一種鹿骨膠原肽和活性鈣復劑的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種利用聯合酶解級微生物發酵的方法從鹿 骨中提取膠原多肽及活性鈣復合物的方法。
【背景技術】
[0002] 鹿骨是鹿的骨骼，含有大量膠原蛋白、磷脂質、磷蛋白、維生素，還含有多種礦物質 元素如鈣、鎂、鐵、鋅、鉀、銅等，具有重要的生理功能和多種藥理活性。有文獻記載，鹿骨膠 具有補腎壯陽、益氣補血、祛風除濕功能，對久病體弱、精髓不足、貧血、風濕、四肢疼痛等癥 有較好的臨床療效。
[0003] 膠原（collagen)是一種由動物細胞合成的生物高分子，是動物結締組織中的主 要成分，是動物體內含量最多、分布最廣的蛋白質，在動物體內起支持、保護、連接等多種作 用。膠原與人體的生長、衰老以及健康、疾病有著密切的關系，因此可廣泛應用于食品、保健 品、藥品、化品等領域。
[0004] 從目前的研究狀況來看，制備膠原多肽的原料主要有畜禽的皮和魚類的皮、骨、 鱗等，采用鹿骨制備膠原多肽的研究很少，作為養鹿業較為發達的國家，我國對鹿骨這樣 的產業副產物的研究利用較少，如何科學有效開展鹿骨綜合利用就成為了一個重要的問 題，采用一定的科學方法將鹿骨制備成膠原多肽成為一條很好的鹿骨利用途徑；與此同時， 提取膠原多肽后的鹿骨殘渣中含有豐富的鈣質，采用相應技術手段將其轉化提取，制備成 易于人體吸收的鈣質，將大大提高鹿骨的綜合利用水平。
[0005] 目前，現有的加工技術多是對鹿骨進行單一酶解或聯合酶解得到得到鹿骨多肽， 極少數采用單一酶解后再對鹿骨進行超微粉碎得到鹿骨肽鈣復合物，上述方法對鹿骨的綜 合利用率低，且得到的樣品生物活性不高。本發明首先應用的是聯合酶解的方法，提高了 酶解的效率，增加了鹿骨多肽的收率，同時酶解后的殘渣再通過乳酸菌發酵游離并富集鹿 骨中的鈣質，使鹿骨中的無機鈣轉化成高活性有機鈣，該專利方法得到的鹿骨膠原肽鈣復 合物的預防骨質疏松效果明顯強于其他方法得到的鹿骨膠原肽及鹿骨膠原肽鈣復合物，具 有，工藝過程簡單，生產成本低，適合于產業化生產等優點。
【發明內容】
【發明內容】
[0006] ：本發明是一種利用復合酶酶解與乳酸菌發酵聯用技術從鹿骨中提取鹿 骨多肽和活性鈣復合物的。該方法提取效率高，生產成本低，工藝流程簡單，無環境污染，適 合于工業生產，得到的產品具有顯著的預防預防骨質疏松效果。
[0007] 本發明的技術方案如下：T鹿骨前處理：取梅花鹿骨或馬鹿骨，除去骨髓， 50-80Γ烘干，粉碎過60-100目篩，備用鹿骨膠原多肽的提取：取步驟公中的鹿骨 粉，加入8-10倍量0· 1-0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液，加入1%-5%胃蛋白酶，在PH2-5的條件下 37-45°C酶解5-10小時，4000-6000轉/分鐘離心，上清液備用，殘渣加入1%-5%木瓜蛋白 酶，在PH6-8的條件下45-60°C繼續酶解5-10小時，4000-6000轉/分鐘離心，將兩次酶解上 清液合并，通過納米濾膜（500-1000KD)，收集被截留的多肽，冷凍干燥，即為鹿骨多肽；:_ 活性鈣的提取：取酶解后的殘渣，接入3%-6%乳酸菌、3-10%碳源及5%-20%天然西紅柿培 養基發酵20-40小時，加入8-12倍量蒸餾水，組織破碎，4000-6000轉/分鐘離心，取上清， 減壓濃縮干燥，即得活性鈣；?將步驟③中得到的鹿骨多肽與步驟議中得到的活性鈣混合 均勻，即為鹿骨膠原、肽活性鈣鈣復合物。與現有方法比較，有以下優點：:戀本發明采用的 是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解，提高了酶解效率；本發明采用的是納米濾膜富集后 冷凍干燥的方法，避免了加熱過程，保持了蛋白和多肽的活性；議本發明將酶解后的殘渣 進行二次利用，利用乳酸菌發酵富集鈣質及有益離子，將鹿骨中的無機鈣轉化為高活性的 有機鈣，易于人體吸收；④本發明得到的鹿骨肽鈣復合物在預防骨質疏松方面的活性遠高 于其他方法得到的鹿骨肽及鹿骨肽鈣復合物的活性。
