分支a腺伴隨病毒的可變環區iv和可變環區v的區域。在一個實施方式中，功能性分支a-aav選自aavl、aav6、hu44R2 和hu48R3。在一個實施方式中，參照aav6衣殼(seq id no 1)的編號，該肽與aav6衣殼 (序列識別號1)的氨基酸約447-521相對應。因此，在一個實施方式中，該靶向肽含有氨基酸序列:seq id no :4nrtqnqsgsaqnkdllfsrgspagmsvqpknwlpgpcyrqqrvsktktdnnnsnftw tgaskynlngresiinpg.基于本文所提供的有關aav6氨基酸定位的信息，本領域技術人員可以很容易的通過用本領域已知的方法進行序列比對和/或通過衣殼晶體結構，確定其他分支a aav衣殼序列的對應序列。
在另一個實施方式中，傳導氣道靶向肽有約1-8個截自上述肽氨基和/或羧基末端的殘基。在又一實施方式中，氣道傳導細胞靶向肽是此區域中的功能性片段，即該區域中行使所需靶向功能的內部片段。這個片段的長度可能至少為約65個氨基酸，至少約50個氨基酸，至少約45個氨基酸或更短。適當地，參照aav6衣殼(seq id no=d的編號，這個片段源自范圍從氨基酸447到469、氨基酸447到472、氨基酸451到469、氨基酸451到474 的可變環區iv。在一個實施方式中，這些片段與來自分支a aav的可變環v序列相連。例如，可變環v范圍可能從分支a aav的氨基酸487到521，或從489到532，或可能是其行使所需靶向功能的片段(如487到506 ；487到510 ；489到506 ；487到510)。在一個實施方式中，可變環iv-v的所述區域，即氨基酸447到510，被用作傳導氣道傳導肽。在其他實施方式中，可變環iv和v內的片段在嵌合構建體中提供，而沒有相連的aav6氨基酸序列。在一個實施方式中，嵌合構建體包含aav或其他分支a aav的可變環區v而沒有其他aav6衣殼序列(如沒有可變環iv序列)。基于本文所提供的有關aav6氨基酸定位的信息，本領域技術人員可以很容易地通過序列比對和/或衣殼晶體結構，確定其他分支a aav衣殼序列的對應序列。
在又一個實施方式中，嵌合衣殼包含aav6的可變環區5或其片段(例如本文所述)在嵌合衣殼中，而沒有分支a aav(如aav6)的其他可變環區。在又一個實施方式中， 嵌合衣殼至少包含aav6的可變環區iv和v的片段。基于本文所提供的有關aav6氨基酸定位的信息，本領域技術人員可以很容易地通過序列比對和/或衣殼晶體結構，確定其他分支a aav衣殼序列的對應序列。
在一個實施方式中，氣道傳導氣道靶向肽可插入到親本AAV衣殼蛋白的對應區域內。根據本文提供的信息，本領域技術人員可容易地定位另外AAV(如分支A AAV以外的 AAV)的對應可變區域。本文的可變區域與AAV8相關的結構信息(nam等，J Virol, 81 (22) 12^0-12271 (2007年11月))相一致。本文
圖1_2提供了包括AAV6衣殼的示意圖和示范比對。其他衣殼蛋白比對也已描述[參見例如，WO 03/042397A1和WO 2005/033321]或可制備。
通常，當以AAV衣殼vpl蛋白為基礎來準備比對時，該比對包含了根據參比AAV序列(例如AAV2或aav6)鑒定的插入和缺失，且氨基酸殘基的編號是基于為該比對所提供的基準標度。但是，任何給定的AAV序列可含有比基準標度少的氨基酸殘基。在本發明中，當描述親代AAV和參考文庫的序列時，術語“同一位置”或“對應位置”指相對于比對序列所用的基準標度，各序列中定位于相同殘基編號的氨基酸。但是，在比對之外，各AAV vpl蛋白質內的這些氨基酸可能位于不同殘基編號。
可使用各種公知或市售的多序列比對程序(Multiple Sequence Alignment Programs)進行比對。用于氨基酸序列比對的程序有例如“Clustal X”，“MAP，，，“PIMA”， "MSA", “BLOCKMAKER”，“MEME”和“Match-Box”程序。雖然本領域技術人員可視需要改變設置，但通常這些程序都以默認設置使用。或者，本領域技術人員也可采用其他算法或計算機程序，其能夠提供與參考的算法和程序所提供的至少同水平的同一性或比對。參見例如 J. D. ThomsonNucl. Acids. Res.，多序列比對的綜合比較(A comprehensive comparison of multiple sequence alignments)，27(13) :2682-2690(1999)
還有許多本領域已知的算法也可用于測量核苷酸序列同一性，包括上述程序中所包含的算法。作為另一實例，可使用GCG 6. 1版中的程序!^asta來比較多核苷酸序列。Fasta 可提供查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區域的比對和序列同一性百分比。例如，可使用 GCG 6. 1版(通過引用納入本文)提供的Fasta及默認參數(字長為6和用于計分矩陣的 NOPAM系數)來確定核酸序列之間的序列同一性百分比。可采用相似程序進行氨基酸比對。 雖然本領域技術人員可視需要改變設置，但通常這些程序都以默認設置使用。或者，本領域技術人員也可采用其他算法或計算機程序，其能夠得出與參考算法和程序至少同水平的同一性或比對。
如前所述，氣道傳導肽序列可定位于異源衣殼序列上對應可變環區的天然位置。 這可通過本領域技術人員已知的各種技術完成，包括，例如利用如本文實施例所述或本領域已知的技術來交換所需區域。如下面實施例所述，這通常涉及剪切異源衣殼序列上對應的可變環區。然而，也可采用其他合適的技術，包括如，待改變的氨基酸密碼子的常規定點突變技術。通常，使用僅包括必須步驟的定點突變來獲得保守氨基酸殘基的所需密碼子。這類方法是本領域技術人員熟知的，并可使用公開的方法和/或市售的試劑盒來進行(如購自Mratagene和!Iomega)。可在AAV基因組序列上進行定點突變。為了方便起見，可用載體(如質粒骨架)攜帶AAV序列。或者，本領域技術人員可使用本領域已知的其他技術來改變親代AAV，如插入化學合成肽等等。
在一個實施方式中，功能性缺失可變環區。任選地，任意的間隔子與氣道傳導靶向肽可變區的羧基和/或氨基末端側連。在某些實施方式中，該間隔子是天然情況下不存在的非天然的外源氨基酸序列，即合成的或者人工設計或制備的多肽。這些間隔子可包含非分支A衣殼來源或非AAV來源的一到五個氨基酸。在一個實施方式中，在所選可變環中進行功能性缺失，而不將任何分子插入其中。這可滿足多種原因的需要，例如在衣殼其它部分中容納較大插入物。這種功能性缺失的AAV可用于產生AAV病毒粒以及其它應用。
通過本發明的構建，AAV或AAV衣殼的天然趨向性發生改變。因此，“改變趨向性” 指修飾的AAV衣殼或AAV載體表現出靶細胞結合特異性發生改變或不同于產生該修飾病毒的野生型病毒的結合特異性。因此，在一個實施方式中，本發明提供一種通過提供上述異源氣道傳導細胞靶向肽來改變所選AAV載體的特異性，從而使之靶向傳導氣道細胞的方法。 在其他實施方式中，該靶向肽還可賦予靶向肺泡上皮的能力。
