專利名稱：：超順磁性粒子及其制造方法
技術領域：
：本發明提供一種超順磁性粒子的制造方法，以及利用該方法所制造的超順磁性粒子。所述超順磁性粒子可應用于化學或生化物質的純化與反應，并可應用于大規模反應與自動化磁珠操作平臺。
背景技術：
：具有超順磁性的磁性粒子(superparamagneticparticles),在外加磁場的條件下，會受到磁場的誘導而產生磁性，聚集到磁場的N極或S極；將磁場移離后，其磁性瞬間消失，回復到不具有磁性的狀態，重新分散。由于氧化鐵粒子具有生物兼容性、且無細胞毒性，所以是所有磁性粒子中最被廣為使用的材料。在具有超順磁性的磁性粒子的早期應用與研究中，其粒徑等級是以微米為主，且其應用是以體外應用為主，在分離純化領域的應用尤其如此，僅有少數的體內應用，究其原因，在于微米粒子的大小相對于細微組織仍是較大的，故無法有效地進入細微組織區域。近年來，由于納米粒子的開發，粒徑大幅縮小，而得以進入早期微米粒子無法進入的區域，因此開始大量開發與研究，其應用范圍已經可達微血管區域等，并廣泛地應用在生物醫學領域上，例如磁共振造影、溫熱治療等；同時，具有超順磁性的納米粒子也具有可控制化載體的特性，故帶動了整個生醫產業自動化的新里程。一般常用于合成具有超順磁性的氧化鐵粒子的方式，是簡單的共沉淀法(co-precipitation)。共沉淀法是在同時具有二價鐵離子與三價鐵離子的溶液中加入堿液，將酸堿值調整到9至14之間，如此即可得到四氧化三鐵的沉淀物。但此傳統方式需將三價與二價鐵離子的摩爾比例控制在Fe3、Fe2+=2:1，且需在無氧環境下進行，否則將影響氧化鐵粒子的結晶型態，而且氧化鐵粒子會在制備過程中持續氧化，進而影響到氧化鐵粒子的飽和磁化量(saturationmagnetization)大小。目前的解決方式是在氮氣下進行反應、或改在有機相中反應，以便減緩氧化；但二價鐵離子易氧化成三價鐵離子，需新鮮配置，且不易精準控制反應中的摩爾比例，這都會增加大量合成的困難度。此外，四氧化三鐵粒子中的鐵離子并非全數處于最高的氧化態，所以這些鐵離子會在空氣中慢慢氧化成不具順磁性或磁性較弱的三氧化二鐵。一般來說，會在四氧化三鐵粒子表面包覆高分子聚合物或二氧化硅的無機氧化物，但這類粒子常會出現無法長時間耐高溫與耐酸性差的缺點，使其應用受到限制。針對先前技術的缺點，本發明利用尿素特殊的高溫熱分解特性，在單純只需二價鐵離子存在的情況下，產生具有高飽和磁化量的超順磁性氧化鐵粒子，并在表面包覆二氧化硅來形成核-殼結構，使磁性氧化鐵粒子的抗酸性增強，并可接受高溫高壓滅菌處理。前述有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子可經進一步酸處理，來作為吸附核酸的載體；亦可進一步經帶有官能基的硅烷修飾，而與蛋白質或其它化合物進行化學鍵結，增加超順磁性氧化鐵粒子的應用層面。
發明內容有鑒于此，本發明的目的在于提供一種超順磁性粒子的制造方法，相較于傳統的磁性粒子，本發明只需使用單一的二價鐵離子來源，配合尿素特殊的高溫熱分解特性，即可在常壓高溫的開放系統下合成具有高飽和磁化量及超順磁性的氧化鐵粒子，容易大量生產。本發明還利用改進的二氧化硅包覆技術，將前述粒子在有機醇溶劑、水和堿液的混合溶液中進行超聲波震蕩，利用高溫與低溫兩階段的包覆，在氧化鐵粒子表面形成一層均勻的二氧化硅，此核-殼結構可耐高溫高壓，且其抗酸性佳，在酸性溶液中不會有過渡金屬離子釋出。在本發明的方法中，只需簡單改變反應參數，即可制備出不同粒徑的粒子，而包覆在氧化鐵粒子外的均勻二氧化硅層可進行多種表面修飾，以便于進行各種應用。本發明的目的還在于提供一種超順磁性粒子，其核心氧化鐵粒子的主要成分是具有超順磁性的四氧化三鐵，且氧化鐵粒子的表面有均勻的二氧化硅包覆層，可抗強酸，并可進行高溫高壓滅菌處理。