一種透明質酸薄膜及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物活性材料應用技術領域，具體涉及一種透明質酸薄膜及其應用。
【背景技術】
[0002]透明質酸(Hyaluronic acid, HA)是個線性的多糖陰離子聚合物，由交替重復的N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸二糖單位鏈接組成，分子量小至幾千，大至數百萬。HA具有化學結構相對簡單、擁有大量可修飾改造的官能團、水溶性高、能結合高達1000倍體積的水形成水凝膠或交聯形成智能高分子生物材料等特征，具有悠久的開發利用歷史。另一方面，HA是細胞外基質的主要成分，有特殊的化學性能，參與了促進細胞粘附、平衡細胞滲透、降低如關節滑膜、眼睛玻璃體等組織間摩擦力的生物功能。現在，HA已經在醫學方面得到廣泛應用。
[0003]目前，透明質酸薄膜通過交聯凝膠法進行制備，但此方法中所用的己二酸二酰肼為有毒物質，所用的溶劑揮發法較繁瑣，并且制備的薄膜在吸水溶脹后，薄膜不能恢復原狀；而殼聚糖-明膠-透明質酸復合薄膜制備方法的過程較復雜。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種透明質酸薄膜，以及該薄膜在體外篩選腫瘤細胞的應用，從而彌補現有技術的不足。
[0005]本發明首先提供一種透明質酸薄膜，其制備方法如下:
[0006]首先將芯片在piranha溶液(雙氧水H2O2和濃硫酸H 2S04的體積比為3:7)泡洗后用去離子水沖洗直至芯片表面清潔，再用氮氣吹干芯片；
[0007]將清洗干凈的芯片浸泡在生物素化的牛血清蛋白bBSA(bBSA, b1tin bovineserum albumin)溶液中，浸泡結束后將芯片用去離子水沖洗去掉未結合到芯片表面的bBSA分子，之后用氮氣吹干表面；
[0008]然后將芯片浸泡在親和素(Neutravidin)溶液中，將Neutravidin結合到bBSA層上，取出芯片后用去離子水將芯片沖洗去掉未結合到bBSA上的Neutravidin，用氮氣吹干表面；
[0009]最后將結合有bBSA和Neutravidin的芯片浸泡在b1tin-HA (bHA生物素標記的透明質酸)溶液中將bHA結合到Neutravidin層上，取出芯片后用去離子水沖洗芯片，將未結合到Neutravidin上的bHA沖洗掉，用氮氣吹干表面，制成透明質酸薄膜。
[0010]作為實施例的優選，所用的芯片為石英晶體微分析儀的金芯片。
[0011]本發明使用的不同分子量的透明質酸，分子量分別為5k、60k、492k、618k、1000k，
[0012]作為最佳優選，透明質酸的分子量為2192kDa。
[0013]本發明的透明質酸薄膜用于體外篩選腫瘤細胞，
[0014]本發明還提供一種用于檢測不同分子量HA與⑶44結合作用力強弱的方法，具體步驟如下:
[0015]將透明質酸薄膜片放置入QCM內，通入PBS緩沖液，找到基頻，待頻率值信號穩定于0，通入0.25 μ M的⑶44溶液，流速為50 μ 1/min，半小時后，頻率值穩定，繼續通入PBS緩沖液，將未結合到HA表面的CD44沖洗掉，并且觀察HA與CD44之間結合的強弱，如果兩者的相互結合較強，CD44不會被PBS緩沖液沖洗掉，若相互結合較弱，CD44會被PBS緩沖液沖洗掉。
[0016]本發明通過化學吸附將HA固定于金芯片的方法，HA結合量大并且結合牢固，在用PBS緩沖液沖洗時，不容易被沖洗掉，在用QCM研宄不同分子量HA與CD44結合作用時，不同分子量HA與⑶44結合作用區別明顯，非常適合實驗室用基礎理論研宄。
【具體實施方式】