在一個實施方式中，所述衣殼序列由單一的AAV來源提供。合適的AAV可選自不能正常有效轉導傳導氣道細胞的AAV，包括例如，AAV9、AAV5、AAV2、AAV8和AAVrh32. 22。 而其他AAV可很容易地選自已描述的AAV [W0 03/042397A1 ；WO 2005/033321 ；WO2006/110689]，特別是那些分支A以外的AAV。或者，該AAV衣殼可源自多于一個的AAV。
在一個實施方式中，所選的AAV衣殼缺少肝素結合基序。該AAV可天然地缺少肝素結合基序，或用如WO 2008/027084所述的方法將該肝素結合基序除去。也可對野生型 AAV序列進行其他修飾，例如用于提高人工衣殼蛋白或含有人工衣殼蛋白的AAV載體的生成、產量和/或回收。
術語“功能性”指行使其天然功能，盡管未必與天然產物水平相同，的產物(如蛋白質或肽)。術語“功能性”也可指編碼產物并可由其表達所需產物的基因。“功能性缺失” 指破壞產物行使其天然功能的能力的缺失。
除非另外說明(如上)，術語片段包括長度為至少8個氨基酸，至少15個氨基酸， 至少25個氨基酸的肽。然而，取決于需要的環境，可容易地采用其他所需長度的片段。可通過重組或其他合適的方法例如化學合成來產生這種片段。
對于蛋白質全長或其片段的氨基酸序列，術語“同一性百分比(％ ) ”可容易地確定。適當地，片段長度至少為約8個氨基酸，也可長達約700個氨基酸。通常，當提及兩種不同的腺伴隨病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”時，“同一性”、“同源性”或“相似性”是參照“比對”序列確定的。“比對”序列或“比對排列”指多種核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，通常包含與參考序列相比缺失的或額外的堿基或氨基酸的校正。
如本說明書和權利要求
書中所用，術語“包括”和“含有”和其變體，包括“包含”、 “包容”和“含”等其他形式指包含其它的組分、元素、數值、步驟等。術語“由...組成”或 “組成為”則不包含其他的組分、元素、整數、步驟等。
肺/傳導氣道靶向部分
在一個實施方式中，本發明提供人工AAV衣殼，該衣殼是“空衣殼”，即包含無功能序列包裝的衣殼。換言之，該衣殼缺少AAV病毒基因組和/或不含有表達框。在一個實施方式中，人工AAV衣殼沒有功能性AAV序列包裝。在另一個實施方式中，該AAV不含有功能性AAV基因編碼序列且不含有內源或異源表達盒。
“空的”AAV衣殼可用作異源分子的靶向蛋白。所需治療或免疫原性或其他分子可通過“接頭”序列的方法與本發明的人工AAV衣殼相關聯。
在一個實施方式中，該AAV衣殼和分子間的化學交聯通過共價或非共價連接。然而正如本領域已知，也可采用其他親和性結合配對。還可考慮本領域已知的其他偶聯化學方法并用于本文的實施方式，包括但不限于活化聚乙二醇(PEG)，基于馬來酰亞胺酯或琥珀酰亞胺酯的交聯劑或SATA-SMCC雙功能交聯劑及本領域技術人員已知的其他連接。在另一個實施方式中，感興趣的分子可通過PEG接頭(‘間隔子’)與空AAV衣殼相連，如Destito 等，Chem Biol 2007 年 10 月；14(10) :1152-1162(2007)和 Oh 等，Bioconjug Chem 2006 ； 17 :721-727(2006)所述。
在另一個實施方式中，如Chatterji 等，Bioconj Chem ；15 :807-813(2004)所述，
通過化學修飾AAV表面賴氨酸殘基(用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯)或巰基基團(用馬來酰亞胺和鹵代乙酰胺試劑)來連接感興趣的分子。在又一個實施方式中，修飾表面羧酸基團用于特異性連接。
在另一個實施方式中，感興趣的分子可通過免疫球蛋白分子的AAV結合結構域連接到AAV衣殼。在另一個實施方式中，該結合結構域可以是免疫球蛋白分子的Fab、Fab'、(Fab' )2或？￥片段。該結合結構域可通過任何已知的(包括上述的那些)方法連接感興趣的分子。在一個實施方式中，PEG接頭納入結合結構域和感興趣的分子之間。
通過連接于接頭序列來摻入DNA或氨基酸序列的這種構建技術在本領域已知，且屬于蛋白質/遺傳工程領域的常規技術。
連接AAV衣殼并輸送到靶細胞的有用分子可包括用于治療疾病如囊性纖維化、 a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺動脈高壓、哮喘、肺癌的分子。合適的分子例子包括基于非病毒的載體(如質粒、“裸露DNA”、粘粒等)，它們攜帶有表達基因產物的核酸。合適的基因產物例子包括下文所述與表達盒相關的產物。此外，基于其他非核酸的分子也可用于此實施方式中，包括例如類固醇、類固醇衍生物、免疫調節分子、酶、蛋白、小分子和其他化學部分。
在另外的實施方式中，包括異源氣道傳導細胞靶向序列的人工AAV衣殼用于生產包裝有表達盒并輸送產物到靶細胞的載體。
具有含傳導氣道靶向結構域的人工AAV衣殼的AAV載體
在一方面，本發明提供了一種產生具有本發明新AAV衣殼的重組腺伴隨病毒 (AAV)的方法。所述方法涉及培養宿主細胞，該宿主細胞含有如本文所定義的編碼本發明新 AAV衣殼蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重復(ITR)和轉基因組成的表達盒；和足夠的輔助功能因子以將表達盒包裝進AAV衣殼蛋白。
在宿主細胞內培養將AAV表達盒包裝進AAV衣殼所必需的成分可以反式方式提供給宿主細胞。或者，通過用本領域技術人員已知的方法改造而含有一種或多種必需成分的穩定宿主細胞來提供一種或多種必需成分(例如表達盒、rep序列、cap序列和/或輔助功能因子)。更適當地，這種穩定的宿主細胞含有在誘導型啟動子控制下的所需成分。然而， 所需成分也可在組成型啟動子的控制下。在關于適用于轉基因的調節元件的討論中，本文提供了適當誘導型和組成型啟動子的實例。再或者，所選穩定宿主細胞可含有在組成型啟動子控制下的選定成分和在一個或多個誘導型啟動子控制下的其他選定成分。例如可產生源自293細胞(其含有在組成型啟動子控制下的El輔助功能因子)的穩定宿主細胞，但其含有在誘導型啟動子控制下的rep和/或cap蛋白。本領域技術人員也可制備其他穩定的宿主細胞。
產生本發明的rAAV所需的表達盒、rep序列、cap序列和輔助功能因子可以以轉移所攜帶序列的任意遺傳元件的形式輸送至包裝宿主細胞。所選遺傳元件可通過任何適當的方法，包括本文所述的方法來輸送。用于構建本發明任意實施方式的方法是核酸操作領域技術人員已知的且包括遺傳工程、重組工程與合成技術。參見，例如Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約。類似地，產生rAAV病毒粒子的方法也是眾所周知的，并且適當方法的選擇不是對本發明的限制。參見例如，K. Fisher 等，J. Virol.，70 :520-532 (1993)和美國專利號 5，478，745。