本發明的目的還在于提供一種表面經過酸處理而使硅垸醇基(Si-0H)增加的超順磁性粒子，其于高鹽環境下具有吸附核酸的能力。本發明的目的還在于提供一種表面經過具有官能基的硅烷(silane)修飾而使其表面具有胺基、羧基、醛基等官能基的超順磁性粒子，再利用活化劑或連結劑，使之與蛋白質或化合物鍵結，而成為具有專一性的吸附載體，可應用于例如抗體的純化。為達上述目的，本發明提供一種超順磁性粒子的制造方法，其包含下列步驟(a)將二價鐵化合物粉末、尿素和水混合攪拌，在8(TC至ll(TC的常壓下進行回流反應1至24小時，生成氧化鐵粒子；(b)清洗前述氧化鐵粒子后再加入水、氨水和有機醇溶劑混合攪拌，進行超聲波震蕩；(c)在前述步驟(b)混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在5CTC至70°C的溫度下反應0.5小時至12小時；及(d)將步驟(c)得到的產物的溫度降至25t:至3(rc后，另外再加入硅酸四乙酯，反應1小時至12小時，形成有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子，該氧化鐵粒子具有超順磁性。在本發明的優選實施方式中，前述制造方法進一步包括通過下列步驟以制得活化的超順磁粒子(e)將前述步驟(d)得到的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子與pH值小于6的酸性緩沖液混合攪拌。在本發明的優選實施方式中，所述酸性緩沖液優選為磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、MES緩沖液(2-(N-嗎啉基)乙垸磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid))或Bis-Tris緩沖液(雙(2-羥基乙基)亞胺基-參(羥基甲基)甲烷(bis(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methane"。在本發明的優選實施方式中，前述制造方法進一步包括下列步驟，以制得表面具有官能基的超順磁粒子-(f)前述步驟(d)得到有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子移入極性有機溶劑中；(g)加入具有官能基的硅烷化物混合攪拌，使前述有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子表面具有官能基。在本發明的優選實施方式中，所述的極性有機溶劑為丙酮、DMS0(二甲亞砜(dimethylsulfoxide))、DMF(N，N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide))、麗P(N-甲基-2-吡咯啶酮(N-methy:L-2-pyrrolidone))或異丙醇。在本發明的優選實施方式中，所述的官能基選自由胺基、氫硫基(巰基)、氫氧基(羥基)、甲基、辛基、十八基和苯基所組成的組群。在本發明的優選實施方式中，所述硅垸化物包含y-胺基丙基三乙氧基硅烷(y-aminopropyltriethoxysilane)、(3-氫硫基丙基)三甲氧基硅烷((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane)、環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(glycidoxypropyltrimethoxysilane)、甲基三乙氧基硅烷(methyltriethoxysilane)、正辛基三乙氧基硅烷(n-octyltriethoxysilane)、十八基三甲氧基硅烷(octadecyltrimethoxysilane)或苯基三乙氧基硅烷(phenyltriethoxysilane)。