基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法

專利名稱：基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物醫學技術領域的方法，具體是一種基于微陣列芯片的通 用多重聚合酶鏈式反應的實現方法。
背景技術：
多重PCR是PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)的一種特殊形 式，它的特征是在同一個反應體系中，有兩對或兩對以上引物對不同的目的片段進行同步 擴增。比起常規PCR，多重PCR具有多重目標同步檢測、節約時間、消耗試劑少、所需樣本量 少等優點，因此自 1988 年第一次報道(Chamberlain, J. S.，et al.，1988. Nucleic Acids Res.，16，11141-11156)之后，多重PCR已經被成功應用于許多領域，包括基因缺失分析 (Sieber, 0. M.，et al.，2002. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99，2954-2958)，基因突變和基 因多態性分析(Moutou，C.，et al.，2002. Eur. J. Hum. Genet.，10，231-238)，mRNA 定量分 析(Zimmermann, K.，et al.，1996. Biotechniques，21，480-484)，RNA 檢測(Jin, L.，et al.，1996. Mol. CellProbes,10，191-200 ；Zou, S.，et al.，1998. J. Clin. Microbiol.，36， 1544-1548)以及基因組序列分析(Tettelin, H.，et al.，1999. Genomics，62，500-507)。 在感染性疾病的診斷方面，多重PCR已經在病毒(Druce，J.，et al.，2002. J. Clin. Microbiol.，40，1728—1732 ；Robert, P. Y.，et al. ,2002. J. Med. Virol.，66，506—511)、 細菌(Osek, J. , 2002. Lett. Appl. Microbiol.，34，304-310 ；Sloan, L. M.，et al.，2002. J. Clin. Microbiol.，40，96-100)，寄生蟲(Harris, E.，et al.，1998. J. Clin. Microbiol.， 36，1989-1995)以及細菌的耐藥性(01iveira,D. C. and Lencastre，H. H. 2002. Antimicrob. Agents Chemother.，46，2155-2161)的鑒定、分析研究方面發揮了重要的作用。但是在多重PCR的過程中，常常出現各目標片段間的擴增不均衡，甚至出現假陰 性，并且隨著重數的提高，這種現象就更為突出。造成這種現象的原因主要是多對引物的 相互干擾與競爭，使得相同條件下，各片段的擴增效率相差較大。引物之間的差異可以通 過引物設計及優化得到適當的減少，從而使各目的片段的最優反應條件，尤其是退火溫度 接近，但是引物之間的相互影響難以消除。此外，多重PCR體系中的其它組分都需要根 據具體情況適當調整以達到理想的效果。Henegariu等(Henegariu, 0.，et al. , 1997. BioThchniques, 23，504-511)研究了多重PCR的各影響因素并提出了詳細的多重PCR優化 步驟，經過多步優化，特定組合的多種PCR可以達到較為理想的擴增效果，但是依然受重數 限制并且改變組合方式或添加新的引物對時一般需要重新優化，這限制了多重PCR的靈活 應用。很多研究者嘗試了一些其它的方法來實現核酸的多重擴增。Shum等(Shum，J. and Paul，N. ,2009. Anal. Biochem.，388，266-272)通過在引物上引入特殊的化學修飾基團來實 現在PCR過程中逐步釋放工作引物從而在一定程度上抑制了不同引物對之間的引物二聚 體的形成，同時具有熱啟動功能。但是這種方法并未使多重PCR的效果顯著提高，而且因對 引物進行化學修飾使得成本大大提高。Meuzelaar等(Meuzelaar，L. S.