除非另有說明，本文所述的AAV ITR與其他選定的AAV成分可容易地選自任何AAV,包括但不限于AAV2、AAV7、AAV9和其他AAV序列[如，W003/042397A1 ；WO 2005/033321 ；WO 2006/110689]。可使用本領域技術人員已知的技術容易地從AAV序列中分離這些ITR或其他AAV成分。所述AAV可分離獲得或來自學術、商業或公開來源(例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)，瑪納薩斯，弗吉尼亞州)。或者，所述AAV序列可參考例如文獻或數據庫(例如GenBank 、PubMed 等)中的已公開序列通過合成或其他適當的方
法獲得。
A.表達盒
表達盒最小要由至少一個AAV反向末端重復序列、轉基因和其調控序列組成。在一個實施方式中，5’ AAV反向末端重復(ITR)和3’ ITR都包括在表達盒中。在一個理想的實施方式中，所述表達盒含有的ITR來自除提供AAV衣殼蛋白序列以外的AAV序列。例如， 為方便起見，可采用含有AAV2ITR的假型載體。然而，也可選擇其他適當來源的ITR。該表達盒被包裝進衣殼蛋白并輸送至選定的宿主細胞。
1.轉基因
該轉基因是編碼感興趣的多肽、肽、蛋白質、酶或其他產物，并與其側連的載體序列異源的核酸序列。在一個實施方式中，所述表達盒攜帶核酸序列，如RNA。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、RNAi、核糖體RNA、催化性RNA、siRNA、小發夾RNA、反式剪接RNA和反義RNA。有用的RNA序列的一個例子是抑制或消除靶核酸序列在經處理的動物中表達的序列。通常，合適的靶序列包括腫瘤靶標和病毒疾病。這在如癌癥治療和疫苗方面可能有所作用。
所述核酸編碼序列以允許轉基因在宿主細胞中轉錄、翻譯和/或表達的方式操作性連接調節組分。
雖然任何不同的產物都可用本發明的構建來輸送，但本發明特別適合輸送產物用于傳導氣道細胞相關病癥的診斷、治療和疫苗接種和其癥狀的改善。這些病癥包括但不限于囊性纖維化、a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺動脈高壓。合適的基因產物可包括功能性的囊性纖維化跨膜調節子(CFTR)序列、a-Ι-抗胰蛋白酶、分泌白細胞蛋白酶抑制劑、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白D(SPD)、免疫調節劑例如白介素如白介素-12、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素如干擾素-β和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。其他其他基因產物可包含癌癥治療劑，包括例如p53、FUSl、RNA(包括RNAi)等。本領域技術人員也可容易地選出其他合適的表達產物。
2.調節元件
除了如上鑒定的表達盒的主要元件以外，載體還包含常規控制元件，這些常規控制元件以允許轉基因在本發明產生的質粒載體所轉染或病毒所感染的細胞中轉錄、翻譯和 /或表達的方式操作性地連接轉基因。本文所用的“操作性相連”序列包括與感興趣的基因毗連的表達控制序列和反式或在遠端作用的表達控制序列以控制感興趣基因。
表達控制序列包括合適的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號例如剪接和聚腺苷酸化(PolyA)信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高翻譯效率的序列 (即Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及在需要時增強編碼產物分泌的序列。許多表達控制序列是本領域已知并可利用的，其包括天然、組成型、誘導型和/或組織特異性啟動子。
組成型啟動子的例子包括但不限于逆轉錄病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子(任選有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選有CMV增強子)[參見例如， Boshart等，Cell，41 :521-530 (198 ]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β -肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EFl啟動子(Invitrogen)。誘導型啟動子能
11調節基因表達，并可通過外源提供的化合物，環境因素(例如溫度)，或特定生理狀態的存在(例如急性期、細胞的特定分化狀態、或僅在復制細胞中)來調節。誘導型啟動子和可誘導系統可從多種商業來源獲得，包括但不限于hvitrogen、Clontech和Ariad。已描述了許多其他系統且可由本領域技術人員方便選擇。受外源補充化合物調節的誘導型啟動子的例子包括鋅誘導的羊金屬硫蛋白(MT)啟動子，地塞米松(Dex)-誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子，T7聚合酶啟動子系統[國際專利公開號WO 98/10088]，蛻皮素昆蟲啟動子[No等，Proc. Natl. Acad. Sci.美國，93 :3；346_3351 (1996)]，四環素阻抑系統[Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sci.美國，89 :5547-5551 (1992)]、四環素誘導系統 [Gossen 等，Science，268 :1766-1769 (1996)，也參見 Harvey 等，Curr. Opin. Chem. Biol.，2 512-518 (1998)]，RU486-誘導系統[Wang 等，Nat. Biotech. , 15 :239-243(1997)和 Wang 等， Gene Ther.，4 :432-441(1997)]和雷帕霉素誘導系統[Magari 等，J.Clin· Invest.，100 觀56-2872(1997)]。可用于本發明的其他誘導型啟動子類型由特定的生理狀態如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態、或僅在復制細胞中調節。
在另一個實施方式中，使用了轉基因的天然啟動子。當需要轉基因的表達模擬天然表達時，可優選天然啟動子。當轉基因的表達必須按時間或按發育階段、或以組織特異性方式或響應特定的轉錄刺激來調節時，可使用天然啟動子。在另外的實施方案中，也可使用其他天然表達控制元件，例如增強子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表達。
