固定在疏水改性多糖中的酶的制作方法

專利名稱：固定在疏水改性多糖中的酶的制作方法
固定在疏水改性多糖中的酶本發明的多種方面之一是包含電子導體；至少一種陽極酶；和 酶固定化材料的生物陽極。陽極酶能夠與電子介體的氧化形式和燃料流體 反應產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式。電子介體的還原形 式能夠向電子導體釋放電子。酶固定化材料是燃料流體和電子介體可滲透
的并且包含疏水改性多糖。又一個方面是包含電子導體；至少一種陽極酶；酶固定化材料； 和電催化劑的生物陽極。陽極酶能夠與電子介體的氧化形式和燃料流體反 應產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式。酶固定化材料是燃料 流體和電子介體可滲透的并且包含疏水改性多糖。電催化劑鄰近電子導體。 電催化劑的氧化形式能夠與電子介體的還原形式反應產生電子介體的氧化 形式和電催化劑的還原形式，并且電催化劑的還原形式能夠向電子導體釋 放電子。本發明的又一個方面是包含電子導體；至少一種陰極酶；和酶 固定化材料的生物陰極。陰極酶能夠與電子介體的還原形式和氧化劑反應 產生電子介體的氧化形式和水。酶固定化材料包含電子介體、電催化劑、 或電子介體和電催化劑，是氧化劑可滲透的，并且包含疏水改性多糖。電 催化劑能夠從電子導體獲得電子產生電催化劑的還原形式，所迷電催化劑 的還原形式能夠與電子介體的氧化形式反應產生電子介體的還原形式和電 催化劑的氧化形式。本發明的另一個方面是固定在疏水改性多糖中的酶。疏水改性 多糖能夠使酶固定化和穩定化并且是比酶小的化合物可滲透的。另一個方面是固定在膠束疏水改性多陽離子聚合物中的酶，固 定化的酶比置于緩沖液中時的酶更有活性另一個方面是固定在膠束疏水改性多陰離子聚合物中的酶，固 定化的酶比置于緩沖液中時的酶更有活性。另一個方面是具有符合式1A的結構的膠束疏水氧化還原介體 改性脫乙酰殼多糖
其中n為整數；R幽獨立地為氫或疏水氧化還原介體；Rua獨立地為氫或
疏水氧化還原介體。
附圖描述圖2表示疏水改性脫乙酰殼多糖膜浸入FITC中的示例性熒光顯 微照片。圖5表示單個功能生物陽極或生物陰極。
圖6表示微流體生物燃料電池。
圖7(a)-(d)表示形成單個微電極的過程。
圖8表示微流體生物燃料電池組。圖9表示對丁基脫乙酰殼多糖葡糖脫氫酶而言從生產開始不同 日期所收集的一系列功率曲線。

圖10是具有介導(mediated)生物陽極(包含四丁基銨改性的 Nafioi^和NAD+依賴醇脫氫酶)和直接電子轉移生物陰極(包含丁基脫乙酰 殼多糖和膽紅素氧化酶)的生物燃料電池的功率曲線。圖11是具有介導生物陽極(包含丁基脫乙酰殼多糖和NAD+依賴 醇脫氫酶)和直接電子轉移生物陰極(包含丁基脫乙酰殼多糖和膽紅素氧化 酶)的生物燃料電池的功率曲線。圖12是采用四戊基銨離子改性的低分子量藻酸鹽的熒光顯微照片。本發明涉及生物陽極、生物陰極、生物燃料電池和包含疏水改性多糖，優選疏水改性脫乙酰殼多糖或疏水改性藻酸鹽的酶固定化材料。 疏水改性多糖形成在其中具有孔的膠束結構，所述孔有利地適于使酶固定 化。
一些所述的疏水改性多糖是多陽離子生物聚合物，所述多陽離子生物 聚合物是生物相容的并且非常適于使在酸性至中性環境中的酶(例如，對于
在pH為約5下是活性的酶而言)固定化。除了它的多陽離子特性以外，疏 水改性多糖可采用各種疏水基團改性，所述疏7jC基團可改變孔的形狀以適 應特定的酶或改變酶固定化材料的電子性能。本發明的多個方面之一是生物燃料電池，其通過在其中具有固 定酶的電極處發生的酶介導的氧化還原反應，利用燃料流體產生電。如在 標準電化學電池中，陽極是燃料流體的氧化反應同時釋放電子的部位。電 子通過電連接端子從陽極到達某種功率消耗裝置。電子通過該裝置遷移到 另一個電連接端子，其將電子輸送到生物燃料電池的生物陰極，在生物陰 極所述電子被用于使氧化劑還原以產生水。采用這種方式，本發明的生物 燃料電池作為其外部電負荷的能源(電)。為了促進燃料流體的氧化還原反 應，電極包含電子導體、電子介體、用于電子介體的電催化劑、酶和酶固 定化材料。替代性地，可以使用電子導體和酶，其中與生物陽極接觸的電
子介體能夠在未經改性的電極處在其氧化與還原形式之間轉移電子。如果 電子介體能夠在未經改性的生物陽極處在氧化與還原形式之間轉移電子，
物陽極被氧化而產生電子，從而產生電。在生物陰極處，來自生物陽極的電子流入生物陰極的電子導體 中。在那里，電子與電催化劑的氧化形式組合，其與電子導體接觸。該反 應產生電催化劑的還原形式，其又與電子介體的氧化形式反應以產生電子 介體的還原形式和電催化劑的氧化形式。接著，電子介體的還原形式與氧 化劑的氧化形式反應產生電子介體的氧化形式與水。在一個實施方案中， 存在氧化劑可滲透的酶固定化材料，其包含電催化劑和，任選地，電子介 體，并且其能夠使酶固定化和穩定化。本發明的生物燃料電池包含生物陰極和/或生物陽極。通常，生 物陽極包含實現燃料流體氧化從而釋放電子并將電子導入外部電負荷的元 件。所產生的電流為電負荷提供動力，隨后將電子導入生物陰極，在此處 使氧化劑還原并產生水。
A.生物陰極根據本發明的生物陰極包含電子導體、固定在酶固定化材料中 的酶、電子介體和電催化劑。在一個實施方案中，這些組件彼此相鄰，意 思是它們通過適當的方式在物理或化學上連接。
