生物納米磁性靶向抗癌藥物及制備方法

專利名稱：生物納米磁性靶向抗癌藥物及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物納米磁性靶向抗癌藥物，是以生物納米磁小體為載體的一種磁靶向藥物。
背景技術：
目前，癌癥是人類死亡率居首位的頑癥，至今，癌癥治療仍大多采用傳統的全身化療法，由于化學藥物在患者全身分布，對患者正常組織細胞產生毒害，臨床使用中存在許多副作用，例如脫發，脊髓毒性，肝、腎功能衰竭等，造成不良反應，致使癌癥患者痛苦不堪，很多患者最終并非死于癌癥本身，而是死于化療引起的副作用。
為了提高腫瘤化療效果，減輕藥物對正常組織的毒副作用，近幾十年來，以局部靶向定位治療為目的的各種新型藥物投遞系統成為研究熱點。其中磁靶向治療在癌癥局部靶向定位治療中展現出巨大的應用前景，有望逐步代替全身化療，成為一種高效、安全的癌癥治療方法。磁靶向治療是以納米磁性粒子為藥物載體，利用磁粒特殊的超順磁性能，在外磁場推動下，使藥物具有準確的主動靶向性，藥物對細胞膜和血腦屏障強大的穿透力，直接作用于腫瘤細胞，從而提高藥物的療效，并有效地降低對對正常細胞的毒副作用。
目前，磁靶向治療的研究主要集中于人工合成鐵氧體磁性納米載藥體系和磁性液體材料的制備以及其相關技術對惡性腫瘤的早期診斷和治療。研究表明，人工合成的磁性納米顆粒能與多種抗癌藥物連接，具有較強的靶向定位功能，并成功應用于一些癌癥的早期診斷和治療。然而，目前由于技術原因，人工合成的磁顆粒粒形差異大，大小不均勻，粒度分布范圍寬，達到納米級顆粒的比例只占小部分；此外，還由于無機非金屬納米顆粒表面電荷密度偏低，易聚集，難降解的原因，導致藥物裝載量低，不穩定，毒性較大，使應用范圍受到局限。
生物納米磁小體又稱細菌納米磁小體(magnetosome)，是最近十幾年才發現的一種新型的納米生物磁體，它是在具有趨磁性的革蘭氏陰性細菌一趨磁細菌(magnetotactic bacteria)細胞內形成的納米磁性顆粒，磁粒大小在35-120nm范圍內，在永久的單磁疇晶尺寸范圍之內，主要成分為Fe3O4或Fe3S4，每個磁顆粒表面由嵌合蛋白質的磷脂雙分子脂膜包被，分離純化后的細菌納米磁小體在溶液中分散性好，穩定性高。目前，經固定化酶載體，免疫檢測、基因轉移，DNA、RNA的分離和標記等方面的研究結果表明，細菌納米磁小體固定化酶量大(可達人工合成磁性納米顆粒的100倍)，抗體連接量大，免疫檢測靈敏度高，DNA吸附量大，應用前景非常廣闊。但是由于趨磁細菌對營養的要求苛刻，以及具有微好氧、厭氧等特性，其培養水平一直很低，難以獲得足夠量高純度磁小體提供相關實驗使用，迄今為止，尚未見采用生物納米磁小體進行載藥方面研究的報道。最近，中國農業大學已建立了大量培養趨磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1的方法，已摸索出簡便的磁小體回收及純化的技術路線，通過破碎趨磁細菌細胞，提取并純化趨磁細菌細胞內合成的納米磁顆粒，并獲得了國家專利(專利號02125920.8，03153488.0)。

發明內容
本發明的目的是針對靶向治療腫瘤的需求，解決目前人工合成納米磁性藥物載體普遍存在的載藥量低、穩定性差、毒性高和靶向性不強等問題，利用生物納米磁小體這一納米級、晶型穩定的自然資源為藥物載體，制備出一種具有適當的粒徑與粒形，高載藥量和藥物包封率，生物相溶性好，易降解，毒性低，穩定性高的具有抗癌功能的納米磁性靶向藥物及生物納米磁小體載藥方法。
本發明生物納米磁性靶向抗癌藥物由生物納米磁小體與抗癌藥物通過物理吸附或化學偶聯劑偶聯而成，所說的生物納米磁小體是趨磁細菌細胞內形成的納米磁性顆粒，粒徑35-120nm，主要成分為Fe3O4或Fe3S4，單個磁顆粒有脂膜包被，所說的抗癌化學藥物包含化療藥物、抗體藥物、核酸類藥物、放射性核素。常用的化療藥物如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依達比星、吡柔比星、絲裂霉素、平陽霉素、培洛霉素、伊力替康、紫杉醇等；常用的核酸類藥物如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羥基脲、6-羥基嘌呤等；常用的放射性核素如99mTc、131I、123I、111In等)；常用的抗體藥物如Herceptin(赫塞汀)、Rituxan(利妥昔單抗)、美妥昔單抗、Zevalin、Bexxar、Edrecolomab、muromonab、Trastuzumab、Alemtuzumab等，包括抗IgG1、抗CEA、抗CD3、抗CD33、抗CD52、抗CD20、抗ERBB2、抗IGE Fc、抗EpCAM等多種類型。