，et al. ,2007. Nat. Methods,4,837-837)把引物通過5’端的通用序列固定在磁珠上(每個磁珠只固定有一種引物對)然后把磁珠混合并固定在微孔板的孔壁上，然后分步進行PCR擴增，首先是得到 兩端均帶有通用序列的目標片段的集合，然后再由通用引物進行擴增，理論上，這種方法能 有效地避免引物之間的相互干擾，可以同時擴增任意多個目標片段，而不受重數的限制。但 是，由于引物被固定在磁珠上而非處于游離狀態，PCR過程中模板與特異性引物的退火效率 大大下降，因而需要較長時間的退火(兩次過夜)且不同于常規PCR的退火溫度(45°C)。 而且在擴增之間要先對基因組DNA進行隨機的預擴增以提高目標片段的拷貝數，從而減少 假陰性率。整個過程比較繁瑣而且周期很長，實用性較差。綜上，無論是臨床應用還是科學 研究均迫切需要一種簡單通用的方法或工具以實現快速高效的多重PCR。微芯片技術以高通量、集成化等優點在生物研究領域占據著越來越重要的位 置。芯片PCR，即以微芯片為反應平臺的PCR擴增，因為提高了表面體積比(surface to volume ratio)，所以能大大提高PCR過程中必需的熱循環效率，從而極大的縮短了 PCR時 間，提高了擴增效率。同時，芯片PCR又能實現微量PCR，所以可以節約樣本，提高通量。雖 然表面體積比的提高使得芯片表面對PCR的影響顯著增大，但可以通過適當的表面修飾 (Shaoffner, M. A.，et al.，1996. Nucleic Acids Res.，24，375-379)得到克服，因此芯片 PCR 具備潛在的應用價值。Matsubara 等(Matsubara，Y.，et al. ,2004. Anal. Chem.，76， 6434-6439)設計了一種用于PCR擴增的芯片，芯片上是一組相互獨立的微孔陣列，應用微 點樣技術在每個微孔中加入不同的樣品(模板)和相同的引物與其他PCR反應物，然后整 個芯片放置于PCR需要的熱循環下進行反應，這種方法雖然能夠實現多重PCR并且需要 非常小的體系就能完成，但是樣品的加入需要專用的儀器(微陣列芯片點樣系統)同樣 不能大規模的應用到各個領域。Ramalingam 等(Ramalingam，N.，et al.，2009. Biomed. Mibrodevices, 11，1007-1020)融合了微流體芯片的思想，通過經結構化的PDMS與玻片的 結合在一張玻片上形成幾個反應腔，在反應腔形成之前加入不同的引物對，而模板及其他 PCR反應物則通過微流體技術加入，這種方法雖然也能實現多重PCR，但是最大重數較低， 而且芯片不可重復使用，整個過程操作十分復雜。本發明針對實際應用的需求，能方便的實 現較高重數的PCR擴增而且具備高效、節約樣本等優點同時后續操作十分簡單，可在其基 礎上發展多種檢測試劑盒，具有較大的臨床和科研價值。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于微陣列芯片的通用多重聚合 酶鏈式反應的實現方法。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟第一步、使用微陣列芯片點樣系統將若干對引物分別點至微陣列芯片的若干個親 水性微孔中，然后將PCR組分溶液以提拉方式或引流方式加入到親水性微孔中；所述的微陣列芯片包括基底、疏水表面和微孔，其中疏水表面位于基底頂部， 若干個微孔以陣列方式貫穿排布于疏水表面內。所述的微陣列芯片是指首先在基底表面濺射或蒸鍍一層金元素層，再依次通過 光刻和等離子刻蝕處理除去金元素區域，最后利用化學處理方法使得剩余的金元素層表面 呈現疏水特性。所述的將若干對引物分別點至微陣列芯片的若干個親水性微孔中，具體是指在
5每一個親水性微孔中點入不相同的引物，并在每一個親水性微孔中加入交聯試劑。所述的交聯試劑為以下三種混合液中的任意一種a)重量百分比為0.1%-1%的殼聚糖溶解于pH為4. 5-6.0的乙酸水溶液；b)重量百分比為0. 1% -1%的明膠水溶液；c)重量百分比為0. 05% -5%的聚乙二醇水溶液。所述的提拉方式是指將微陣列芯片浸入PCR組分溶液后立即以均勻的速度提出 PCR組分溶液的液面。所述的引流方式是指將蘸有少量PCR組分溶液的薄片掠過微陣列芯片的表面， 通過微陣列芯片的表面親水性將PCR組分溶液加載于親水性微孔中。第二步、在微陣列芯片表面覆蓋一層礦物油或者將整個芯片浸入到礦物油中；第三步、將微陣列芯片點樣系統的微陣列芯片放置于原位PCR儀上或放入充有礦 物油的離心管中進行熱循環擴增，最后將微陣列芯片置于離心管中或直接離心收集PCR產 物作為二次增擴模板；第四步、將若干對引物對二次增擴模板進行二次擴增以便于檢測，從而實現通用 多重聚合酶鏈式反應；所述的引物包含通用引物和特異性引物。