本發明還提供了一種超順磁性粒子，其由前述方法制得，其中所述的超順磁性粒子的主要成分為四氧化三鐵，二氧化硅的含量為該超順磁性粒子重量的0.05%至40%，且其粒徑范圍為100nm至10|iim。在本發明的優選實施方式中，前述超順磁性粒子的飽合磁化量一般大于35emu/g。本發明還提供一種活化的超順磁性粒子，其由前述相關方法制得，該活化的超順磁性粒子在高鹽環境下對核酸分子具有強吸附力。其中高鹽環境優選是指0.5M至8M的NaCl、Nal、GuHCl或GuSCN。本發明還提供一種表面具有官能基的超順磁性粒子，由前述相關方法制得。在本發明的優選實施方式中，如果前述超順磁性粒子表面所具有的官能基是胺基，則其可進一步利用羥基活化劑來進行修飾，使其可與具有羧基官能基的蛋白質或化合物鍵結。在本發明的優選實施方式中，前述羥基活化劑優選為EDAC、CMC(l-環己基_3-(2-嗎啉基乙基)碳化二亞胺(l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide))、DCC(二環己基碳化二亞胺(dicyclohexylcarbodiimde))或DIC(二異丙基碳化二亞胺(diisopropylcarbodihnide))。在本發明的優選實施方式中，前述經羥基活化劑修飾后的超順磁性粒子進一步與蛋白質鍵結后，可用以純化抗體。在本發明的優選實施方式中，所述蛋白質是指蛋白質A(ProteinA)、蛋白質G(ProteinG)、抗體、酶或鏈霉親合素(Streptavidin)。在本發明的優選實施方式中，前述表面具有官能基的超順磁性粒子的表面可進一步利用螯合劑修飾，使其可與過渡金屬離子螯合，純化帶有組胺酸(也稱為組氨酸)的蛋白或磷酸化蛋白。在本發明的優選實施方式中，所述螯合劑優選為三乙酸基胺(nitrilotriaceticacid)、IDA(亞胺基二乙酸(iminodiaceticacid))或EDTA(乙底酸ethylenediamine國tetraaceticacid》綜上所述，本發明提供了一種超順磁性粒子的制造方法，相較于傳統的共沉淀法，本發明只需使用單一的鐵離子源，即可合成出高飽和磁化量的超順磁性氧化鐵粒子，并利用改良的二氧化硅包覆技術，使所制得的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子除了極佳的磁反應性外，更具有絕佳的抗酸性，且可耐高溫高壓處理。而利用本方法所制得的超順磁性粒子用途廣泛，可應用于如核酸與蛋白質的純化技術中。圖1:本發明的有二氧化硅包覆的超順磁性粒子(粒徑約500rnn)的電子顯微鏡圖(400，000X放大圖)；圖2A-1、圖2A-2、圖2B-1、圖2B-2、圖2C-1、圖2C-2:本發明的超順磁性粒子與市售磁性粒子經高溫高壓處理前后在顯微鏡下的400X放大圖，其中，圖2A-1、2A-2為本發明的超順磁性粒子經高溫高壓處理前后在顯微鏡下的400X放大圖，圖2B-1、2B-2為Qiagen公司的超順磁性粒子經高溫高壓處理前后在顯微鏡下的400X放大圖，圖2C-1、2C-2為Invitrogen公司的超順磁性粒子經高溫高壓處理前后在顯微鏡下的400X放大圖3:本發明與市售磁性粒子的抗酸性(2MHC1)比較圖，菱形的連接曲線為本發明的超順磁性粒子(TANBead)，正方形的連接曲線為Invitrogen公司的產品，三角形的連接曲線為Qiagen公司的產品；圖4:使用本發明的超順磁性粒子進行核酸純化的DNA電泳圖；圖5:使用本發明的超順磁性粒子進行抗體純化的蛋白質電泳圖。