本發明生物納米磁性靶向抗癌藥物可分別由以下方法制備一.物理吸附法步驟如下將抗癌化學藥物、生物納米磁小體的純水或緩沖溶液混合，攪拌或間斷地脈沖超聲下反應；用磁鐵吸出磁小體，用純水或磷酸緩沖溶液洗滌數次，再用磁鐵吸出磁小體，得產品。
本法通過物理吸附的方法將抗癌藥物吸附在磁小體的表面，適用于幾乎所有的抗癌化學藥物。
二.化學偶聯法生物納米磁小體外包被的脂膜由嵌合蛋白質的磷脂雙分子層組成，其生化性質和功能與細胞膜一致。目前已有三種趨磁細菌菌株合成的磁小體脂膜組分被證實Magnetospirillum.Magnetotacticum MS-1的磁小體的包膜脂類包括三個部分中性脂類及游離脂肪酸、糖脂及硫脂、磷酸脂，它們在總脂中所占重量百分比分別為8％、30％、62％，其中磷酸脂的主要成分是磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺；M.magneticum AMB-1的磁小體包膜的磷脂雙分子層含有98％的脂類和2％其他組分的復合物，每毫克磁小體含有31.79微克的脂肪酸，其中棕櫚油酸與油酸占90％，磷脂占總脂類的58％，磷脂酰乙醇胺則占磷脂的50％。對M.gryphiswaldense MSR-1的磁小體包膜的生化分析表明，其含有的磷脂和脂肪酸與亞細胞器外膜上的類似，都大量存在磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。
本發明充分利用生物納米磁小體表面脂膜的上述組分以及其中豐富的氨基、鄰二醇、羧基等活性基團，采用不同的連接方法和特定的偶聯劑，針對不同的化學基團與各種抗癌藥物進行連接，制備生物納米磁性靶向抗癌藥物。
本發明采用的化學偶聯方法有以下幾種1、直接偶聯法實現氨基與氨基的連接由于磁小體外包被的脂膜中含有重要組分為磷脂酰乙醇胺，帶有大量的伯氨基，另一方面，常見的抗癌藥物幾乎均含氨基，如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依達比星、吡柔比星等化療藥物及阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羥基脲、6-羥基嘌呤等)等核酸藥物，化學式中均含有一個氨基；而絲裂霉素、平陽霉素、培洛霉素等化療藥物以及Herceptin(赫塞汀)、Rituxan(利妥昔單抗)、美妥昔單抗、Zevalin、Bexxar、Edrecolomab、muromonab、Trastuzumab、Alemtuzumab等抗體藥物、蛋白或抗體標記的放射性核素等藥物則含有多個氨基。本發明根據這一特點，選用特定的偶聯劑與氨基連接，實現納米生物磁小體脂膜與化學藥物的偶聯。
偶聯方法如下原料抗癌藥物及生物納米磁小體脂膜分別含有氨基，采用偶聯劑，所說的偶聯劑是含有如下至少兩個相同或不相同基團的化合物醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基；其中含N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基的偶聯劑也可由含羧基的試劑與N-羥基丁二酰亞胺、N-羥基丁二酰亞胺磺酸鈉或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺(EDC)反應而得。可將偶聯劑與生物納米磁小體和抗癌藥物二者同時反應，一步偶聯，也可將偶聯劑先與生物納米磁小體反應，然后再與抗癌藥物反應，二步偶聯。