1.電子導體電子介體是可以接受或者供給電子的化合物。換句話說，電子 介體具有氧化形式，其可以接受電子以形成還原形式，其中還原形式也可 以供給電子以產生氧化形式。電子介體是可以擴散到固定化材料和/或摻入 到固定化材料中的化合物。生物陰極的電子介體可以是蛋白質，如漆樹藍蛋白 (stellacyanin)、蛋白質副產物如膽紅素、糖如葡萄糖、固醇如膽固醇、月旨 肪酸、金屬蛋白或其組合。電子介體還可以是氧化酶的輔酶或者基底。在 一個優選實施方案中，生物陰極的電子介體是膽紅素。
3. 用于電子介體的電催化劑通常，電催化劑是通過降低電子介體的標準還原電位以促進電 子導體處的電子釋i文的物質。通常，根據本發明的電催化劑是標準還原電位大于+0.4伏特的 有機金屬陽離子。示例性電催化劑是過渡金屬絡合物，例如鋨、釕、鐵、 鎳、銠、錸和鈷絡合物。使用這些絡合物的優選的有機金屬陽離子包含大 的有機芳族配體，所述配體允許大的電子自交換速率。大的有機芳族配體 的實例包括 1,10-菲咯啉(phenanthroline)(phen) 、 2，2，-聯吡啶
(bipyridine)(bpy)和2，2 ， ，2，，-三聯吡口定(terpyridine)(terpy)的4汙生物，如 Ru(phen)3+2、 Fe(phen)3+2、 Ru(bpy)3+2、 Os(bpy)3+2、和Os(terpy)3+2。在優 選的實施方案中，電催化劑是釕化合物。最優選地，生物陰極處的電催化 劑是Ru(bpy)3+2(由式2表示)。電催化劑以促進電子有效轉移的濃度存在。優選地，電催化劑 以使酶固定化材料傳導電子的濃度存在。具體地說，電催化劑以約10mM 至約3M,更優選約250mM至約2.25M,較優選約500mM至約2M,且 最優選約l.OM至約1.5M的濃度存在。在一個優選的實施方案中，膠束酶固定化材料是改性的全氟磺 酸-PTFE共聚物(或改性的全氟化離子交換聚合物)(改性的Nafioi^或改性 的Flemioi^)膜。將全氟化離子交換聚合物膜用大于銨(NH4+)離子的疏水陽 離子改性。疏水陽離子提供雙重功能(1)決定膜的孔尺寸和(2)用作化學緩 沖劑以幫助保持孔的pH水平，兩功能均使酶穩定化。關于疏水陽離子的第 一種功能，與疏水陽離子混合物澆鑄全氟 磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)以產生改性的全氟磺酸 PTFE共聚物(或者改性的全氟化離子交換聚合物)(Nafion⑧或Flemioi^)膜 提供了酶固定化材料，其中孔尺寸取決于疏水陽離子的大小。因此，疏水 陽離子越大，孔尺寸越大。疏水陽離子的上述功能允許通過改變疏水陽離 子的大小使得孔尺寸更大或更小以適合特定的酶。
00621關于疏水陽離子的第二種功能，通過使疏水陽離子交換作為全 氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的離子交換聚合物)膜上-SCV基團的反離 子的質子來改變全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的離子交換聚合物)膜 的性質。該反離子的改變對pH提供了緩沖效應，因為疏水陽離子對-803_ 位點比質子有更大的親和性。膜的這種緩沖效應導致孔的pH隨著溶液pH 的改變而基本上4呆持不變；換句話說，孔的pH對抗了溶液pH的改變。
此外，膜提供了機械屏障，其進一步保護了固定化的酶。為了制備改性的
全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的離子交換聚合物)膜，第一步是澆鑄 與疏水陽離子的溶液的全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的離子交換聚 合物)、尤其是Nafion⑧的懸浮液，以形成膜。然后將過量的疏水陽離子和 它們的鹽從膜中提取出來，并且將膜再澆鑄。在再澆鑄時，膜含有與全氟 磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的離子交換聚合物)膜的-S(V位點結合的疏 水陽離子。從膜中除去疏水陽離子的鹽得到更加穩定和可再生產的膜，因 為過量的鹽可陷入孔中并在膜中產生孔隙。2+和[Fe(菲咯啉)3]3+。在其它各種實施方案中，示例性膠束或反向膠束酶固定化材料 是疏水改性多糖，所述多糖選擇脫乙酰殼多糖、纖維素、甲殼質、淀粉、 直鏈淀粉、藻酸鹽、及其組合。在各種實施方案中，膠束或反向膠束酶固 定化材料為多陽離子聚合物，特別是疏水改性脫乙酰殼多糖。脫乙酰殼多 糖是聚[IHl-4)-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃型葡萄糖]。脫乙酰殼多糖通常通過甲 殼質(聚[(5-(1-4)-2-乙酰胺基-2-脫氧-D-吡喃型葡萄糖])的脫乙酰化制備。典 型的商購脫乙酰殼多糖具有約85。/。的脫乙酰化。所述脫乙酰的或游離的氨 基基團可進一步采用烴基，特別是烷基官能化。因此，在各種實施方案中， 膠束疏水改性脫乙酰殼多糖符合式1的結構式
<formula>formula see original document page 26</formula>