[0008] 具體實施例：實施例1: :1>鹿骨前處理：取梅花鹿骨，除去骨髓，60 °C烘干，粉碎過 60目篩，取1.0 kg備用；：鹿骨膠原多肽的提取：取步驟議中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的 磷酸鹽緩沖液10L，加入胃蛋白酶20g，在PH 3. 0的條件下40°C酶解5小時，5000轉/分 鐘離心，上清液備用，殘渣加入木瓜蛋白酶30g，在PH7. 0的條件下50°C繼續酶解5小時， 5000轉/分鐘離心，將兩次酶解上清液合并，通過納米濾膜（500KD)，收集，被截留的大分子 多肽，冷凍干燥，得鹿骨多肽190g ;'f:活性鈣的提取：取酶解后的殘渣，加入碳源(葡萄糖： 蔗糖=3:7) 50g，超微粉碎西紅柿泥150g，滅菌后，接種乳酸乳桿菌與干酪乳桿菌干酪亞種 (1:1)雙菌株發酵，接種量為4%，在37°C振蕩培養24h后，45°C下再靜止發酵18h，加入IOL 蒸餾水，組織破碎，5000轉/分鐘離心，取上清，60cC減壓濃縮干燥，即得活性鈣370g 將步驟議中得到的鹿骨多肽與步驟議中得到的活性鈣混合均勻，得鹿骨肽鈣復合物553g。
[0009] 實施例2:,鹿骨前處理：取梅花鹿骨，除去骨髓，50Γ烘干，粉碎過80目篩，取 2. Okg備用；:議鹿骨膠原多肽的提取：取步驟③中的鹿骨粉，加入0. lmol/L的磷酸鹽緩沖 液12L，加入胃蛋白酶30g，在PH 4. 0的條件下37°C酶解6小時，6000轉/分鐘離心，上清 液備用，殘渣加入木瓜蛋白酶35g，在PH8. 0的條件下55°C繼續酶解6小時，6000轉/分 鐘離心，將兩次酶解上清液合并，通過納米濾膜（500KD)，收集被截留的大分子多肽，冷凍干 燥，得鹿骨多肽370g ;議:活性鈣的提取：取酶解后的殘渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 120g，超微粉碎西紅柿泥310g，滅菌后，接種嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌（1:1)雙菌株發酵， 接種量為5%，在37°C振蕩培養20h后，42°C下再靜止發酵20h，加入20L蒸餾水，組織破碎， 6000轉/分鐘離心，取上清，55°C減壓濃縮干燥，即得活性鈣730g ;:左將步驟中得到的鹿 骨多肽與步驟1中得到的活性鈣混合均勻，得鹿骨肽鈣復合物l〇83g。
[0010] 實施例3: _鹿骨前處理：取馬鹿骨，除去骨髓，65Γ烘干，粉碎過100目篩，取 5. Okg備用；_鹿骨膠原多肽的提取：取步驟①中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖 液50L，加入胃蛋白酶140g，在PH 5. 0的條件下40°C酶解8小時，5000轉/分鐘離心，上清 液備用，殘渣加入木瓜蛋白酶190g，在PH6. 5的條件下50°C繼續酶解8小時，5000轉/分 鐘離心，將兩次酶解上清液合并，通過納米濾膜（500KD)，收集被截留的大分子多肽，冷凍干 燥，得鹿骨多肽940g;：S活性鈣的提取：取酶解后的殘渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 60g，超微粉碎西紅柿泥160g，滅菌后，接種嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌（1:1)雙菌株發酵，接 種量為5%，在37°C振蕩培養20h后，42°C下再靜止發酵20h，加入12L蒸餾水，組織破碎， 6000轉/分鐘離心，取上清，55°C減壓濃縮干燥，即得活性鈣1820g沒)將步驟?中得到的 鹿骨多肽與步驟議:中得到的活性鈣混合均勻，得鹿骨肽鈣復合物2695g。
[0011] 實施例4:、I.鹿骨前處理：取馬鹿骨，除去骨髓，70°C烘干，粉碎過80目篩，取 IOkg備用；^鹿骨膠原多肽的提取：取步驟_中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液 100L，加入胃蛋白酶200g，在PH 3. 5的條件下38°C酶解6小時，5000轉/分鐘離心，上清液 備用，殘渣加入木瓜蛋白酶300g，在PH7. 5的條件下53°C繼續酶解6小時，5000轉/分鐘 離心，將兩次酶解上清液合并，通過納米濾膜（500KD)，收集，被截留的大分子多肽，冷凍干 燥，得鹿骨多肽1650g 活性鈣的提取：取酶解后的殘渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 50g，超微粉碎西紅柿泥150g，滅菌后，接種保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌（1:1)雙菌株發 酵，接種量為6%，在37°C振蕩培養25h后，45°C下再靜止發酵20h，加入100L蒸餾水，組 織破碎，7000轉/分鐘離心，取上清，70°C減壓濃縮干燥，即得活性鈣3500g ;:1.將步驟⑩.中 得到的鹿骨多肽與步驟藝中