偶聯劑優選自戊二醛、乙二醛、丙二醛、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(N，N’-Disuccinimidyl suberate，DSS)、N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(N，N’-Disuccinimidyl carbonate，DSC)、3-琥珀酰亞胺-氨基三醋酸酯、丁二酸/酐或戊二酸/酐。
以偶聯劑戊二醛為例，偶聯反應通式如下式中黑式圓球表示包有脂膜的生納米磁小體，矩形框表示抗癌藥物，下同。
以上偶聯劑也可先與生物納米磁小體及聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖類聚合物一步或分步反應，使生物納米磁小體先與聚合物連接，再將連接了聚合物的生物納米磁小體與N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺9(簡稱EDC)反應，使聚合物上的羧基轉化為N-琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與原料抗癌藥物反應，得產品。
以聚谷氨酸(簡稱PLGA，下同)為例，偶合過程如下式
聚合物PLGA分子含有氨基和多個羧基，上式中，由偶聯劑戊二醛使生物納米磁小體和聚合物PLGA偶聯，使其連接上多個羧基官能團，然后在EDC的作用下使各羧基轉化為琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與抗癌藥物的氨基連接，從而實現納米磁小體與抗癌藥物的偶聯。本法利用聚合物含有多個羧基的特性，可使磁小體偶聯更多的抗癌藥物。
2.氧化法實現鄰二醇結構與氨基的連接對于脂膜含有鄰二醇基團的生物納米磁小體，本發明用氧化劑高碘酸鈉或高碘酸鉀與生物納米磁小體反應，將磁小體表面脂膜分子中的鄰二醇結構氧化為醛基，然后與含氨基的抗癌藥物反應，得產品。
反應通式如下 3.間接法實現羧基與氨基的連接對于原料抗癌藥物和生物納米磁小體中的一方含有羧基，另一方含有氨基的情況，本發明先以N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺(簡稱EDC)與含羧基的一方反應，將羧基轉化為琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與含氨基的一方反應，得產品。
反應路線如下
4.用異型偶聯劑實現氨基與巰基或二硫鍵的連接鑒于生物磁小體外包被的脂膜含有大量的伯氨基，另一方面，幾乎所有含抗體以及蛋白類藥物(如抗體藥物、蛋白或抗體標記的放射性核素、部分化療藥物等)都帶有二硫鍵或巰基的特點，本發明選用異型偶聯劑對生物納米磁小體的氨基修飾，使其連上二硫鍵或馬來酰亞胺基，然后與含有巰基的藥物連接；或再將磁小體已連上的二硫鍵還原成巰基，再與含有二硫鍵的抗癌藥物連接；本方法通過不同途徑使抗癌藥物和生物納米磁小體中的一方連有二硫鍵，另一方連有巰基，利用二硫鍵與巰基的交換反應實現磁小體與抗癌藥物的偶聯；或者一方連有馬來酰亞胺基，另一方連有巰基，以巰基取代反應實現磁小體與抗癌藥物的偶聯。
所采用的異型偶聯劑是指一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基，另一端含有二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的化合物。其中一端含N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基的偶聯劑也可由含羧基的試劑與N-羥基丁二酰亞胺、N-羥基丁二酰亞胺磺酸鈉或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺(EDC)反應而得。