其中n為整數；Rw獨立地為氫、經基、取代烴基或疏水氧化還原介體； 且Ru獨立地為氫、烴基、取代烴基或疏水氧化還原介體。在本發明的某
些實施方案中，n為使聚合物分子量為約21,000至約500,000;優選約90,000 至約500,000;更優選約150,000至約350,000;更優選約225,000至約 275,000的整數。在許多實施方案中，Rn)獨立地為氫或烷基且Ru獨立地 為氬或烷基。替代性地，RK)獨立地為氫或己基且Ru獨立地為氬或己基。 任選地，R^獨立地為氪或辛基且Ru獨立地為氬或辛基。、 [Re(phen-二酮)3(PF6)2、聚(金屬酞菁)、聚(硫堇)、醌、二 亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩瘞，秦、吩噁嗪、甲苯胺藍、亮甲酚藍、 3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青I)、聚(尼羅藍A)、聚苯胺、聚吡 啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(瘞吩并[3，4-b噻吩)、聚(3-己基瘞吩)、聚(3，4-亞 乙基二氧吡咯)、聚(異硫茚)、聚(3，4-亞乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚 (4-二氰基亞甲基-4H-環戊[2，l-b;3,4-b，]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚 (中性紅)或其組合的過渡金屬絡合物。優選疏水氧化還原介體為Ru(phen)3+2 、 Fe(phen)3+2 、 Os(phen)3+2、 Co(phen)3+2、 Cr(phen)3+2、 Ru(bpy)3+2、 Os(bpy)3+2、 Fe(bpy)3+2、 Co(bpy)3+2、 Cr(bpy)3+2、 Os(terpy)3+2 、 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6畫己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Co(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Fe(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Os(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)"或其組合。更優選地，疏水氧化 還原介體為Ru(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Co(bpy)2(4-曱基 -4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Fe(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Os(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己 基)-2，2，-聯吡咬)+2或其組合。在各種優選的實施方案中，疏水氧化還原介 體為Ru(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2,2，-聯吡咬)+2。對于具有疏水氧化還原介體作為改性劑的固定化材料而言，疏 水氧化還原介體通常共價結合到脫乙酰殼多糖或多糖骨架上。通常，在脫 乙酰殼多糖的情況下，疏水氧化還原介體通過-N-C-鍵共價結合到脫乙酰殼 多糖的一個胺官能團上。在金屬絡合物氧化還原介體的情況下，金屬^ 物通過-N-C-鍵連接到脫乙酰殼多糖上，所述-N-C-鍵由脫乙酰殼多糖胺基 團至這樣的烷基，即其連接到金屬絡合物的配位體的一個或多個。符合式 1C的結構為金屬*物連接到脫乙酰殼多糖上的實例，
其中n為整數；R嵌獨立地為氫或符合式1D的結構；Ru。獨立地為氫或符 合式1D的結構；m為0至10的整數；且M為Ru、 Os、 Fe、 Cr或Co。
(PF6)2、聚(金屬酞菁)、 聚(硫堇)、醌、二亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯 胺藍、亮甲酚藍、3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青1)、聚(尼羅藍 A)、聚(亞甲綠)、聚(亞曱藍)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻 吩并3,4-bl噻吩)、聚(3-己基噻汾)、聚(3，4-亞乙基二氧吡咯)、聚(異硫茚)、 聚(3，4-亞乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亞甲基-4H-環戊 [2,l-b;3，4-b，二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性紅)、蛋白質、金屬 蛋白、漆樹藍蛋白或其組合。在一個優選的實施方案中，電子介體的電催 化劑是聚(亞甲綠)。