轉基因的另一實施方式包含操作性連接于組織特異性啟動子的基因。例如，可使用肺組織特異性啟動子和傳導氣道細胞特異性啟動子(可獲得時)。這些啟動子的例子包括例如，叉頭框Jl (FOXJl)啟動子，聚泛素啟動子WdC，包含SAM指向結構域的ETS轉錄因子 (SPDEF)啟動子，克拉拉細胞分泌蛋白/子宮球蛋白(CCSP/UG)啟動子等。其他肺特異基因啟動子可包括例如，表面活性蛋白B(SPB)，表面活性蛋白C(SPC)，表面活性蛋白A(SPA)Jh 源人癌胚抗原(CEA)啟動子，甲狀腺轉錄因子I(TTFl)和人表面活性蛋白Al(hSPAl)等。
任選地，攜帶有治療用途的轉基因的質粒還可含有選擇性標記或報道基因，其包含編碼抗遺傳霉素、潮霉素或嘌呤霉素等的序列。這種選擇性報道基因或標記基因(優選位于本發明方法解救的病毒基因組之外)可用來指示細菌細胞中質粒的存在，例如氨芐青霉素抗性。質粒的其他成分可包括復制起點。這些和其他啟動子及載體元件的選擇是常規的且很多這些序列是可獲得的。
為援引方便，轉基因、啟動子/增強子與AAV ITR的組合在本文中稱為表達盒。根據本說明書的教導，這些表達盒的設計可通過采用常規技術制備。
3.將表達盒輸送至包裝宿主細胞
可用任何輸送至包裝宿主細胞的適當載體例如質粒來攜帶所述表達盒。用于本發明的質粒可改造成適合在原核細胞、哺乳動物細胞或這二種細胞中復制和任選地整合。這些質粒(或其他攜帶5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR的載體)含有允許表達盒在真核細胞和/或原核細胞中復制的序列和用于這些系統的選擇標記。選擇性標記或報道基因可包括編碼抗遺傳霉素、潮霉素或嘌呤霉素等的序列。這些質粒還可含有某些選擇性報道基因或標記基因以指示細菌細胞中載體的存在，例如氨芐青霉素抗性。質粒的其他成分可包括復制起點和擴增子，例如使用愛波斯坦-巴爾(Epstein Barr)病毒核抗原的擴增子系統。該擴增子系統或其他類似的擴增子成分允許細胞中高拷貝游離型復制。攜帶所述表達盒的分子優選轉染入其可在之中暫時存在的細胞。或者，所述表達盒(攜帶5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR)可穩定地整合進宿主細胞的基因組，或進入染色體或作為游離體存在。在某些實施方式中，所述表達盒可以多拷貝形式存在，任選地以頭-對-頭、頭-對-尾或尾-對-尾的串聯體形式。合適的轉染技術是已知的，并可容易地用于將所述表達盒輸送至宿主細胞。
通常，當通過轉染輸送含有所述表達盒的載體時，將約5yg至約IOOyg DNA、約 10 μ g至約50 μ g DNA量的載體輸送到約IX IO4至約IX IO13個細胞或約IX IO5個細胞中。 然而，考慮到諸如所選擇的載體、輸送方法和所選擇的宿主細胞等因素，本領域普通技術人員可調整載體DNA與宿主細胞的相對量。
B. Rep 與 Cap 序列
除了所述表達盒以外，宿主細胞還含有在宿主細胞中驅動本發明的新AAV衣殼蛋白(或含有其片段的衣殼蛋白)表達的序列和與上述表達盒中發現的AAVITR相同來源或來自交叉互補來源的r印序列。AAV cap和r印序列可從前述AAV源獨立地獲得，并可以前述本領域人員已知的任何方式引入宿主細胞。此外，在假型化AAV載體時，編碼各必需r印蛋白的序列可由不同的AAV來源提供(例如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、本文所述的或本領域已知的其他AAV序列之一)。例如，r印78/68序列來自AAV2，而r印52/40 序列來自AAV8。
在一個實施方式中，宿主細胞穩定地含有在合適啟動子(如前文所述)控制下的所述衣殼蛋白。在該實施方式中，所述衣殼蛋白最理想是在誘導型啟動子的控制下表達。在另一個實施方式中，所述衣殼蛋白以反式方式提供給宿主細胞。當以反式輸送至宿主細胞時，所述衣殼蛋白可通過含有指導宿主細胞中選定衣殼蛋白表達所需序列的質粒來輸送。 當以反式輸送至宿主細胞時，攜帶所述衣殼蛋白的質粒最理想還攜帶包裝rAAV所需的其他序列，如所述rep序列。
在另一個實施方式中，宿主細胞穩定地含有在合適啟動子(如前文所述)控制下的所述rep序列。在該實施方式中，所述必需r印蛋白最理想是在誘導型啟動子的控制下表達。在另一個實施方式中，所述rep蛋白以反式方式提供給宿主細胞。當以反式輸送至宿主細胞時，所述rep蛋白可通過含有指導宿主細胞中選定rep蛋白表達所需序列的質粒來輸送。
因此，在一個實施方式中，所述I^p和cap序列可以在單一核酸分子上轉染入宿主細胞，并且作為游離體穩定地存在于細胞中。在另一個實施方式中，所述rep和cap序列穩定地整合進細胞的染色體。在另一個實施方式中，所述rep和cap序列在宿主細胞中瞬時表達。例如，用于這種轉染的有用核酸分子從5’到3’含有啟動子、插在啟動子與所述rep 基因序列起始位點之間任選的間隔子、AAVr印基因序列和AAV cap基因序列。
任選地，所述r印和/或cap序列可提供在含有待引入宿主細胞的其他DNA序列的載體上。例如，該載體可包括含有所述表達盒的rAAV構建體。該載體可含有一個或多個編碼輔助功能因子的基因，如腺病毒蛋白El、Eh和E4 0RF6基因與VAI RNA基因。
用于該構建體的啟動子優選本領域技術人員已知的或前文所述的任意組成型、誘導型或天然啟動子。在一個實施方式中，使用AAV P5啟動子序列。選擇AAV來提供任何這些序列不構成對本發明的限制。
在另一個優選的實施方式中，rep的啟動子是誘導型啟動子，例如前文所述與轉基因調節元件相關。Rep表達的優選啟動子之一是T7啟動子。將含有T7啟動子調節的rep基因和cap基因的所述載體轉染或轉化入組成型或誘導型表達T7聚合酶的細胞。參見1998 年3月12日公開的國際專利公開號WO 98/10088。
在設計上述載體中，間隔子是可選元件。該間隔子是插在啟動子和rep基因ATG起始位點間的DNA序列。該間隔子可具有任何所需的設計；即它可是隨機的核苷酸序列，或者可編碼基因產物，例如標記基因。該間隔子可含有通常包括起始/終止和PolyA位點的基因。該間隔子可以是來自原核生物或真核生物的非編碼DNA序列、重復非編碼序列、無轉錄控制的編碼序列或有轉錄控制的編碼序列。間隔子序列的兩個示例來源是λ噬菌體梯序列或酵母梯序列，二者可購自例如Gibco或hvitrogen等。該間隔子大小可任意，只要足以降低r印78和r印68基因產物的表達，且r印52、rep40和cap基因產物的表達處于正常水平。因此，該間隔子的長度范圍約為IObp-約ΙΟ.ΟΙΛρ，優選范圍為約IOObp-約8. OlAp。 為減少重組的可能性，該間隔子長度優選小于21Λρ ；然而，本發明不限于此。