常用的異型偶聯劑有3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)、N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)、N-(4-馬來酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺(GMBS)、N-(4-馬來酰亞胺基癸酰氧基)琥珀酰亞胺(HMCS)、N-(4-馬來酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺(GMBS)、N-(4-馬來酰亞胺基十一酰氧基)琥珀酰亞胺(KMUS)、N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺磺酸鈉(Sulfo-EMCS)、N-(4-馬來酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺磺酸鈉(Sulfo-GMBS)、N-(4-馬來酰亞胺基癸酰氧基)琥珀酰亞胺磺酸鈉(Sulfo-HMCS)、N-(4-馬來酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺磺酸鈉(Sulfo-GMBS)、N-(4-馬來酰亞胺基十一酰氧基)琥珀酰亞胺磺酸鈉(Sulfo-KMUS)等。
對于抗癌藥物含有巰基或二硫鍵，生物納米磁小體含有氨基的情況，采用本法如下將異型偶聯劑與生物納米磁小體反應，使磁小體連接二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基，然后由以下三個工藝路線之一得產品(1)將連接了二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的磁小體直接與含巰基的抗癌藥物反應；(2)將含二硫鍵的抗癌藥物與二硫蘇糖醇(簡稱DTT)反應使二硫鍵轉化為巰基，再與連接了二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的磁小體反應；(3)連接了二硫鍵的磁小體與DTT反應使二硫鍵轉化為巰基，然后與含二硫鍵的抗癌藥物反應。
工藝路線(1)和(2)包含于下式(式中表示含巰基的藥物可由含二硫鍵藥物與二硫蘇糖醇反應而得)以3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)為異型偶聯劑 或者以N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)為異型偶聯劑 工藝路線(3)如下式表示
對于抗癌藥物和生物納米磁小體均含有氨基的情況，采用本法如下將生物納米磁小體及抗癌藥物分別與異型偶聯劑反應，使磁小體及抗癌藥物分別連接二硫鍵或一方連接二硫鍵另一方連接N-琥珀酰亞胺基，再將其中連接二硫鍵的一方與二硫蘇糖醇反應而還原成巰基，然后與未還原的另一方反應，得產品。
當抗癌藥物和磁小體分別與同一異型偶聯劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)反應時，本法如反應路線(a)。
當抗癌藥物和磁小體分別與不同異型偶聯劑N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)和磁小體與3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)反應時，本法如反應路線(b)。
路線(a) 路線(b) 本方法還可在以上異型偶聯劑與抗癌藥物或納米磁小體的一方反應之前，先與聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖類聚合物反應，使偶聯劑與聚合物連接，再與N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺反應，使聚合物上的羧基轉化為N-琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與該方原料反應。
以聚谷氨酸(簡稱PLGA)為聚合物，3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)為偶聯劑，反應路線如下