[0017]為了解決以上問題，本發明采用化學吸附方法制備透明質酸薄膜，方法簡單，環保無毒，且制得的薄膜有很好的鹽響應性，PH響應性，當恢復水環境時，薄膜又恢復原狀，薄膜可以重復利用。此外，此薄膜還能用于判別細胞是否發生癌變，對腫瘤細胞進行篩選。本發明將HA化學吸附于金芯片，由于它們的結合迅速、專一、穩定，結合到芯片上的HA較牢固，結合量大；并且在用QCM研宄不同分子量HA與CD44結合作用時，效果較好，有助于對結合機理的研宄。
[0018]下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
[0019]實施例1:
[0020]I)首先將芯片在piranha溶液(雙氧水H2O2:濃硫酸H2SO4= 3:7)泡洗I小時后用去離子水數次沖洗，直至芯片表面完全清潔，保證了表面沒有任何物質，用氮氣吹干芯片。將干凈的芯片浸泡在0.08mg/ml的bBSA溶液中，2小時后，芯片用去離子水沖洗數次，將未結合到芯片表面的bBSA分子沖洗掉，之后用氮氣吹干表面；然后將芯片浸泡在0.38mg/ml 的 Neutravidin 溶液中，通過 B1tin-Neutravidin 的相互結合，將 Neutravidin 結合到bBSA層上，2小時后，取出芯片，同樣用去離子水將芯片沖洗數次，將未結合到bBSA上的Neutravidin沖洗掉，用氮氣吹干表面；最后將結合有bBSA和Neutravidin的芯片浸泡在0.lmg/ml的b1tin-HA溶液中，同樣通過B1tin-Neutravidin的相互結合，將bHA結合到Neutravidin層上，2小時后，取出芯片，用去離子水將芯片沖洗數次，將未結合到Neutravidin上的bHA沖洗掉，用氮氣吹干表面。這樣就形成通過化學吸附在芯片表面的透明質酸層。
[0021]2)將I)的芯片放置于QCM的液體池中，通水找到基頻，待頻率信號穩定于0，分別通入不同價態的鹽離子溶液:NaCl、MgCl2, AlCl3O頻率值顯著降低，待頻率穩定后，繼續通入水，頻率值會上升到O并且穩定于O。在此過程中，HA薄膜在不同的溶液中表現出不同的溶脹性(結合自由水的能力)，在AlCl3溶液中溶脹性大，結合自由水多，MgCl 2次之，NaCl較小，而當再次通入水時，溶脹的膜塌陷，失去了結合的自由水，恢復原狀。
[0022]3)將I)的芯片放置于QCM的液體池中，通水找到基頻，待頻率信號穩定于0，分別通入不同的PH值溶液，分別為:1、2、3、4、5、6。頻率值顯著降低，待頻率穩定后，繼續通入水，頻率值會上升到O并且穩定于O。此膜有很好的pH響應效果，在酸性依次減弱的情況下，此膜溶脹性依次增強，而當再次通入水時，溶脹的膜塌陷，恢復原狀。
[0023]2)3)為不同環境下此化學吸附的透明質酸薄膜的性質，此膜在鹽溶液和酸性環境下具有較好的溶脹性，能靈敏的感應環境的變化，而當恢復水環境時，此膜又恢復原狀，而不失去原來的性質，有較好的穩定性，且可以重復使用。
[0024]實施例2:
[0025]I)通過上述方法，制備吸附有不同分子量的HA芯片；
[0026]2)用QCM比較不同分子量HA層與⑶44的作用，將I)制得的芯片至于QCM的液體池內，通入PBS緩沖液，找到基頻，待頻率值信號穩定于0，通入0.25 μ M⑶44溶液，實時觀測兩者的相互作用，流速為50 μ 1/min，半小時后，頻率值穩定，繼續通入PBS緩沖液，將未結合到HA表面的CD44沖洗掉，并且觀察HA與CD44之間結合的強弱，如果兩者的相互結合較強，CD44不會被PBS緩沖液沖洗掉，若相互結合較弱，CD44會被PBS緩沖液沖洗掉；
[0027]3)比較不同分子量的HA膜在與CD44相互作用，發現2192kDa的HA與CD44結合特異性較強，隨著HA分子量的降低，與CD44作用依次減弱，表明CD44與HA的結合對分子量具有選擇性，對高分子量HA的結合程度遠遠大于它對低分子量HA的結合。
[0028]4)由不同分子量的HA與CD44結合作用的強弱不同，就可以用高分子量的HA對腫瘤細胞進行篩選，可以將高分子量HA包裹和攜帶藥物對過量表達CD44的革E點腫瘤細胞進行殺傷和抑制。