雖然提供rep和cap的分子可能短暫(即通過轉染)存在于宿主細胞中，但優選 rep和cap蛋白之一或二者與控制其表達的啟動子在宿主細胞中穩定地表達，例如作為游離體或通過整合進宿主細胞染色體。用于構建本發明實施方式的方法是常規遺傳工程或重組工程技術，如前文參考文獻所述的技術。雖然本說明書提供了具體構建體的說明性實例， 但本領域技術人員可使用本文提供的信息來選擇間隔子、P5啟動子和其他元件(包括至少一個翻譯起始和終止信號和任選加入的聚腺苷酸化位點)，從而可選擇和設計其他合適的構建體。
在本發明的另一個實施方式中，宿主細胞可穩定地提供上述I^p或cap蛋白。
C.輔助因子功能
為包裝本發明的rAAV，包裝宿主細胞還需要輔助因子功能。任選地，這些功能可由皰疹病毒提供。所需的輔助功能因子最理想分別由人或非人靈長類腺病毒源(如前文所述)提供，和/或可獲得自各種來源(包括美國典型培養物保藏中心(ATCC)，瑪納薩斯，弗吉尼亞州(美國))。在一個目前優選的實施方式中，宿主細胞提供有和/或含有Ela基因產物、Elb基因產物、Eh基因產物和/或E4 0RF6基因產物。宿主細胞可含有其他腺病毒基因，例如VAI RNA,但這些基因不是必需的。在優選的實施方式中，宿主細胞中不存在其他腺病毒基因或基因功能。
腺病毒Ela、Elb、Eh和/或E4 0RF6基因產物以及任何其他需要的輔助因子功能可采用任何使其在細胞中表達的方法提供。編碼這些產物的序列可各自位于單獨的載體上，或者一個或多個基因可位于同一載體上。所述載體可以是本領域已知的或前文所述的任何載體，包括質粒、粘粒和病毒。該載體可通過本領域已知或前文所述的任何方法引入宿主細胞，包括轉染、感染、電穿孔、脂質體輸送、膜融合技術、高速DNA-包被小球、病毒感染與原生質體融合等。一個或多個腺病毒基因可穩定地整合入宿主細胞基因組，作為附加體穩定表達，或者瞬時表達。基因產物可全部瞬時表達(在游離體上或穩定整合)，或者，一些基因產物可穩定地表達，而另一些瞬時表達。此外，各腺病毒基因的啟動子可彼此獨立地選自組成型啟動子、誘導型啟動子或天然腺病毒啟動子。上述啟動子可由生物體或細胞的特
14定生理狀態調節(即，分化狀態或復制中或靜息細胞)或由其他方法例如外源添加因子調節。
D.宿主細胞和包裝細胞系
宿主細胞本身可選自任何生物體，包括原核細胞(如細菌)和真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。特別理想的宿主細胞選自任何哺乳動物種類細胞，包括但不限于A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、C0S U COS 7、BSC U BSC 40、BMT 10, VERO、 W138、HeLa,293細胞(表達功能性腺病毒El)、Saos, C2C12、L細胞、HT1080、H印G2和來源于哺乳動物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和倉鼠)的初級成纖維細胞、肝細胞和成肌細胞。提供細胞的哺乳動物種類的選擇和哺乳動物細胞類型的選擇(即成纖維細胞、肝細胞、腫瘤細胞等)不限制本發明。對所使用細胞的要求是它不攜帶任何除El、Eh和/或E4 0RF6 以外的腺病毒基因；它不含有在rAAV產生過程中可導致污染病毒的同源重組的任何其他病毒基因；并且，它能被DNA感染或轉染并表達所轉染的DNA。在優選的實施方式中，宿主細胞是其中有rep和cap穩定轉染的細胞。
用于本發明的宿主細胞是用編碼rep和cap的序列所穩定轉化的，并用腺病毒E1、 Eh和E4 0RF6 DNA和攜帶有前述表達盒的構建體所轉染的宿主細胞。也可類似地使用穩定的I^P和/或cap表達細胞系，例如B-50 (國際專利申請公開號WO 99/15685)，或美國專利號5，658，785所述的細胞系。另一種理想的宿主細胞含有足以表達E4 0RF6的最少腺病毒DNA。然而使用本發明的新型單一校正的AAV cap序列還可構建出其他細胞系。
按本發明制備宿主細胞涉及諸如裝配選定的DNA序列等技術。這種裝配可使用常規技術實現。這些技術包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等的著作中的cDNA和基因組克隆、使用腺病毒和AAV基因組的重疊寡核苷酸序列，結合聚合酶鏈式反應、合成方法以及提供所需核苷酸序列的任何其他合適方法。
也可使用技術人員已知和本說明書中討論的技術將這些分子(如質粒或病毒)引入宿主細胞。在優選的實施方式中，使用標準轉染技術，如CaPO4轉染或電穿孔和/或用雜交腺病毒/AAV載體感染細胞系，該細胞系例如人胚胎腎細胞系HEK293 ( 一種含功能性腺病毒El基因的人腎細胞系，其提供反式作用的El蛋白)。
藥物組合物及其應用
藥物組合物包含的氣道靶向分子如上文所述，它含有人工AAV衣殼(與用于輸送到氣道傳導上皮的部分相連)和生理相容性載體。其他藥物組合物包括AAV載體，該載體含有本文所述人工AAV衣殼和生理相容性運載體。這些組合物非常適于優先靶向傳導氣道細胞和肺泡上皮細胞(優先于靶向非肺部細胞)。在一個實施方式中，這些組合物與適于鼻內、口服或氣管內輸送的運載體一同制備。然而也可選擇其他制劑和輸送方式。
包含所述人工AAV衣殼的重組載體可按照公開的方法輸送至宿主細胞中。可將所述rAAV給予人或非人哺乳動物患者，優選懸浮在生理相容性運載體中的rAAV。本領域技術人員可依據轉移病毒所針對的適應癥容易地選擇適當的運載體。例如，適當的運載體包括可用各種緩沖液配制的鹽水(例如磷酸緩沖鹽水)。其他的運載體例子包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。
任選地，上述組合物可含除所述AAV和運載體以外的其他常規藥物組分，例如防腐劑或化學穩定劑。適當的防腐劑示例包括氯代丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類、乙基香草醛、甘油、苯酚與對氯苯酚。適當的化學穩定劑包括明膠和白蛋白。
給予足量的所述載體或AAV靶向部分以提供療效且沒有過多的不良作用，或有醫學上可接受的生理作用，這些作用可由醫學領域的技術人員確定。常規的和藥學上可接受的給藥途徑包括但不限于直接輸送至需要的器官(如肺)、口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、真皮內和其他胃腸外給藥途徑。如果需要，可聯用給藥途徑。
所述病毒載體或靶向部分的劑量主要取決于以下因素，如治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此可依患者而改變。例如，病毒載體的人用治療有效劑量范圍一般為含有濃度約ι χ IO9-I X IO16個基因組病毒載體的約0. ImL-約IOOmL溶液。輸送至大器官(例如肝、肌肉、心臟和肺)的優選的人用劑量可約為5X101(I-5X1013個AAV基因組，體積約為Ι-lOOmL。輸送至眼的優選劑量約為5X109-5X1012份基因組拷貝，體積約為 0. lmL-lmL。例如，氣道傳導細胞靶向部分的人用治療有效劑量范圍一般約為IOOyg到約 IOmg該部分。它可在溶液(如約0. Iml到約IOOml溶液)中輸送。對于上述病毒載體和靶向部分，可調整該劑量以平衡療效與任何副作用，并且這種劑量可根據使用重組載體的治療性用途而改變。可檢測上述轉基因的表達水平和/或上述治療分子或免疫分子的循環半衰期以確定劑量頻率。任選地，可采用與治療目的所述方案相似的給藥方案，以用本發明的組合物來免疫接種。