本發明以上各種偶聯方法中，各步反應均在純水或磷酸緩沖溶液中攪拌或間斷地脈沖超聲下進行，生物納米磁小體的每次反應后產物均用磁鐵吸出并純水或緩沖溶液洗滌。
本發明為磁小體與具有不同物理化學性質的藥物之間的偶聯方法提供了多種的選擇，各種偶聯方法均在常溫(0-45℃)常壓下進行，工藝簡單易行。
綜上所述，本發明利用生物納米磁小體外層脂膜獨特的結構特征和活性官能團，采用各種物理和化學方法將生物納米磁小體與抗癌藥物偶聯，制得生物納米磁性靶向抗癌藥物。載有抗癌藥物的生物納米磁小體在患者體內通過降解磁小體即可實現藥物的釋放。通過外加磁場，生物納米磁性靶向抗癌藥物可以被準確地運送到病灶部位，減少藥物與正常組織的接觸，降低副作用，提高藥效，實現針對腫瘤的局部靶向定位治療。由于生物納米磁小體來自活體細胞，具有優越的生物相溶性，毒副作用小；生物納米磁小體粒型一致，顆粒均勻，晶型穩定，無其它雜質；其尺寸均在納米級，具有較大的比表面積；電負性較大且可調節，不易聚集；同時由于每個磁小體的單體均有脂膜包被，活性基團豐富，表面可進行各種化學修飾，方便地與多種藥物連接。因此，本生物磁性靶向抗癌藥物在靶向定位治療腫瘤方面展現出誘人的應用前景。
具體實施例方式
下面各實施例中采用的試劑和儀器說明如下生物納米磁小體由MSR-1趨磁細菌菌株培養而得，粒徑為40-50nm，由中國農業大學生物學院微生物系提供。
抗癌化療藥物阿霉素(ADM)購于北京云迪同創醫藥科技有限公司。
水二次去離子水。
氯仿、乙醇、二氧六環、鹽酸、氫氧化鈉等所用溶劑和試劑均為分析純。
檢測設備日本島津UV-3100型紫外-可見光譜儀，石英池厚1cm和0.5mm；KQ-100型超聲波振蕩器；實施例1物理吸附法制生物磁小體載阿霉素實驗步驟將抗癌藥物阿霉素溶液和生物納米磁小體懸浮液混合，攪拌或間斷地脈沖超聲下反應0.5-24小時，4℃放置過夜；用磁鐵吸附磁小體，用純水或緩沖溶液洗滌數次，再用磁鐵吸附磁小體，得產品。
實驗結果由表一結果可以看出(1)采用直接物理吸附法，生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量高，本實驗最高可達11.07×103μgADM/mgBMP，而通常人工合成鐵氧體磁性納米顆粒中阿霉素的含量57.5μg，可見生物納米磁小體載藥量比其高近192倍。
(2)采用直接物理吸附法，載藥量大小與兩者的濃度及濃度比例密切相關，隨CAMS/CBMP的值的增大，BMP的單位載藥量也顯著增加。
(3)BMP絕對濃度也強烈影響其載藥量。在BMP濃度較低的條件下(0.018mg/ml)，在CAMS/CBMP值為1∶1時其單位載藥量為431.1μgADM/mgBMP，是人工合成鐵氧體磁性納米顆粒的7.5倍。但當BMP濃度升高至0.2mg/ml時，即使在CAMS/CBMP值為1.6∶1時其單位載藥量僅為101.6μgADM/mgBMP，約為人工合成鐵氧體磁性納米顆粒的1.8倍。
表一、不同濃度比條件下生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量數據

其中CADM、CBMP各表示阿霉素、生物納米磁小體投料后在混合體系中的濃度，CADM/CBMP為阿霉素與生物納米磁小體的濃度比，以下各表同。
實施例2直接偶聯分步法制生物磁小體載阿霉素實驗步驟向磁小體懸浮液中加入偶聯劑，混勻，攪拌或間斷地脈沖超聲反應0.5-24小時，反應產物用磁鐵吸出，洗滌數次，去除未反應的偶聯劑，然后再用磁鐵吸附。將阿霉素溶液與上述經偶聯劑修飾后的磁小體混合，攪拌或反復間斷地脈沖超聲，反應0.5-24小時，反應產物用磁鐵吸附，去除未反應的抗癌化學藥物，純水或磷酸緩沖溶液洗滌數次后，再用磁鐵吸出磁小體，得產品。
實驗結果從表二結果可以看出(1)采用直接偶聯分步法，生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量較高，本實驗中用戊二醛做偶聯劑可達536.4μgADM/mgBMP，通常人工合成鐵氧體磁性納米顆粒中阿霉素的含量高近10倍。