具體實施例方式以下結合附圖詳細說明本發明，但不限定本發明的實施范圍。本發明利用尿素特殊的高溫熱分解特性，在單純只需二價鐵離子存在的情況下，產生具有高飽和磁化量的超順磁性氧化鐵粒子。將二價鐵化合物粉末、尿素和水混合攪拌，在8(TC至ll(TC的常壓環境下進行回流反應1至24小時，其中二價鐵離子在水中會慢慢氧化成三價鐵離子，同時尿素在熱水中會分解成氨水與二氧化碳，其中二氧化碳會從回流管排出，而氨水則會提供氫氧基，使溶液的酸堿值慢慢升高，產生以下的顏色反應2+3+FeFeFe3C)1當酸堿度達到9以上時，二價鐵離子與三價鐵離子會產生共沉淀反應，開始生成黑色的四氧化三鐵粒子晶核；而水中未反應的二價鐵離子繼續反應，在前述晶核表面形成四氧化三鐵沉淀，使粒徑逐漸增加。因此，可通過調整尿素與二價鐵離子的摩爾比，來控制晶核生成的數量；或調整四氧化三鐵生成后的反應時間，將氧化鐵粒子的粒徑范圍控制在100腦至IO,。本發明制成超順磁粒子的反應機制如下1)4Fe2++02+2H20~>4Fe3++40H-、，、加熱(80至ll(TC)2)C0(NH2)2+H20——2跳+C022NH3+2H20~2NH40H42NH4++2OH一3)Fe2++2Fe3++80H_—Fe304+4H20全反應式如下53FeCl2+3CO(NH2)2+^02+6H20—FeA+6,Cl+3C02四氧化三鐵粒子在空氣中會漸漸氧化成不具順磁性或磁性較弱的三氧化-10黑色深褐色黃褐色紅棕色橘色黃色(渾濁)T、黃色黃綠色鐵。本發明利用改良的二氧化硅包覆技術在四氧化三鐵粒子表面形成包覆層，降低其氧化程度。首先在高溫下反應，生成厚實的二氧化硅層，然后在低溫下反應，將表面空隙填補完整，并在表面生成具有活性的硅烷醇基。由前述方法所制得的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子，其核-殼結構的抗酸性增強，并可接受高溫高壓滅菌處理。前述有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子可經進一步進行酸處理，增加其表面的硅烷醇基，如此可在高鹽環境下作為吸附核酸的載體，但卻不會吸附蛋白質與其它污染物；亦可進一步經帶有官能基的硅烷修飾，使氧化鐵粒子表面具有官能基，而與蛋白質或其它化合物進行化學鍵結，增加超順磁性氧化鐵粒子的應用層面。此類磁性材料漸漸成為自動化分子生物檢驗分析之前處理步驟中不可或缺的載體。一般認為，粒徑大于50nra的磁性粒子不具超順磁性，或有磁遲滯現象(remanentmagnetism)。但在本發明的制造方法中，首先生成納米級的氧化鐵晶核，再慢慢在晶核表層繼續成長，因此，即便氧化鐵粒子的粒徑已達IO，，仍保有超順磁性，且其飽和磁化量大于35emu/g。另一方面，可通過增加氧化鐵粒子的粒徑、或通過二氧化硅的包覆來增加單顆粒子中的氧化鐵粒子數目，縮短磁反應時間。本發明的超順磁性粒子在外加磁場的吸引下，磁反應時間小于2秒。如此強的磁力不僅可以縮短磁反應時間，也可以在l公升(1000ml)、甚至100公升的大反應體積中進行操作。具有超順磁性的粒子在外加磁場移離后，不需加熱，磁性便即消失，而能夠重新分散在溶液中，繼續反應。這項特性能夠增加異相反應的均勻性。二氧化硅的包覆須在氧化鐵粒子制備完成后馬上進行，以防止四氧化三鐵繼續氧化。