后文提供了用本發明的AAV源構建體進行輸送的治療性產物和免疫原性產物的實例。如本文所述，這些構建體可用于各種治療性或接種方案。此外，在所需治療性和/或接種方案中，這些載體可與一種或多種其他載體或活性成分聯合輸送。
實施例
以下實施例僅是示例性的，并不限制本發明。
實施例1 具有AAV/9嵌合衣殼的AAV
A.具有可變環區IV-V的AAV嵌合體的構建
用PCR重疊序列延伸拼接將AAV6和AAV9衣殼的特定結構域交換(圖1A_C)。此方法涉及用引物擴增每個載體衣殼上待交換的區域。這些引物的5’突出端設計有10-15個與異源衣殼序列互補的堿基對，從而PCR產物的末端包含互補序列。這就使得片段在第二個PCR反應(用一組與外部5’和3’末端互補的引物)中連接到一起形成嵌合衣殼序列。 F指正向引物，R指反向引物。
AAV6 VL IV-V
5 ‘ -AGCCTGGACCGRCTATGAATCC-3‘
5' -GCCATAGCAGGTCCAGGGTTGAT-3‘[0111]AAV9 VPl-VL IV
5' -AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3
5' -GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3‘
AAV9 VL V-末端
5' -ATCAACCCTGGACCTGCTATGGC-3‘
F SEQ ID NO 5 R SEQ ID NO 6
F SEQ ID NO 7 R SEQ ID NO 8
F SEQ ID NO9
16[0116]5' -ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3‘ R SEQIDN0:10
構建了 12個嵌合體，包括VPl和VP2獨特區域與9個推定的衣殼表面可變環區的交換。
之后通過限制性位點酶消化將這些嵌合衣殼序列克隆到含有AAV2rep基因的質粒中，然后將它們和包含GFP的質粒一同轉染到293細胞內，該GFP由巨細胞病毒(CMV)啟動子表達且與AAV2反向末端重復(ITR)和AdV輔助質粒側連。這些載體中的6個進行大規模制備并純化，表達來自CMV啟動子的GFP或來自雞β-肌動蛋白(CB)啟動子的nLacZ。 載體效價用TaqMan實時PCR確定，該反應使用牛生長激素(bGH)聚A(polyA)特異性引物和探針。
B.人氣道上皮細胞培養物的轉導
隨后，在人氣道上皮(HAE)細胞培養物中檢測這6個載體的轉導情況以確定它們轉導人傳導氣道細胞的能力[TE Gray等，Am J Respir Cell Mol Biol, 14 104-12 (1996)]。初級HAE細胞(Lonza)按每孔 50，000個細胞接種在24孔Transwell 板上。這些細胞在完全融合后和用于實驗前，要在氣液界面生長至少4周以進行適當的細胞分化。為了檢測HAE細胞的AAV轉導，這6個表達GFP的AAV嵌合體(在50 μ 1中)按每孔IxlO11個基因組拷貝(GC)加到HAE細胞的頂層，AAV2/6和AAV2/9用作對照。2小時后取出載體并將上述細胞維持在氣液界面。5天后評估GFP表達。
此實驗說明，交換AAV6衣殼(SEQ ID NO 1的氨基酸447-521)的可變環區IV-V 到AAV9衣殼(AAV2/9-6VL IV-V)的轉導與AAV6相似，而AAV9則不能正常轉導傳導氣道細胞。相反，交換AAV9的同源區域到AAV6衣殼(AAV2/6-9VL IV-V)消除了 AAV6有效轉導 HAE細胞的能力這說明AAV6衣殼的該結構域對于傳導氣道傾向性很重要。此外，由于沒有在其他嵌合載體中觀察到相同結果，此現象對AAV6的可變環區IV-V具有特異性。
C.鼠肺的體內轉導
這些載體的轉導情況也在鼻內滴注的小鼠肺中進行檢測。將IxIO11GC的各表達 nLacZ的嵌合體在總體積50 μ 1的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中經鼻內輸送給C57B1/6小鼠， AAV2/6和AAV2/9用作對照。21天后，先用最適切割溫度(OCT)復合物和PBS的1 1混合物使肺膨脹，取出并在OCT下冷凍以用于β -gal表達的切片和染色。
同樣，觀察到交換AAV6衣殼的可變環區IV-V到AAV9衣殼賦予了 AAV9新的傳導氣道上皮趨向性。相反，交換AAV9的同源區域到AAV6衣殼則消除了 AAV6的轉導。
總體上，這些研究表明AAV6衣殼中對于傳導氣道細胞轉導重要的結構域得到鑒定。可變環區IV-V(AAV6的氨基酸447-521)定位于衣殼二十面體三重軸線上表面裸露的突起上，且可決定轉導所需的細胞相互作用。
實施例2 在AAV9衣殼中具有AAV6窄VL IV和窄VL V的AAV6/9嵌合體
A.構建具有可變環區IV-V的AAV嵌合體
利用實施例1所述的方法通過PCR重疊序列延伸拼接，將AAV6可變環區IV和可變環區V的窄片段插入到AAV9衣殼中，該衣殼中AAV9的相應區域被去除。F指正向引物， R指反向引物。
AAV9 VPl-VL IV 窄片段
5' -AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3‘F SEQ ID NO: 110131]5' -TCCGGACTGATTCTG/AGTCTTTGAGAGAT-3
0132]AAV6 VL IV 窄片段
0133]5' -ATCTCTCAAAGACT/CAGAATCAGTCCGGA-3
0134]5' -ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3‘
0135]AAV9 VL IV窄片段-VL V窄片段
0136]5' -GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3‘
0137]5' -TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3‘
0138]AAV6VLV 窄片段
0139]5' -GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3‘
0140]5 ‘ -CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3‘
0141]AAV9 VL V窄片段-末端
0142]5 ‘ -TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3‘