直接偶聯分步法載藥量大小與兩者的濃度及濃度比例有關，隨CAMS/CBMP的值的增大，BMP的單位載藥量相應增加。但與直接吸附法相比，直接偶聯分步法載藥量相對較穩定，變化沒有直接物理吸附法的顯著。
(2)與直接吸附法不同，直接偶聯分步法的載藥量與BMP的絕對濃度關系沒有直接關系。BMP濃度升高40倍時其單位載藥量單位載藥量變化不明顯。
(3)不同偶聯劑對載藥量影響很大。采用戊二醛和丁二酸作為偶聯劑時BMP的載藥量大于采用DSC作為偶聯劑時的載藥量。
表二、采用直接偶聯分步法不同條件下生物納米磁小體(BMP)阿霉素(ADM)載藥量數據

實施例3直接偶聯一步法制生物磁小體載阿霉素實驗步驟將生物納米磁小體懸浮液與偶聯劑水溶液和抗癌化學藥物的溶液混合，攪拌或間斷地脈沖超聲下反應0.5-24小時，用磁鐵吸附反應產物，去除未反應的反應物。純水或磷酸緩沖溶液洗滌數次后，再用磁鐵吸出磁小體，得產品。
實驗結果
表三、采用直接偶聯一步法不同條件下生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(ADM)載藥量數據

以上結果表明(1)用直接偶聯一步法，生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量高，本實驗中可達1201μgADM/mgBMP，比通常人工合成鐵氧體磁性納米顆粒載阿霉素的量高出20倍以上。
(2)采用直接偶聯一步法BMP載阿霉素藥量穩定，戊二醛濃度變化對載藥量有一定影響。適當增加戊二醛濃度可以提高載藥量。
(3)直接偶聯一步法中，不同偶聯劑對載藥量影響很大。本實驗中采用戊二醛作為偶聯劑時BMP的載藥量大于采用丁二酸和DSC作為偶聯劑時的載藥量。
實施例4高碘酸鈉氧化法制生物納米磁小體載阿霉素實驗步驟生物納米磁小體粒的懸浮液中，加入氧化劑高碘酸鈉，攪拌或間斷地脈沖超聲下反應0.5-24小時；用磁鐵吸出磁小體，用純水或緩沖溶液洗滌數次，去除未反應的氧化劑。將氧化后的磁小體與抗癌化學藥物溶液混合，攪拌或間斷地脈沖超聲下反應0.5-24小時，反應物用磁鐵吸附去除未反應的抗癌化學藥物；用純水或磷酸緩沖溶液洗滌數次后，再用磁鐵吸出磁小體，得產品。
實驗結果表四、采用高碘酸鈉氧化法不同條件下生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(ADM)載藥量數據

以上結果表明采用高碘酸鈉法，生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量本實驗中可達465.6μgADM/mgBMP，比通常人工合成鐵氧體磁性納米顆粒載阿霉素的量高8倍。同時，NaIO4濃度對載藥量有影響，在NaIO4濃度為0.0175左右，BMP對ADM的載藥量最大。
實施例5異型雙功能偶聯劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(下稱SPDP)法制生物納米磁小體載阿霉素實驗步驟生物納米磁小體用磷酸緩沖溶液懸浮，迅速溶入異型雙功能偶聯劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的，攪拌或脈沖超聲下反應0.5-24小時，用磁鐵吸出磁小體，去除未反應的偶聯劑和副產物。用磷酸緩沖溶液洗滌數次后，向SPDP處理后的磁小體懸浮液中加入固體二硫蘇糖醇，攪拌，脈沖超聲下反應0.5-24小時，用磁鐵吸出磁小體，用緩沖溶液洗滌數次；抗癌化學藥物與3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應后再加入固體二硫蘇糖醇反應；將上述的處理的磁小體和抗癌化學藥物的純水或緩沖溶液混合，攪拌或反復脈沖超聲反應0.5-24小時，用磁鐵吸出磁小體，用純水或緩沖溶液進行洗滌，用磁鐵吸出磁小體，得產品。
實驗結果
表五、采用SPDP不同條件下生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(ADM)載藥量數據