[0029]很多癌癥細胞表面會過量表達CD44蛋白，可以用此方法制備的透明質酸薄膜對過度表達CD44的腫瘤細胞進行篩選，高分子量HA會使過量表達CD44的癌癥細胞發生簇集。也可以對細胞是否發生癌變進行判別，發生癌變的細胞會聚集在此薄膜上，而非腫瘤細胞仍處于游離態。
【主權項】
1.一種透明質酸薄膜的制備方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟: 首先將芯片在piranha溶液泡洗后用去離子水沖洗直至芯片表面清潔，再用氮氣吹干芯片； 將清洗干凈的芯片浸泡在生物素化的牛血清蛋白bBSA溶液中，浸泡結束后將芯片用去離子水沖洗去掉未結合到芯片表面的bBSA分子，之后用氮氣吹干表面； 然后將芯片浸泡在親和素Neutravidin溶液中，將Neutravidin結合到bBSA層上，取出芯片后用去離子水將芯片沖洗去掉未結合到bBSA上的Neutravidin，用氮氣吹干表面； 最后將結合有bBSA和Neutravidin的芯片浸泡在b1tin-HA溶液中將bHA結合到Neutravidin層上，取出芯片后用去離子水沖洗芯片，將未結合到Neutravidin上的bHA沖洗掉，用氮氣吹干表面，制成透明質酸薄膜。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的piranha溶液是體積比為3:7的雙氧水H2O2和濃硫酸H #04混合液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芯片為石英晶體微分析儀的金芯片。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明質酸的分子量為5k、60k、492k、618k 或 100k0
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明質酸的分子量為2192kDa。
6.一種透明質酸薄膜，其特征在于，所述的透明質酸薄膜是由權利要求1-5任一項所述方法制備的。
7.權利要求6所述的透明質酸薄膜在體外篩選腫瘤細胞中的應用。
8.一種用于檢測不同分子量透明質酸與CD44結合作用力強弱的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 將權利要求6所述的透明質酸薄膜放置入QCM內，通入PBS緩沖液，找到基頻，待頻率值信號穩定于0，通入0.25 μ M的⑶44溶液，流速為50 μ 1/min，半小時后，頻率值穩定，繼續通入PBS緩沖液，將未結合到HA表面的⑶44沖洗掉，并且觀察HA與⑶44之間結合的強弱，如果兩者的相互結合較強，CD44不會被PBS緩沖液沖洗掉，若相互結合較弱，CD44會被PBS緩沖液沖洗掉。
【專利摘要】本發明提供一種透明質酸薄膜，采用化學吸附方法制備透明質酸薄膜，方法簡單，環保無毒，且制得的薄膜有很好的鹽響應性，pH響應性，當恢復水環境時，薄膜又恢復原狀，薄膜可以重復利用。此外，此薄膜還能用于判別細胞是否發生癌變，對腫瘤細胞進行篩選。本發明使用biotin-Neutravidin系統將HA化學吸附于金芯片，由于它們的結合迅速、專一、穩定，結合到芯片上的HA較牢固，結合量大；并且在用QCM研究不同分子量HA與CD44結合作用時，效果較好，有助于對結合機理的研究。
【IPC分類】C12Q1-04, B32B9-00, B32B7-04, B32B33-00, G01N5-02
【公開號】CN104691032
【申請號】CN201510105120
【發明人】姜磊, 韓娟, 李友訓, 楊麗敏, 馬洪超
【申請人】中國石油大學(華東)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月10日