0143]5' -ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3‘
F SEQ ID NO 19 R SEQ ID NO 20
F SEQ ID NO 17 R SEQ ID NO 18
F SEQ ID NO 15 R SEQ ID NO 16
F SEQ ID NO 13 R SEQ ID NO 14
R SEQ ID NO 12
窄的AAV6VL-IV窄片段對應于SEQ ID NO :1的氨基酸序列450-469。上述窄的 AAV6VL-V窄片段對應于SEQ ID NO 1的氨基酸序列487-505。所得嵌合衣殼包含與每個 AAV6可變環區的氨基末端和羧基末端側連的AAV9衣殼序列，包括定位在AAV6VL-IV窄片段羧基末端和AAV6VL-V窄片段氨基末端之間的氨基酸序列。
通過限制性位點酶消化將這些構建的嵌合衣殼序列克隆到含有AAV2 rep基因的質粒中，然后將它們和包含螢火蟲螢光素酶(ffluc)的質粒在六孔板上一同轉染到293細胞內，該螢光素酶由巨細胞病毒(CMV)啟動子表達且與AAV2反向末端重復(ITR)和AdV輔助質粒側連。轉染后每天更換培養基，并在轉染3天后收集細胞裂解物。裂解物經過三次冷凍/融化然后沉淀以去除細胞碎片。然后用SV聚A(ployA)-特異性引物和探針進行定量PCR確定載體基因組拷貝(GC)的效價。
所得帶有ffluc表達盒的嵌合AAV病毒顆粒表現出約IxlO11基因組拷貝/mL水平的效價，該效價處于觀察到的AAV2/6和AAV2/9對照(包含相同的表達盒但分別含有完整的AAV6或AAV9衣殼)的效價之間。
將293細胞以每孔IxlO5個細胞接種于96孔板上以檢測體外轉導。IxlOi3GC的各載體在總體積IOOul培養基里一式三份加入到上述細胞中。孵育過夜后，取出上述載體并更換新的培養基。轉導72小時后，用發光成像檢測ffluc的表達。
對如上所述制備的嵌合構建體AAV2/9(具有窄的可變環區IV和窄的可變環區 V(AAV6的氨基酸487-50 )進行小規模效價測試和293細胞的體外轉導測試。觀察到的效價約為IxlO11基因組拷貝/mL ；這些效價高于AAV2/6對照的觀察值，但低于AAV2/9對照的觀察值。上述嵌合體AAV2/9(具有AAV6可變環區IV和窄的可變環區V)的體外轉導水平低于AAV2/6對照的觀察值，但高于AAV2/9對照的觀察值。
結果顯示，具有窄IV和窄V的嵌合體AAV6的轉導水平略高于AAV2/9，而低于 AAV2/6。
進行這些構建體的大規模制備并如實施例1所述在鼠肺中評估。
實施例3 在AAV9衣殼內具有AAV6可變環區V的AAV6/9嵌合體
利用實施例1所述的方法進行PCR重疊序列延伸拼接，將AAV6可變環區V的窄片段插入到AAV9衣殼中(缺少AAV6可變環區IV)，該衣殼中AAV9的相應區域被去除。F指正向引物，R指反向引物。
一種所述嵌合衣殼構建體僅在AAV9衣殼中包含AAV6可變環區V的窄片段:AAV9 的氨基酸1-486，AAV6的氨基酸487-505 (SEQ ID NO :1)，和AAV9的氨基酸487-736。此構建采用以下引物。
單AAV6 VL V窄片段嵌合體
AAV9VP1-VLV 窄
5' -AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3‘ F SEQ ID NO 27
5' -TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3‘ R SEQ ID NO 28
其他嵌合衣殼構建體包含AAV6可變環區V和可變環區IV的兩個窄片段，其插入到AAV9衣殼的相應區域中。

SEQ ID NO 30
SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 32
AAV6 VL V窄片段(擴增SEQ ID NO 1的氨基酸487-505的編碼區域) 5' -GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3‘ F SEQ ID NO 29 5 ‘ -CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3‘ R AAV9 VL V窄片段-末端 5' -TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3‘ F 5 ‘ -ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3‘ R
對嵌合構建體AAV2/9(具有窄的可變環區V(AAV6的氨基酸487-50 )進行小規模效價測試和293細胞的體外轉導測試。其效價略小于AAV2/6(約3χ101(ι)，但體外轉導與 AAV2/6 相似。
實施例4 在AAV9衣殼內具有AAV6 VL IV片段的AAV6/9嵌合體
利用實施例1所述的方法進行PCR重疊序列延伸拼接，將修飾的AAV6可變環區IV 窄片段插入到AAV9衣殼中，該衣殼中AAV9的相應區域被去除。采用以下引物。F指正向引物，R指反向引物。
AAV9 VPl-VL IV 寬片段
5' -AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3‘ F SEQ ID NO 33
5' -GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3‘ R SEQ ID NO 34
AAV6 VL IV寬片段L和窄片段R (擴增AAV6的氨基酸447-469的編碼區域)
5' -AGCCTGGACCGRCTRATGAATCC-3‘ F SEQ ID NO 35
5' -ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3‘ R SEQ ID NO 36
AAV9 VL IV-窄片段-末端
5' -GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3‘ F SEQ ID NO 37
5' -ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3‘ R SEQ ID NO 38
在僅包含AAV6可變環區IV或其窄片段而不含AAV6可變環區V的嵌合構建體上觀察到的轉導結果不佳。然而，構建了在VL IV區域的氨基末端包含額外氨基酸的其他構建體。該構建體包含AAV6的氨基酸447-469。
本說明書中引用的所有出版物都通過引用納入本文。盡管本發明的描述涉及特別優選的實施方式，但應該理解可作出不背離本發明精神的修改。這些修改在所附權利要求
書的范圍內。
權利要求
1.一種包含異源氣道傳導靶向肽的人工AAV衣殼，所述靶向肽源自跨選自AAV1、AAV6、 hu48R3和hu44R2的AAV分支A衣殼的可變環區IV和V的氨基酸片段，其側連另一 AAV的 AAV衣殼序列。