4.酵具體地說，用于生物陽極的示例性酶是氧化還原酶。在一個優 選的實施方案中，氧化還原酶作用于燃料(醇、氨化合物、糖類、醛、酮、
烴、脂肪酸等等)的CH-OH基團或者CH-NH基團。在另一個優選的實施方案中，所述酶是脫氬酶。該實施方案中 的示例性酶包括醇脫氬酶、醛脫氬酶、甲酸鹽脫氫酶、甲醛脫氬酶、葡萄 糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氬酶、乳糖脫氬酶、丙酮酸脫氫酶或者 脂肪氧合酶(lipoxygenase)。優選酶為醇脫氫酶(ADH)。當使用乙醇作為燃料時，可以使用Krebs cycle的酶。例如，在 生物陽極中可以-使用烏頭酸酶、富馬酸酶、蘋果酸脫氬酶、琥珀酸脫氫酶、 琥珀酰-CoA合成酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸脫氫酶、檸檬酸合酶及其 組合。如上所述，在生物燃料電池的生物陽極和/或生物陰極處使用酶 固定化材料。關于酶固定化材料的組成和固定化機理的進一步描述可見于 以上LA.5。在一個實施方案中，生物陽極的酶固定化材料對于燃料流體是 可滲透的并且使酶固定化和穩定化。固定化材料對燃料流體是可滲透的， 從而燃料流體在生物陽極處的氧化可以通過固定化,化。優選地，酶固 定化材料是疏水改性多糖，特別是疏水改性脫乙酰殼多糖或疏水改性藻酸 鹽。
6.生物陽極實施方案在另一個實施方案中，電子介體可以物理結合到酶上。物理連 接可以是電子介體與酶之間的共價鍵或離子鍵。在另一個實施方案中，如 果電子介體能夠在電子導體處進行可逆的電化學反應，那么電子介體可以 物理結合到酶上并且電子介體還可以物理結合到電子導體上。制備和4吏用生物陽極的方法是本領域已知的，所述方法可以用 于制造和使用包含本發明的生物陰極的生物燃料電池。優選的生物陽極描 述于美國專利申請10/617，452(作為美國專利申請公開2004/0101741公布) 中，在此將全文引入以作參考。其他可能有用的生物陽極描述于美國專利 6,531,239和6,294,281中，在此也將其引入以作參考。
C.燃料流體和氧化劑可以在生物陽極處被氧化以產生電子的燃料流體和可以在生物 陰極被還原產生水的氧化劑是本發明的生物燃料電池的組分。但是，與標準生物燃料電池不同，本發明的生物燃料電池至少 利用一個微才莫制的電極。在一個實施方案中，微模制的電極具有流動通過 結構，該結構允許燃料在微電極中流動。當與常規生物燃料電池電極相比 較時，該結構由于與燃料接觸的較大量的微電極表面積而產生較高的電流 密度。在另一個實施方案中，微模制的電極具有不規則的構形。再一次地， 由于與燃料接觸的較大量的微電極表面積，微電極的電流密度高于常規生
物燃料電池。該特征與本文所公開的其它特征相結合由尺寸較小的來源產 生了與常規生物燃料電池相比增加的電流密度。最后，本發明的方法可以 有利地經濟地用于生產一次性的燃料電池。
A.微流動通道在一個優選的實施方案中，電連接端子是在其它加工之前在微 流體生物燃料電池的基材上形成的薄層連接端子。在該實施方案中，隨后 形成的微電極如此排列，即它們貫穿交叉其各個電連接端子。在另外的實 施方案中，電連接端子是在其加工之后連接到微電極上的導電材料的圓柱 體。
III.微流體生物燃料電池的制造連接端子可以使用硅片工業中已知的常規光刻技術在基材上形 成。例如，為了形成薄層鉑電連接端子，首先將鈥粘合層濺射到基材上。 隨后在鈦層上濺射鈿層。兩種'減射過程均可例如在氬離子濺射體系中進行。 然后通過光刻法形成連接端子，將光刻膠施涂到鉑層以保護所需連接端子 位置。采用商購的蝕刻劑化學蝕刻兩層隨后去除光刻月交得到最終的鉑電連 接端子。在另外的實施方案中，電連接端子是最后形成的部件。該實施方 案在下面III.B.6中詳細描述。
B.微電極的制造在一個實施方案中，生物陽極和生物陰極在基材上依次形成， 其中形成順序并不重要。僅僅為了介紹，首先詳細描述生物陽極的制造。 制造微尺度的生物陽極的第 一步是在澆鑄模具的表面中形成微通道圖案。 通常，澆鑄模具可以由非導電、不使導電材料鈍化的任何材料制成并且能 夠可逆地密封到基材上，示例性材料包括硅、玻璃和聚合物。澆鑄4莫具優 選由聚合物制成，更優選由PDMS制成。最優選地，澆鑄模具由聚碳酸酯 制成。
"或[Fe(菲咯啉)33+。
16、 權利要求14的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中疏水 陽離子包括由式4表示的季銨陽離子<formula>formula see original document page 4</formula>其中R,、 R2、 R3和R4獨立地為氫、烴基、取代烴基、或雜環，其中R^ R2、 R3和R4的至少之一不是氫。
17、 權利要求16的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中Rp R2、 R;j和R4獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、 辛基、壬基或癸基，其中Rp R2、 R3和R4的至少之一不是氫。
18、 權利要求16的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中Rp R2、 R3和R4相同且為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。
19、 權利要求16的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中Rp R2、 R3和R4為丁基。
20、 權利要求16的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中Rp R2、 R3和Rj之一為己基、辛基、癸基、十二烷基或十四烷基并且其它基 團獨立地為甲基、乙基或丙基。
21、 權利要求12的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中所述 膠束疏水改性多糖符合式1的結構式<formula>formula see original document page 5</formula>其中n為整數；Rn)獨立地為氫、烴基、取代烴基或疏水氧化還原介體；且 Ru獨立地為氫、烴基、取代烴基或疏水氧化還原介體。
22、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中疏水 改性多糖具有的分子量為約90,000至約500,000。
23、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中疏水 改性多糖具有的分子量為約225,000至約275,000。
24、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中R10 獨立地為氫或烷基且Ru獨立地為氫或烷基。
25、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中R10 獨立地為氫或己基且Ru獨立地為氫或己基。
26、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中R10 獨立地為氫或辛基且Ru獨立地為氫或辛基。
27、 權利要求21的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中R10 獨立地為氫或疏水氧化還原介體且Ru獨立地為氫或疏水氧化還原介體。
28、 權利要求21或27的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其 中疏水氧化還原介體為鋨、釕、鐵、鎳、銠、錸或鈷與1，10-菲咯啉(phen)、 2，:2，-聯吡啶(bpy)或2，:2，，:2"-三聯吡啶(terpy)、亞曱綠、亞甲藍、聚(亞甲綠)、 聚(亞曱藍)、魯米諾、硝基-芴酮衍生物、吖溱、鋨菲咯啉二酮、兒茶酚-側基三聯吡啶、甲苯藍、曱酚藍、尼羅藍、中性紅、吩溱衍生物、tkmin、 天青A、天青B、甲苯胺藍O、苯乙酮、金屬酞菁、尼羅藍A、改性過渡 金屬配位體、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen-二 酮)(CO)3Cl、[Re(phen-二酮)3](PF6)2、聚(金屬酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亞 胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩瘞噪、吩噁溱、曱苯胺藍、亮甲酚藍、3,4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青I)、聚(尼羅藍A)、聚苯胺、聚吡啶、 聚吡咯、聚噻吩、聚(噻吩并[3，4-b噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亞乙基 二氧吡咯)、聚(異硫茚)、聚(3，4-亞乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二 氰基亞甲基-4H-環戊[2，l-b;3，4-b，]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性 紅)或其組合的過渡金屬^物。
29、 權利要求21或27的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其 中疏水氧化還原介體為Ru(phen)3+2 、 Fe(phen)3+2 、 Os(phen)3+2 、 Co(phen)3+2、 Cr(pheii)3+2、 Rn(bpy)3+2、 Os(bpy)3+2、 Fe(bpy)3+2、 Co(bpy)3+2、 Cr(bpy)3+2、 Os(terpy)3+2、 Ru(bpy)2(4-曱基-4，畫(6-己基)-2，2，國聯吡啶)+2、 Co(bpy)2(4-曱基-4，畫(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，畫(6-己 基)-2，2，畫聯吡咬)+2 、 Fe(bpy)2(4-甲基-4，畫(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Os(bpy)2(4-甲基_4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2或其組合。