首先將氧化鐵粒子分散在水與醇類(如甲醇、乙醇、異丙醇、l-丙醇、l-丁醇、2-丁醇、第三丁醇(叔丁醇)、異丁醇等)的混合液中，再加入氨水或其它堿性溶液(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化四甲基銨、氫氧化四乙基銨)，將反應環境控制在堿性，進行超聲波振蕩。在前述混合物中加入硅酸四乙酯，在5(TC至7(TC的溫度下反應O.5小時至12小時；通過控制硅酸四乙酯的添加量，可將二氧化硅包覆層的厚度限制在從1nni到1pni的范圍。之后將溫度降至25'C至3(TC，另外再加入硅酸四乙酯，反應1小時至12小時，其通過較慢的反應速率，將表面空隙填補完整。本發明的氧化鐵粒子-二氧化硅的改良式的核-殼結構，在2M的濃鹽酸下可耐酸超過60分鐘；且高溫高壓滅菌不會影響氧化鐵的超順磁性與其表面的二氧化硅結構。包覆氧化鐵粒子的二氧化硅表面具有硅烷醇基，若浸泡在pH值小于6的酸性緩沖溶液中，可使二氧化硅表面活化，硅烷醇基的數量增加，而這類活化的超順磁性粒子在O.5M至8M的NaCl、Nal、GuHCl或GuSCN的高鹽環境下，對核酸分子有很強的吸附力，且超順磁粒子的結果不會被破壞，至于蛋白質分子與其它污染物，則可通過簡單的清洗步驟去除。可對所得的純化核酸進行聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)來將它放大，其結果如圖4所示，純化核酸中并無蛋白質和其它會抑制PCR反應的物質存在。將有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子移至極性有機溶劑(如丙酮)中，再加入具有官能基的硅垸化物(如Y-胺基丙基三乙氧基硅烷)，使氧化鐵粒子表面具有官能基(例如胺基)。之后可利用羥基活化劑(如EDAC)做進一步修飾，使超順磁性粒子與蛋白質(如蛋白質A(ProteinA)、蛋白質G(ProteinG)、抗體、酶或鏈霉親合素(Str印tavidin))鍵結，之后用以純化抗體；其亦可利用螯合劑(如三乙酸基氨)做進一步修飾，使超順磁性粒子與二價或三價的過渡金屬離子螯合，之后用以純化帶有組胺酸(histidine)的蛋白或磷酸化蛋白。實施例實施例l:超順磁性氧化鐵粒子的小量制備將0.25克二氯化鐵粉末與6克尿素結晶顆粒溶解在100毫升去離子水中，在裝有冷凝管的玻璃反應器中快速攪拌10分鐘，形成黃綠色澄清溶液，移入9(TC的油鍋進行回流反應12小時，生成黑色氧化鐵粒子，靜置沉淀后，將接近澄清的上清液倒出，沉淀物用去離子水清洗三次，去除反應剩下來的銨離子與氯離子。進行二氧化硅包覆前，將前述沉淀物保持在水溶液中，避免干燥。實施例2:超順磁性氧化鐵粒子的大量制備將60克二氯化鐵粉末與90克尿素結晶顆粒溶解在1公升(lOOOml)去離子水中，在裝有冷凝管的玻璃反應器中快速攪拌3分鐘，并將混合物移入溫度設定為95。C的油鍋進行回流反應12小時，生成黑色氧化鐵粒子，靜置沉淀后，將接近澄清的上清液吸出，沉淀物用去離子水清洗三次，去除反應剩下來的銨離子與氯離子。進行二氧化硅包覆前，將前述沉淀物保持在水溶液中，避免干燥。實施例3:二氧化硅的包覆將30克由實施例1或實施例2制得的氧化鐵粒子分散在225毫升去離子水中，再加入22.5毫升28%的氨水，然后加入900毫升異丙醇，將此溶液封閉在玻璃反應器中持續攪拌，并進行超聲波震蕩10分鐘。加入4.5毫升的硅酸四乙酯，并將水溫升高至5(TC，持續反應2小時；之后將水溫降至室溫(約25'C)，再加入4.5毫升的硅酸四乙酯，持續反應l小時。反應完成后，靜置沉淀，將透明上清液吸出，并用去離子水清洗至無氨水與異丙醇的味道為止。實施例3制成的有二氧化硅包覆的超順磁粒子的影像圖如圖1所示。實施例4:表面活化處理將實施例3的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子靜置去除上清液后，從中取30克加入300毫升10mM的磷酸鹽緩沖液(pH5.5)，清洗兩次，之后在相同的緩沖液中持續攪拌5小時，再以去離子水清洗，重新分散在酸堿值8的緩沖液中，即可制得具有活化的二氧化硅表面的超順磁性粒子。實施例5:表面官能基的修飾將實施例3的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子靜置去除上清液后，從中取30克加入250毫升無水丙酮，清洗兩次，之后將前述粒子分散在500毫升丙酮中，持續攪拌10分鐘，再加入3.5毫升y-胺基丙基三乙氧基硅烷，在室溫下反應4小時。反應完成后，靜置沉淀，將透明上清液吸出，并用去離子水清洗至無丙酮的味道為止，即可制得表面具有胺基官能基的超順磁性粒子。實施例6:核酸的純化取分散在100微升中的lxlO'5個TSGH-8301細胞加入400微升的細胞裂解液(120gGuSCN，100ml0.1MTris-HClpH6.4，22ml0.2MEDTApH8.0，2.4mlTritonX-IOO)，反應10分鐘。之后加入50微升150mg/ml由實施例4制備而得的具有活化的二氧化硅表面的超順磁性粒子，并加入100微升的連結液(異丙醇)，均勻混合10分鐘，使磁性粒子與細胞裂解后產生的核酸產生連結。將混合物置于磁座上，將上清液吸出，加入800微升的清洗液(120gGuSCN，lOOml0.1MTris-HClpH6.4)，清洗兩次；再加入800微升70%乙醇，清洗兩次。之后將氧化鐵粒子靜置10分鐘，使清洗液中的酒精揮發；再加入100微升的沖洗液(10mMTrispH8)，均勻混合10分鐘，接著將反應物置于磁座上，將上清液吸出，置入干凈的容器中，此即純化后的核酸，結果如圖4所示，其中M為lkb的核酸標準液；El至E3為lxl()5個細胞的三次重復實驗；C1至C3為不同數目的細胞的比較，其中Cl為lxl()5個細胞，C2為2xl0'5個細胞，C3為5xl()5個細胞。由圖4的結果可知，利用本發明的活化后的超順磁粒子來純化的核酸并無蛋白質和其它會抑制PCR反應的物質存在。實施例7:抗體的純化取10微升的血清，加入900微升的連結液(10mM磷酸鹽，150mMNaCl，pH7.5)，再加入20微升50mg/ml鍵結有蛋白質A的超順磁性粒子(利用實施例5的表面修飾胺基的超順磁粒子進一步利用羥基活化劑修飾后，再與蛋白質A鍵結)，均勻混合30分鐘。將混合物置于磁座上，將上清液吸出，加入500微升的清洗液(lOmM磷酸鹽，150mMNaCl，pH7.5),清洗兩次；再加入100微升的沖洗液(0.5M甘胺酸，0.15MNaCl，pH2.5)，均勻混合10分鐘，接著將反應物置于磁座上，將上清液吸出，置入干凈的容器中，再加入5微升的中和液(1MTris，pH9.0)，移動磁性粒子，重復進行一次沖洗步驟，即得純化后的抗體，結果如圖5所示，其中M為蛋白質標準液，S為稀釋20倍的血清，F為未被磁性粒子吸附的蛋白質，Wl為第一次清洗液的產物，W2為第二次清洗液的產物，El為第一次沖洗液的產物，其產量大約占總量的60至70%，E2為第二次沖洗液的產物，其產量大約占總量的30至40%。由圖5的結果顯示，利用本發明制備的超順磁粒子，經表面官能基修飾后可作為抗體純化之用。血清中各種免疫球蛋白(IgG[約70%]、IgM[約6%]、IgA[約10至20%]、工gE[約0.001%]和IgD[約O.2%])的分子量分布在150kDa至900kDa，在進行電泳確認前，須將各樣本加熱沸騰，使蛋白能在電泳膠片中移動。加熱沸騰后的免疫球蛋白會分成重鏈(heavychain)和輕鏈(lightchain)兩部分，其中各免疫球蛋白的重鏈大小在50kDa至75kDa范圍內，而數量最多的IgG的輕鏈大小為25kDa，這兩個大小的蛋白會在El與E2上形成兩條明顯的主帶，此外，其它數量較少的免疫球蛋白(IgM、IgA、IgE和IgD)的輕鏈，會在25kDa上下形成較弱的帶。而電泳片上大于75kDa的帶，主要是熱分解片段重新結合而成的半產物或完整的免疫球蛋白。實施例8:本發明與市售磁性粒子的比較1)耐酸性的測定在1ml的紫外光等級的塑料比色管中，分別加入12.5mg本發明與兩種市售磁性粒子，再分別加入500pl的2MHC1，混合均勻后，將磁性粒子磁吸至底部，量測上清液于290簡的吸光值(A290)。在0至10分鐘時，每2分鐘量測一次；在10至60分鐘時，每5分鐘量測一次。由于Fe"離子吸收峰在290nm，因此，若前述上清液的A290值在60分鐘內有上升，則表示該磁性粒子的二氧化硅層被酸破壞，使氧化鐵裸露并開始氧化，形成Fe'"。故在前述測定中，A290值未上升判定為"佳"，而A290值上升則判定為"不佳"，如表1和圖3所示。2)耐高溫高壓處理的測定在2ml聚丙烯的樣品管中，分別加入1.25mg本發明與兩種市售磁性粒子，再分別加入1ml去離子水，混合均勻后，半鎖緊上蓋，放入滅菌鍋中，進行高溫高壓滅菌，溫度設定12(TC，持續40分鐘，之后在顯微鏡下進行觀察磁性粒子表面二氧化硅層脫落的情形，其結果如下表1和圖2A-1、2A-2圖2C-1、2C一2所示。在下表1中，"佳"代表表面二氧化硅層未有脫落的情形，"可"代表表面二氧化硅層有些微脫落的情形，而"差"代表表面二氧化硅層有嚴重脫落的情形；而在圖2A-1圖2C—2中，2A-1和2A-2分別為本發明的超順磁性粒子在高溫高壓處理前后的外型，表面二氧化硅層未有脫落的情形；2B-1和2B-2分別為Qiagen(公司名稱)的磁性粒子在高溫高壓處理前后的外型，表面二氧化硅層有些微脫落的情形2C-1和2C-2分別為Irwitrogen(公司名稱)的磁性粒子在高溫高壓處理前后的外型，表面二氧化硅層有嚴重脫落的情形。此外，磁性粒子是否耐高溫高壓處理，亦可配合下文所述，而由處理后的磁反應時間變化來觀察；若磁反應時間變慢，表示高溫高壓處理會造成磁性粒子氧化或使其磁性結構改變，表示該磁性粒子不耐高溫高壓處理，如表1所示。3)磁吸時間的測定磁吸時間的測定是在25至30'C下進行，將磁珠置于1ml或40ml的去離子水中。若去離子水的體積為lml，則利用小磁鐵進行測試；若其體積為40ml，則利用大磁鐵進行測試。在磁座上安裝大/小磁鐵，再把裝有磁性粒子和反應液體的容器放到磁座上，進行磁吸時間測試，測試結果如下表1所示。與市售產品比較，在反應體積大小不同的測試中可明顯看出，若反應體積愈大，則磁性愈強的磁性粒子，其反應操作的時間越短。表1.本發明與市售磁性粒子的特性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權利要求1.一種超順磁性粒子的制造方法，其包括下列步驟(a)將二價鐵化合物粉末、尿素和水混合攪拌，在80℃至110℃的常壓下進行回流反應1至24小時，生成氧化鐵粒子；(b)清洗前述氧化鐵粒子后再加入水、氨水和有機醇溶劑混合攪拌，進行超聲波震蕩；(c)在前述步驟(b)混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的溫度下反應0.5小時至12小時；及(d)將步驟(c)的產物溫度降至25℃至30℃后，另外加入硅酸四乙酯，反應1小時至12小時，形成有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子，其具有超順磁性。