2.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述可變環區IV和V位于異源衣殼序列的對應可變環區的天然位置，所述異源衣殼序列中的對應可變環區已功能性缺失。
3.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述人工AAV衣殼還包含側連AAV6 可變環區的氨基酸序列的羧基和/或氨基末端的任選間隔子。
4.如權利要求
3所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述任選的間隔子含有1到5個氨基酸。
5.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述異源氣道傳導靶向肽由以下部分組成AAV分支A衣殼的全長可變環區IV和V，至少1到12個來自與AAV分支A衣殼 IV區氨基末端側連的區域的氨基酸和至少1到12個來自與AAV分支A衣殼V區羧基末端側連的區域的氨基酸。
6.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述AAV衣殼序列由單一AAV提{共。
7.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述單一AAV選自以下組:AAV9， AAV5, AAV2, AAV8 和 AAVrh32. 33。
8.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述人工AAV衣殼內沒有包裝功能性AAV序列。
9.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述人工AAV衣殼內沒有包裝功能性序列。
10.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述異源氣道傳導靶向肽具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列NRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNW-LPGPCYRQQRVSKTKTDNNN SNFTWTGASKYNLNGRESIINPG。
11.如權利要求
1所述的人工AAV衣殼，其特征在于，所述衣殼包含(a)AAV6衣殼的片段，所述片段由AAV6(SEQID NO 1)的氨基酸約447到約472和氨基酸約489到約510組成，其與AAV9衣殼序列側連；(b)至少一個所述AAV6衣殼的片段，所述片段位于跨越由IV-V組成的可變環的區域內部，其包括AAV6(SEQ ID NO 1)的氨基酸約447到約469 ；AAV6 (SEQ ID NO 1)的氨基酸約 447 到約 476 ；AAV6 (SEQ ID NO 1)的氨基酸約 487 到約 510 ；
12.—種含有人工AAV衣殼和包裝在所述衣殼內的表達盒的AAV載體，所述人工AAV衣殼包含的異源氣道傳導靶向肽從選自AAVl、AAV6、hu44R2和hu48R3的AAV分支A衣殼可變環區IV和V中獲得，其特征在于，所述表達盒包括至少一個AAV反向末端重復序列和操作性連接調控序列的異源基因，所述調控序列允許所述異源基因在傳導氣道細胞中表達。
13.如權利要求
12所述的AAV載體，其特征在于，所述人工AAV衣殼還包含與AAV6可變環區氨基酸序列的羧基和/或氨基末端側連的任選間隔子。
14.如權利要求
13所述的AAV載體，其特征在于，所述任選的間隔子含有1到5個氨基酸。
15.如權利要求
12所述的AAV載體，其特征在于，所述異源氣道傳導靶向肽由以下部分組成AAV分支A衣殼的全長可變環區IV和V，至少1到12個來自與AAV分支A衣殼IV 區氨基末端側連的區域的氨基酸和至少1到12個來自與AAV分支A衣殼V區羧基末端側連的區域的氨基酸。
16.如權利要求
12所述的AAV載體，其特征在于，所述異源基因編碼用于治療或改善囊性纖維化病癥狀的產物。
17.如權利要求
12所述的AAV載體，其特征在于，所述異源基因編碼選自下組的產物 功能性的囊性纖維化跨膜調節子(CFTR)序列，α-l-抗胰蛋白酶(Α1ΑΤ)，表面活性蛋白 C (SPC)，表面活性蛋白D (SPD)。
18.如權利要求
12所述的AAV載體，其特征在于，所述氣道靶向肽包括(a)由AAV6(SEQ ID NO 1)的氨基酸約447到約472和氨基酸約489-約510組成的 AAV6衣殼的片段，其與AAV9衣殼序列側連；(b)至少一個所述AAV6衣殼片段，所述片段位于跨越由IV-V組成的可變環的區域內部，包括AAV6(SEQ ID NO 1)的氨基酸約447到約469 ；AAV6 (SEQ ID NO 1)的氨基酸約447 到約476 ；AAV6 (SEQ ID NO 1)的氨基酸約487到約510 ；(c)由AAV6(SEQID NO 1)的氨基酸約447到約521組成的所述AAV6衣殼的片段。
19.一種包含如權利要求
1所述的人工AAV衣殼的氣道靶向分子，所述衣殼與能將之輸送到氣道傳導上皮的部分相連。
20.如權利要求
19所述的氣道靶向分子在制備藥物中的應用。
21.一種包含如權利要求
12所述AAV載體和生理相容性運載體的藥物組合物。
22.如權利要求
21所述的組合物，其特征在于，所述組合物制備用于鼻內、口服或氣管內輸送。
23.一種改變選定AAV載體的特異性使之靶向傳導氣道細胞的方法，所述方法包括將異源氣道傳導靶向肽提供給AAV的步驟，所述異源氣道傳導靶向肽從選自AAV1、AAV6、 hu44R2和hu48R3的AAV分支A衣殼的可變環區IV和V獲得。
24.如權利要求
23所述的方法，其特征在于，所述含選定分支AAAV的可變環區IV和 V的天然AAV衣殼區域被去除。
25.一種優先靶向傳導氣道細胞而不優先靶向非肺細胞的方法，所述方法包括將細胞與如權利要求
12-18任一項所述的AAV載體接觸的步驟。
26.如權利要求
沈所述的AAV載體在制備藥物中的應用。
專利摘要
本發明提供包含異源傳導氣道靶向序列的人工AAV衣殼。該人工AAV用作輸送與其相關的異源分子的靶向部分。該人工AAV還用于生成含人工衣殼的AAV載體。本發明還描述了通過改進和/或消除載體轉導傳導氣道細胞的能力來調控載體的天然趨向性和轉導效率的方法。本發明還提供了靶向傳導氣道細胞的方法和輸送治療分子及其他分子的方法。
文檔編號C12N15/864GKCN102439157SQ201080019389
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月29日
發明者C·L·貝爾, J·M·威爾森 申請人:賓夕法尼亞州立大學托管會導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan