一種檸檬黃多克隆抗體的制備方法與流程

本發明屬于酶聯免疫技術領域，具體的說是涉及一種檸檬黃多克隆抗體的制備方法。

背景技術：

檸檬黃又稱酒石黃、酸性淡黃、肼黃。檸檬黃之所以能用做食品藥品染色劑，是因為它安全度比較高，基本無毒，不在體內貯積，絕大部分以原形排出體外，少量可經代謝，其代謝產物對人無毒性作用。而它的生產所用原料對氨基苯磺酸、酒石酸及2-萘酚-6-磺酸都是基本無毒的物質。因此，世界糧農組織(fao)和世界衛生組織(who)早在1994年就給了它一個很寬容的每日答應攝用量。若按標準使用檸檬黃，則進入人體的量距每日答應攝用量相差很多。

檸檬黃為一種偶氮型酸性染料，其主要用于食品、飲料、藥品及化妝品的著色，也用于羊毛、蠶絲的染色及制造色淀。水溶性合成色素，鮮艷的嫩黃色，廣泛用于冰淇淋、雪糕、果凍、酸奶、飲料、罐頭、糖果包衣等的著色。根據中國《食品添加劑使用衛生標準》(gb2760-1996)規定：用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)飲料、碳酸飲料、配制酒、糖果、糕點上彩裝、西瓜醬罐頭、青梅、蝦(味)片、漬制小菜、紅綠絲，最大使用量0.1g/kg；用于冰淇淋，最大使用量0.02g/kg。用于植物蛋白飲料、乳酸菌飲料，最大用量0.05g/kg。

食用酒石黃人工色素會導致兒童智商降5分，以往的研究顯示，食品中的人工添加劑會引發兒童行為障礙。英國南安普敦大學的一項研究結果更發現，食用人工色素會影響兒童智力發育。新華網引述英國《每日電訊報》報導，英國南安普敦大學應英國食品標準局請求，進行食用人工色素對兒童發育影響的研究，整個研究耗資75萬英鎊。研究結果發現，包括酒石黃和日落黃在內的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。

鑒于檸檬黃給人類帶來健康的潛在風險，開發一種簡單、快捷制備用于檢測檸檬黃的多克隆抗體顯得尤為重要。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種檸檬黃多克隆抗體的制備方法。

本發明提供的技術方案為：

一種檸檬黃多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

(1)將制備好的全抗原注射到免疫動物體內；

(2)再加強免疫3次后采血，檢測血清效價；

(3)若血清效價達到要求，則大量采血，離心取上清，得到抗血清；

(4)將所得抗血清流過抗原免疫親和填料檸檬黃-agarose，血清中的抗檸檬黃抗體與偶聯在填料上的檸檬黃特異吸附，洗掉雜質，用弱酸洗脫，即得到抗檸檬黃多克隆抗體。

作為優選，步驟(1)中所述的全抗原包括檸檬黃-klh和檸檬黃-bsa。

作為優選，所述的全抗原的制備方法，包括以下步驟：

(1)先將檸檬黃溶解于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后加入n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，混勻直到全部溶解，再加入n,n'-二環己基碳二亞胺dcc，室溫搖床反應30min，得到檸檬黃-nhs中間體；

(2)取血藍蛋白klh或牛血清蛋白bsa，分別溶解在0.1mol/l的磷酸二氫鈉溶液中；

(3)將檸檬黃-nhs中間體和bsa或klh混勻，室溫搖床震蕩反應2h，經g25sephadex脫鹽后，制得的檸檬黃-klh疫苗和檸檬黃-bsa疫苗。

作為優選，所述的全抗原檸檬黃-klh做注射用；所述的全抗原檸檬黃-bsa做檢測包被用。

作為優選，步驟(1)中所述的免疫動物為新西蘭大白兔。

作為優選，步驟(4)中所述的抗原免疫親和填料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將檸檬黃溶解于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)，然后加入n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，混勻直到全部溶解，再加入n，n'-二環己基碳二亞胺dcc，室溫搖床反應30min，得到檸檬黃-nhs中間體；

(2)取賴氨酸瓊脂糖磁珠agarose中，用0.1mol/l磷酸二氫鈉清洗后加入與agarose等體積的丙酮；

(3)將制備好的檸檬黃-nhs中間體加到賴氨酸agarose丙酮-磷酸二氫鈉懸浮中搖床反應過夜，得到檸檬黃-agarose；

(4)用100ml丙酮清洗檸檬黃-agarose，再用含0.05％吐溫20的磷酸緩沖液pbst清洗，自然滴干后，即得抗原免疫親和填料檸檬黃-agarose。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明的方法用檸檬黃制備的檸檬黃-nhs中間體半抗原后，以檸檬黃-nhs中間體半抗原為配體偶聯到瓊脂糖上制備抗原免疫親和填料，用此填料可以在保證抗體活性的情況下快速純化出特異性抗體。

(2)本發明的方法制備出的檸檬黃多克隆抗體具有高特異性、高親和力的優點，有很強的應用前景及應用價值。

(3)本發明的方法中檸檬黃的抗原是用檸檬黃制備檸檬黃-nhs中間體半抗原，再在酸性條件下將檸檬黃-nhs半抗原結合載體蛋白制備全抗原免疫動物，產生高效價的抗體。

附圖說明

圖1為抗檸檬黃多克隆抗體間接elisa的效價圖；

圖2為抗檸檬黃多克隆抗體間接競爭elisa的ic50圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

除非另有其它明確表示，否則在整個說明書和權利要求書中，術語“包括”或其變換如“包含”或“包括有”等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而并未排除其它元件或其它組成部分。

實施例1：抗檸檬黃多克隆抗體的制備

1.1檸檬黃抗原的制備

1.1.1稱取50毫克檸檬黃，溶解于2mldmf，然后加入50mg的nhs，混勻直到全部溶解。加入100mg的edc，室溫搖床震蕩反應30min得到檸檬黃-nhs中間體。

1.1.2稱取100mgklh和50mgbsa，分別溶解在10ml和5ml0.1mol/l的磷酸二氫鈉溶液中。

1.1.3取步驟1.1.1所制備的檸檬黃-nhs中間體1.2ml滴入1.1.2步驟所制備的klh中，0.8ml于bsa中，室溫搖床震蕩反應2小時。

1.1.4用g25sephadex分別脫鹽，然后其檢測蛋白濃度，所制得的檸檬黃-klh用于免疫注射，檸檬黃-bsa用于檢測包被用。

1.2檸檬黃抗原免疫親和填料的制備

1.2.1取2g賴氨酸溶于10ml0.1mol/l碳酸鈉，充分溶解后加入到25ml過碘酸鈉氧化的瓊脂糖填料中混勻，60℃反應5min，搖勻再次反應10min，轉4℃靜置20min，然后加入硼氫化鈉100mg混勻還原，室溫搖床上搖動過夜，得到賴氨酸瓊脂糖填料；

1.2.2將25ml的賴氨酸瓊脂糖填料轉移到50ml潔凈的空柱子，用100ml0.1mol/l磷酸二氫鈉清洗，自然滴干后加入25ml的丙酮。

1.2.3稱取50毫克檸檬黃，溶解于2mldmf，然后加入50mg的nhs，混勻直到全部溶解。加入100mg的edc，室溫搖床震蕩反應30min得到檸檬黃-nhs中間體。

1.2.4將步驟1.2.3所制得的檸檬黃-nhs中間體邊振蕩邊加入至1.2.2步驟制得的重懸好的賴氨酸瓊脂糖填料，蓋緊，室溫搖床搖動避光反應過夜。

1.2.5自然滴干去除瓊脂糖填料中的液體，用100ml丙酮清洗填料后再用200mlpbst清洗。自然滴干后所得的檸檬黃-agarose填料可用于檸檬黃抗體的純化。

1.3抗檸檬黃多克隆抗血清制備

用新西蘭大白兔為免疫動物，疫苗濃度配成1mg/ml，首次免疫用0.5ml疫苗加0.5mlpbs加1ml完全佐劑混勻多點注射，加強免疫用0.25ml疫苗加0.75mlpbs加1ml不完全佐劑混勻分2點注射，首次免疫后，每間隔2周加強免疫1次，35-40天采集0.5ml血清檢測滴度，用配對檢測抗原包被做血清的間接elisa檢測，血清滴度達到1：6400后進行大量血清制備。

1.4抗檸檬黃抗體提取、純化

將150ml的免疫血清流過步驟1.2所制的檸檬黃-agarose填料裝成的親和柱。依次用10倍填料體積的pbst、10倍填料體積的1mol/l氯化鈉清洗掉雜質后，柱上的特異性檸檬黃抗體用1.5％乙酸洗脫。

實施例2：抗檸檬黃多克隆抗體的檢測

2.1效價檢測

用間接elisa法對抗體進行檢測。所用二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔igg，陰性對照為pbst溶液。以陰性od值不大于0.15，以最大od值的一半對應的抗體濃度為抗體效價。檢測結果見表1，以檸檬黃抗體濃度為x軸，以od值的百分比為y軸做圖(見圖1)。

表1間接elisa檢測抗檸檬黃抗體效價結果

從表1檢測結果可以看出，本發明的方法制備的抗檸檬黃多克隆抗體效價較高，達到45ng/ml。

2.2抗體敏感度測定

用間接競爭elisa法對抗體敏感度進行測定。所用二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔igg，用檸檬黃標準品濃度從低到高去競爭酶標孔中的抗體，其od值與所加入的檸檬黃標準品濃度呈負相關。以od信號抑制率為50％所對應的標準品濃度為敏感度的判斷依據。檢測數據如表2，以檸檬黃標準品濃度為x軸，以od值的百分比為y軸做圖如圖2。

表2間接競爭elisa檢測抗檸檬黃抗體敏感度結果

從表2可以看出，本發明的方法制備的抗檸檬黃多克隆抗體敏感性很好，達到26.52ng/ml。

前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。