第五步、采用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺電泳、毛細管電泳或DNA芯片讀出多重 聚合酶鏈式反應結果，具體是指當多重聚合酶鏈式反應中的各目的片段的長度的兩兩之 差大于30bp時采用采用瓊脂糖凝膠電泳讀出多重聚合酶鏈式反應結果；當多重聚合酶鏈 式反應中的各目的片段的長度的兩兩之差小于等于30bp或多重聚合酶鏈式反應中的目的 片段中包含突變位點時采用DNA芯片讀出多重聚合酶鏈式反應結果。本發明結合了多重PCR、微量PCR的優點，同時具有常規PCR的擴增能力，而且利用 微陣列表面的親/疏水特征可以快捷、方便的加入待檢測樣品，因而在臨床疾病檢測、食品 安全檢測、轉基因生物檢測及其他核酸檢測等方面具備較高的價值。


圖1為本發明工作流程圖。圖2為微陣列芯片示意圖。其中1基底、2疏水表面、3微孔。圖3為本發明特異性引物及通用引物示意圖；其中4上游通用引物、5上游特異性引物、6模板、7下游特異性引物、8下游通用 引物。圖4為實施例1效果示意圖。其中M表示分子量標準，1為常規多重PCR產物，2為基于微陣列的通用PCR產物。圖5為實施例2效果示意圖，表示探針芯片的雜交結果。其中，陣列1-11分別為11種模板對應的PCR產物與探針雜交的結果，陣列12為 空白對照。所有陣列的探針及固定對照的排布相同，每個陣列1-11行的探針分別對應目的 片段 Aba、Cpn、Eco、FH、Hin、Kpn、Lpn、Pae、Sau、Sma、Spn。每種探針有 5 點重復。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1 杜氏肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因9個外 顯子的同步擴增樣本為健康人的血液，使用天根生化科技有限公司的快速DNA提取擴增套裝試劑 盒提取基因組DNA。本實施例包括以下步驟第一步、使用微陣列芯片點樣多對引物分別點至若干個親水性微孔中，然后將PCR 組分以提拉或引流方式加入到親水性微孔中；所述的微陣列芯片點樣來自博奧生物有限公司，型號為SmartArrayerTM48。如圖2所示，所述的微陣列芯片包括基底、疏水表面和微孔，其中疏水表面位于 基底頂部，若干個微孔以陣列方式貫穿排布于疏水表面內。所述的微陣列芯片通過以下方式制備得到以普通玻片作為基底，首先在其表面 濺射或蒸鍍一層金元素層，再依次通過光刻和等離子刻蝕處理除去金元素區域，即形成親 水性微孔部分，最后利用化學處理方法使得剩余的金元素層表面呈現疏水特性，即完成預 設的親疏水結構的構建。如圖3所示，所有引物由上海生工合成，經過了 PAGE純化。通用引物上游引物5 ‘ TGTAAAACGACGGCCAGT 3 ‘，下游弓丨物 5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。特異性引物本實施例中所用到的特異性引物在已有文獻的基礎上設 計(Chamberlain, J. S. , et al. , 1990, PCR protocols :a guide to methods and applications. Academic Press. New York London, pp 272—281)，弓|物的具體信息如下 所述的親水性微孔是指芯片上具有親水特性的微孔結構，各微孔之間被具有疏 水特性的部分隔開。所述的PCR組分包括DNA模板、DNA聚合酶、dNTP (三磷酸脫氧核糖核苷)、緩沖液等。第二步、在微陣列芯片點樣系統的微陣列芯片表面覆蓋一層礦物油或者將整個芯 片浸入到礦物油中，以避免水分蒸發；所述的礦物油為輕質礦物油，購自美國Sigma-Aldrich公司。第三步、將微陣列芯片點樣系統的微陣列芯片放置于原位PCR儀上或放入充有礦 物油的EP管中進行熱循環擴增，最后將芯片置于EP管中然后(或直接)離心收集PCR產 物。具體操作步驟為a.芯片選擇。使用直徑400 ii m,深度約100 y m,切割大小為10mmx3. 6mm,經 piranha溶液清洗及疏水處理。b.點樣。使用博奧生物有限公司的SmartArrayerTM48微陣列芯片點樣系統。每 對引物先混合(濃度為5iiM)并溶解到0.65%的殼聚糖(MW:750K)的稀乙酸溶液中，每個 點點一次，每種引物點制兩個微孔。c.