30、 權利要求21或27的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其 中疏水氧化還原介體為Ru(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Co(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己 基)-2，2，-聯吡咬)+2 、 Fe(bpy)2(4-曱基-4，畫(6畫己基)-2，2，畫聯吡咬)+2 、 Os(bpy)2(4-甲基_4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2或其組合。
31、 權利要求21或27的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其 中疏水氧化還原介體為11110^7)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2。
32、 權利要求1-31中任一項的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池， 其中電子導體包括基于碳的材料、金屬導體、半導體、金屬氧化物或經改 性的導體。
33、 權利要求1-32中任一項的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池， 其中電子導體包括基于碳的材料。
34、 權利要求33的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池，其中電子 導體包括碳布、碳紙、碳絲網印刷的電極、碳黑、碳粉、碳纖維、單壁碳 納米管、雙壁碳納米管、多壁碳納米管、碳納米管陣列、金剛石-涂布的導 體、玻璃碳和中孔碳、石墨、未壓縮的石墨蠕蟲、分層的經純化片狀石墨、 高性能石墨、高度有序的熱解石墨、熱解石墨和多晶石墨。
35、 權利要求1-34中任一項的生物陽極、生物陰極或生物燃料電池， 其中酶包括氧化還原酶。
36、 4又利要求1-4、 7、 8和10-35中任一項的生物陽極或生物燃料電 池，其中陽極酶包括葡萄糖氧化酶、基于醇的氧化酶或基于膽固醇的氧化 醉。
37、 權利要求5、 6、 7和9-36中任一項的生物陰極或生物燃料電池， 其中陰極酶包括漆酶、細胞色素C氧化酶、膽紅素氧化酶或過氧化物酶。
38、 權利要求5、 6、 7和9-36中任一項的生物陰極或生物燃料電池， 其中陰極酶包括在pH為約6.5與約7.5之間時具有最佳活性的氧氧化還原
39、 權利要求5、 6、 7和9-36中任一項的生物陰極或生物燃料電池， 其中陰極酶包括膽紅素氧化酶。
40、 權利要求1-4、 7、 8和10-39中任一項的生物陽極或生物燃料電 池，其中陽極酶包括PQQ依賴脫氫酶。 ，
41、 權利要求7-40中任一項的生物燃料電池，其中氧化劑包括陽極 或過氧化物。
42、 權利要求41的生物燃料電池，其中氧化劑包括氧。
43、 權利要求7-42中任一項的生物燃料電池，其中燃料流體包括氨、 曱醇、乙醇、丙醇、異丁醇、丁醇和異丙醇、烯丙醇、芳基醇、甘油、丙 二醇、甘露醇、葡萄糖醛酸、醛、糖類、葡萄糖、葡萄糖-1、 D-葡萄糖、 L-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酯、乳酸酯、乳酸酯-6-磷酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、果糖、半乳糖-1、半乳糖、醛糖、山梨糖、甘露糖、甘油酸酯、 輔酶A、乙酰輔酶A、蘋果酸酯、異檸檬酸酯、甲醛、乙醛、乙酸酯、檸 檬酸酯、L-葡糖酸酯、p-羥基類固醇、a-羥基類固醇、乳醛、睪酮、葡糖 酸酯、脂肪酸、脂類、磷酸甘油酸酯、視黃醛、雌二醇、環戊醇、十六醇、 長鏈醇、+〉柏醇、肉桂醇、甲酸酯、長鏈醛、丙酮酸酯、丁醛、酰基輔酶 A、類固醇、氨基酸、黃素、NADH、 NADH2、 NADPH、 NADPH;j或氫。
44、 權利要求43的生物燃料電池，其中燃料流體包括甲醇、乙醇或 丙醇。
45、 權利要求44的生物燃料電池，其中燃料流體包括乙醇。
46、 權利要求7、 8和10-45的生物燃料電池，其中生物陽極包括具 有靜電結合到其上的PQQ分子的PQQ依賴醇脫氫酶。
47、 權利要求7和10-46的生物燃料電池，其中生物陽極和生物陰 極并未通過鹽橋或聚合物電解質膜分離開來。
48、 一種使用權利要求7-47中任一項的生物燃料電池產生電的方 法，其包括(a) 在陽極或生物陽極使燃料流體氧化并且在陰極或生物陰極使氧化劑還 原；(b) 在陰極或生物陰極使氧化劑還原期間使電子介體的還原形式氧化；(c) 使電催化劑氧化；和(d) 在電子導體處使電催化劑還原。
49、 一種使用權利要求7-47中任一項的生物燃料電池產生電的方 法，其包括 (a) 在陽極或生物陽極使燃料流體氧化并且在陰極或生物陰極使氧化劑還原；(b) 在陰極或生物陰極使氧化劑還原期間使電子介體的還原形式氧化；和(c) 在電子導體處使電子介體還原。
50、 一種固定在膠束疏水改性多糖中的酶，膠束疏水改性多糖能夠 使酶固定化和穩定化，膠束疏水改性多糖對比酶小的化合物是可滲透的。
51、 權利要求50的固定化的酶，其在包含大于約95重量％或95體 積％乙醇的溶液中。
52、 一種固定在膠束疏水改性多陽離子聚合物中的酶，固定化的酶 比置于緩沖液中時的酶更有活性。
53、 一種固定在膠束疏水改性多陰離子聚合物中的酶，固定化的酶 比置于緩沖液中時的酶更有活性。
54、 權利要求50-53中任一項的固定化的酶，其中酶包括醇脫氫酶、 醛脫氫酶、甲酸鹽脫氫酶、甲醛脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、 乳酸脫氫酶、乳糖脫氫酶、丙酮酸脫氫酶或膽紅素氧化酶。
55、 權利要求50-52中任一項的固定化的酶，其中多糖或多陽離子 聚合物包括脫乙酰殼多糖。
56、 權利要求50、 51和53中任一項的固定化的酶，其中多糖或多 陽離子聚合物包括藻酸鹽。
57、 權利要求50、 51、 52、 54或55中任一項的固定化的酶，其中 膠束疏水改性多糖或膠束疏水改性多陽離子聚合物符合式I<formula>formula see original document page 9</formula>其中n為整數; R,o獨立地為氫、烴基、取代烴基或疏水氧化還原介體；且 Ru獨立地為氫、烴基、取代烴基或疏水氧化還原介體。
58、 權利要求57的固定化的酶，其中Rn)獨立地為氫或烷基且Ru 獨立地為氬或烷基。
59、 權利要求57的固定化的酶，其中R^獨立地為氫或己基且Ru 獨立地為氫或己基。
60、 權利要求57的固定化的酶，其中Ru)獨立地為氫或辛基且Ru 獨立地為氫或辛基。
61、 權利要求57的固定化的酶，其中Rn)獨立地為氫或疏水氧化還 原介體且Ru獨立地為氫或疏水氧化還原介體。
62、 權利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化還原介體為鋨、釕、 鐵、鎳、銠、錸或鈷與1，10-菲咯啉(phen)、 2，2，-聯吡啶(bpy)或2，2，，2"-三 聯吡啶(terpy)、亞曱綠、亞曱藍、聚(亞甲綠)、聚(亞甲藍)、魯米諾、硝基 -芴酮衍生物、吖、秦、鋨菲咯啉二酮、兒茶酚-側基三聯吡啶、曱苯藍、曱 酚藍、尼羅藍、中性紅、吩溱衍生物、tionin、天青A、天青B、曱苯胺藍 O、苯乙酮、金屬酞菁、尼羅藍A、改性過渡金屬配位體、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen-二酮)(CO)3Cl、[Re(phen-二酮)3](PF6)2、聚(金屬酞箐)、聚(硫堇)、醌、二亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、曱苯胺藍、亮甲酚藍、3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯 酸)、聚(天青I)、聚(尼羅藍A)、聚苯胺、聚吡咬、聚吡咯、聚噻吩、聚(瘞 吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基瘞吩)、聚(3,4-亞乙基二氧吡咯)、聚(異硫茚)、 聚(3,4-亞乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亞甲基-4H-環戊 [2，l-b;3，4-b，]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性紅)或其組合的過渡 金屬絡合物。
63、 權利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化還原介體為 Ru(phen)3+2 、 Fe(phen)3+2 、 Os(phen)3+2 、 Co(phen)3+2 、 Cr(phen)3+2 、 RU(bpy)3+2、 0S(bpy)3+2、 Fe(bpy)3+2、 Co(bpy)3+2、 Cr(bpy)3+2、 Os(terpy)/2、 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Co(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己 基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Cr(bpy)2(4-曱基-4，國(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Fe(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2,2，-聯吡咬)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2 或其組合。