2.如權利要求1所述的方法，其還包括下列步驟(e)將前述步驟(d)的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子與pH值小于6的酸性緩沖液混合攪拌。3.如權利要求2所述的方法，其中前述酸性緩沖液為磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、MES緩沖液或Bis-Tris緩沖液。4.如權利要求1所述的方法，其還包括下列步驟(f)將前述步驟(d)的有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子移入極性有機溶劑中；(g)加入具有官能基的硅垸化物混合攪拌，使前述有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子表面具有官能基。5.如權利要求4所述的方法，其中前述極性有機溶劑為丙酮、DMSO、DMF、麗P或異丙醇。6.如權利要求4所述的方法，其中前述官能基選自由胺基、氫硫基、氫氧基、甲基、辛基、十八基和苯基所組成的組群。7.如權利要求4所述的方法，其中前述硅烷化物包含y-胺基丙基三乙氧基硅烷、(3-氫硫基丙基)三甲氧基硅烷、環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅垸、正辛基三乙氧基硅垸、十八基三甲氧基硅烷、或苯基三乙氧基硅烷。8.—種超順磁性粒子，其由權利要求1至7任一所述的方法所制得，其中前述超順磁性粒子的主要成分為四氧化三鐵，二氧化硅的重量含量為0.05%至40o/o，其粒徑范圍為100nm至10,。9.如權利要求8所述的超順磁性粒子，其飽合磁化量大于35e則/g。10.—種活化的超順磁性粒子，其由如權利要求2所述的方法制得，其在高鹽環境下對核酸分子具有強吸附力。11.一種表面具有官能基的超順磁性粒子，其由如權利要求4所述的方法制得。12.如權利要求11所述的超順磁性粒子，當前述超順磁性粒子表面所具有的官能基是胺基，其利用羥基活化劑進行修飾，使其與具有羧基官能基的蛋白質或化合物鍵結。13.如權利要求12所述的超順磁性粒子，其中前述羥基活化劑為EDAC、CMC、DCC或DIC。14.如權利要求12所述的超順磁性粒子，其中前述經羥基活化劑修飾后的超順磁性粒子與蛋白質鍵結后，用以純化抗體。15.如權利要求14所述的超順磁性粒子，其中前述蛋白質是蛋白質A、蛋白質G、抗體、酶或鏈霉親合素。16.如權利要求11所述的超順磁性粒子，其表面進一步利用螯合劑修飾，使其與過渡金屬離子螯合，純化帶有組胺酸的蛋白或磷酸化蛋白。17.如權利要求16所述的超順磁性粒子，其中前述螯合劑為三乙酸基胺、IDA或EDTA。全文摘要本發明提供一種超順磁性粒子及其制造方法，該方法包含下列步驟將二價鐵化合物粉末、尿素和水混合攪拌，在80℃至110℃的常壓下進行回流反應1至24小時，生成氧化鐵粒子；清洗前述氧化鐵粒子后再加入水、氨水和有機醇溶劑混合攪拌，進行超聲波震蕩；在前述混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的溫度下反應0.5小時至12小時；及將前述70℃的溫度下反應產物溫度降至25℃至30℃后，另外加入硅酸四乙酯，反應1小時至12小時，形成有二氧化硅包覆的氧化鐵粒子，其具有超順磁性；本發明還提供一種通過前述方法所制得的超順磁性粒子。文檔編號H01F1/032GK101306841SQ20071010382公開日2008年11月19日申請日期2007年5月16日優先權日2007年5月16日發明者楊裕勝申請人:臺灣圓點奈米技術開發有限公司