加入模板及其它第一輪PCR反應物。利用引流法。各組分濃度未經特別優化， 只是反應體系中添加有0. 2% BSA。d.第一輪PCR擴增。將加好樣的芯片即刻放入盛有10 u 1 ddH20及130 yl礦物油的0. 2ml的EP管中進行PCR擴增。PCR程序為94°C 5min ；94°C30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 15cycles ；94°C 30s，63°C 90s, 25cycles ；63°C 5min ；e.離心收集產物。12000rpm離心lmin，然后取出芯片。第四步、用通用引物(與通用序列相同)對上述PCR產物(作為DNA模板)進行二 次擴增(以方便檢測)從而實現通用多重聚合酶鏈式反應，具體為在原來的EP管中加入 通用引物及其余反應組分。PCR程序為 94°C 5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin, 30cycles ； 72 °C 5min。凝膠電泳檢測采用1XTAE作為電泳緩沖液，瓊脂糖凝膠的濃度為2%，電泳在 Bio-Rad電泳儀上進行，施加100V電壓，電泳時間為70分鐘。分子量參照為TaKaRa的 DL1000。分子量參照的上樣量為5 iU，PCR產物的上樣量為lOiU。檢測結果如附圖4所示。結果表明，該發明所講述的多重PCR方法具有通用性，能 夠有效的避免常規多重PCR中引物相互干擾和競爭造成的不均衡擴增等問題并且整個過 程不需要特別優化，不受重數限制。實施例2 11種肺炎致病菌克隆質粒的多重擴增及芯片檢測1.樣本11種肺炎致病菌(見下表)的克隆質粒對應作為模板。載體為PGM-T，來自天根 生化科技有限公司。使用質粒抽提試劑盒(天根生化)提取質粒。 用于DNA芯片的特異性探針(每種模板2條)，序列如下
nh2-tttttttttttttttcaggcgccatggtcccagattcagLpnnh2-tttttttttttttttggcttccccttttactttattttcnh2-tttttttttttttttcgtctttcatttgctgttcggttaPaenh2-tttttttttttttttcggctacatactacccattacttgnh2-ttttttttttttttttaagtaaactgaccaagcgcaagcSaunh2-tttttttttttttttaaatcctttatggaatccagtatgnh2-ttttttttttttttttgttcaaatcctaagttactcattSmanh2-tttttttttttttttcaccttctcgggcgtgaccctcaanh2-tttttttttttttttacgtacgggtgaaggcctacagcaSpnnh2-tttttttttttttttgtctgcggactggacaaaggcgttnh2-ttttttttttttttttttaccgtcaagataataccaagt3.構建寡核苷酸探針芯片使用醛基基片，購自博奧生物有限公司。將探針溶于50 %的DMS0溶液，終濃度為10 u M。使用SmartArrayer 48微陣列芯 片點樣儀(購自博奧生物有限公司)設置點樣程序并執行點樣，將樣品(即探針)點制在 醛基基片上，然后置于60°C濕盒中4小時。4.多重PCR擴增根據不同的測試目的及方案，分為以下方面。a.選取質粒的不同組合作為模板進行擴增，以驗證多重PCR的有效性及實用性。 具體測試步驟與實施例1類似，有兩點不同①第一步PCR所用的芯片略大并且將芯片直接 放置于原位PCR儀上進行反應(芯片上覆蓋一層礦物油以防止蒸發)。原位PCR儀購自東 勝創新生物科技有限公司。②第二步反應體系中包含20 y M的Cy5-dUTP，以對PCR產物進 行熒光標記。b.梯度稀釋模板，以檢測其靈敏度。5.雜交及檢測雜交將已標記的PCR產物與雜交緩沖液(6X SSC，10X Denhart溶液，0. 4 % SDS)1 1混合，在漩渦混合器上混勻10s并離心。然后在95°C下變性5min，取出并立即冰 浴至少3min。取15yL加到已準備好的芯片上，50°C雜交2-3h。結束后進行洗滌。首先將 芯片放入42°C預熱的洗滌液I (2x SSC，0. 2% SDS)中，振蕩洗滌3min，再在洗滌液II (0. 2X SSC)洗滌3min，最后在蒸餾水中浸泡2 3次，最后離心干燥。激光掃描檢測將雜交完畢的寡核苷酸探針芯片用型號為GenePix 4200A的芯片 掃描儀在適當條件下掃描，檢測其雜交信號。
權利要求
一種基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、使用微陣列芯片點樣系統將若干對引物分別點至微陣列芯片的若干個親水性微孔中，然后將PCR組分溶液以提拉方式或引流方式加入到親水性微孔中；第二步、在微陣列芯片表面覆蓋一層礦物油或者將整個芯片浸入到礦物油中；第三步、將微陣列芯片點樣系統的微陣列芯片放置于原位PCR儀上或放入充有礦物油的離心管中進行熱循環擴增，最后將微陣列芯片置于離心管中或直接離心收集PCR產物作為二次增擴模板；第四步、將若干對引物對二次增擴模板進行二次擴增以便于檢測，從而實現通用多重聚合酶鏈式反應；第五步、采用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺電泳、毛細管電泳或DNA芯片讀出多重聚合酶鏈式反應結果。
2.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，所述的微陣列芯片包括基底、疏水表面和微孔，其中疏水表面位于基底頂部，若 干個微孔以陣列方式貫穿排布于疏水表面內。
3.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，所述的微陣列芯片是指首先在基底表面濺射或蒸鍍一層金元素層，再依次通過光 刻和等離子刻蝕處理除去金元素區域，最后利用化學處理方法使得剩余的金元素層表面呈 現疏水特性。
4.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，第一步和第四步中所述的引物包含通用引物和特異性引物。
5.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，第一步中所述的將若干對引物分別點至微陣列芯片的若干個親水性微孔中，具體 是指在每一個親水性微孔中點入不相同的引物，并在每一個親水性微孔中加入交聯試劑。
6.根據權利要求5所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，所述的交聯試劑為以下三種混合液中的任意一種a)重量百分比為0.1% -1%的殼聚糖溶解于pH為4. 5-6. 0的乙酸水溶液；b)重量百分比為0.1% -1%的明膠水溶液；c)重量百分比為0.05% -5%的聚乙二醇水溶液。
7.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特是，第一步中所述的提拉方式是指將微陣列芯片浸入PCR組分溶液后立即以均勻的速 度提出PCR組分溶液的液面。
8.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，第一步中所述的引流方式是指將蘸有少量PCR組分溶液的薄片掠過微陣列芯片 的表面，通過微陣列芯片的表面親水性將PCR組分溶液加載于親水性微孔中。
9.根據權利要求1所述的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，其 特征是，所述的第五步具體是指當多重聚合酶鏈式反應中的各目的片段的長度的兩兩之 差大于30BP時采用采用瓊脂糖凝膠電泳讀出多重聚合酶鏈式反應結果；當多重聚合酶鏈 式反應中的各目的片段的長度的兩兩之差小于等于30BP或多重聚合酶鏈式反應中的目的片段中包含突變位點時采用DNA芯片讀出多重聚合酶鏈式反應結果 。
全文摘要
一種生物醫學技術領域的基于微陣列芯片的通用多重聚合酶鏈式反應的實現方法，使用微陣列芯片點樣系統將若干對引物分別點至微陣列芯片的若干個親水性微孔中，然后將PCR組分溶液以提拉方式或引流方式加入到親水性微孔中；將微陣列芯片點樣系統的微陣列芯片放置于原位PCR儀上或放入充有礦物油的離心管中進行熱循環擴增，最后將微陣列芯片置于離心管中或直接離心收集PCR產物作為二次增擴模板；將若干對引物對二次增擴模板進行二次擴增以便于檢測，從而實現通用多重聚合酶鏈式反應；采用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺電泳、毛細管電泳或DNA芯片讀出多重聚合酶鏈式反應結果。
文檔編號C12P19/34GK101851652SQ20101015714
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者李陽, 郭書娟, 陶生策 申請人:上海交通大學