64、 權利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化還原介體為 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Co(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己 基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、 Fe(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2、080^7)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡11定)+2或其組合。
65、 權利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化還原介體為 Ru(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2。
66、 一種膠束疏水改性脫乙酰殼多糖，其具有至少約10%的通過疏 水基團改性的脫乙酰殼多糖的胺官能團。
67、 一種具有符合式1A的結構的膠束疏水氧化還原介體改性的脫 乙酰殼多糖<formula>formula see original document page 11</formula>其中n為整數；R衞獨立地為氫或疏水氧化還原介體；和 Rlla獨立地為氫或疏水氧化還原介體。
68 、 權利要求67的改性脫乙酰殼多糖，其中疏水氧化還原介體為鋨、 釕、鐵、鎳、銠、錸或鈷與1，10-菲咯啉(phen)、 2，2，-聯吡啶(bpy)或2,2，，2，，-三聯吡啶(terpy)、亞甲綠、亞曱藍、聚(亞曱綠)、聚(亞甲藍)、魯米諾、硝 基-芴酮衍生物、吖喚、鋨菲咯啉二酮、兒茶酚-側基三聯吡啶、曱苯藍、 甲酚藍、尼羅藍、中性紅、吩噪衍生物、tionin、天青A、天青B、曱苯胺 藍O、苯乙酮、金屬酞蕢、尼羅藍A、改性過渡金屬配位體、l，lO-菲咯啉 -5,6畫二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen畫二酮)(CO)3C1]、 [Re(phen-二酮)3(PF6)2、聚(金屬酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、曱苯胺藍、亮甲酚藍、3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯 酸)、聚(天青I)、聚(尼羅藍A)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(瘙 吩并[3，4-b噻吩)、聚(3-己基漆吩)、聚(3，4-亞乙基二氧吡咯)、聚(異硫茚)、 聚(3，4-亞乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亞甲基-4H-環戊 [2，l-b;3，4-b，I二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性紅)或其組合的過渡 金屬絡合物。
69、 權利要求67的改性脫乙酰殼多糖，其中疏水氧化還原介體為 Ru(phen)3+2 、 Fe(phen)3+2 、 Os(phen)3+2 、 Co(phen)3+2 、 Cr(phen)3+2 、 Ru(bpy)3十2、 0S(bpy)3+2、 Fe(bpy)3+2、 Co(bpy)3+2、 Cr(bpy)3+2、 0S(terpy)3+2 、 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Co(bpy)2(4-甲基-4，-(6曙己 基)畫2，2，-聯吡咬)+2 、 Cr(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡。定)+2 、 Fe(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、Os(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2 或其組合。
70、 權利要求67的改性脫乙酰殼多糖，其中疏水氧化還原介體為 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡啶)+2 、 Co(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己 基)-2,2，-聯吡咬)+2、 Cr(bpy)2(4-曱基畫4，-(6陽己基)-2，2，-聯吡啶)+2、 Fe(bpy)2(4-曱基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2或其組合。
71、 權利要求67的改性脫乙酰殼多糖，其中疏水氧化還原介體為 Ru(bpy)2(4-甲基-4，-(6-己基)-2，2，-聯吡咬)+2。
全文摘要
本發明提供了生物陽極、生物陰極、生物燃料電池、固定化的酶和包含膠束疏水改性多糖的固定化材料。具體地說，膠束疏水改性多糖可以是疏水改性脫乙酰殼多糖或疏水改性藻酸鹽。
文檔編號H01M8/00GK101366137SQ200680050189
公開日2009年2月11日 申請日期2006年11月2日 優先權日2005年11月2日
發明者R·杜馬, S·D·明特爾, T·L·克勞茨巴赫 申請人:圣路易斯大學