由表五的結果可知，采用SPDP法，生物納米磁小體(BMP)對阿霉素(AMS)載藥量穩定，本實驗中達297.4μgADM/mgBMP，比通常人工合成鐵氧體磁性納米顆粒載阿霉素的量高出5倍以上。
實施例6生物納米磁小體載藥穩定性實驗實驗步驟分別將實施例1-5制得的生物納米磁小體載阿霉素藥物粒子，加入0.8％生理鹽水溶液，混勻后超聲10min，用磁鐵將磁小體吸附在容器底部，取上清液用光譜儀測紫外光譜。
實驗結果表六.不同載藥方法對生物納米磁小體載阿霉素穩定性的影響數據

表六中的上清液中游離阿霉素百分含量反映出磁小體的載藥穩定性，此值越低，則穩定性越高。載藥穩定性與偶聯劑的種類以及偶聯方法有關。實驗結果表明，采用戊二醛作為偶聯劑的直接偶聯一步法穩定性最高，與磁小體呈不穩定結合狀態的阿霉素比例僅0.26％。
藥物和納米磁小體結合的穩定性關系到靶向抗癌藥物的毒副性與釋藥速率，與磁小體呈不穩定結合狀態的阿霉素比例越小，進入全身循環的游離藥物也相應減少，靶向性效率更高。
實施例7生物納米磁小體對大鼠的安全性檢測用趨磁細菌內提取的高純度磁小體，通過舌下靜脈注射SD大鼠進行毒理實驗，結果為大鼠半數致死量為62.7mg/kg。從存活大鼠腹腔靜脈取血進行血液生化檢測，其血常規(24項)、心激酶與肝腎功能均未見異常。
對大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、腸和腎上腺進行普通病理切片檢查，同時取樣作電鏡超薄切片，觀察磁小體在臟器中的分布情況。在所給予劑量范圍內磁小體并未引起組織堵塞和梗死現象；僅在肝臟的肝細胞而非巨噬細胞內聚集，其它臟器中未發現有磁小體。
需要說明的是以上實施例僅用于說明本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.生物納米磁性靶向抗癌藥物，其特征是由生物納米磁小體與抗癌藥物通過物理吸附或化學偶聯劑偶聯而成，所說的生物納米磁小體是趨磁細菌細胞內形成的納米磁性顆粒，粒徑35-120nm，主要成分為Fe3O4或Fe3S4，單個磁顆粒有脂膜包被，所說的抗癌藥物包含化療藥物、核酸類藥物、放射性核素或抗體藥物。
2.一種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，其特征是將抗癌化學藥物和生物納米磁小體在純水或磷酸緩沖溶液中混合，攪拌或脈沖超聲下進行物理吸附；用磁鐵吸出磁小體，洗滌，得產品。
3.一種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，其特征是原料抗癌藥物及生物納米磁小體分別含有氨基，采用偶聯劑與生物納米磁小體及抗癌藥物反應，使磁小體及抗癌藥物所含的氨基與偶聯劑連接；磁小體、抗癌藥物及偶聯劑三者同時反應，一步偶聯得產品，或將該偶聯劑先與生物納米磁小體反應，然后再與抗癌藥物反應，分步偶聯得產品；所說的偶聯劑是含有如下至少兩個相同或不相同基團的化合物醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基。
4.根據權利要求3所述的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，其特征是所說的偶聯劑先與生物納米磁小體及聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖類聚合物一步或分步反應，使生物納米磁小體先與聚合物連接，再將連接了聚合物的生物納米磁小體與N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺反應，使聚合物上的羧基轉化為N-琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與原料抗癌藥物反應，得產品。
5.一種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，原料抗癌藥物含有氨基，生物納米磁小體含有鄰二醇基團，其特征是用氧化劑高碘酸鈉或高碘酸鉀與生物納米磁小體反應，將生物納米磁小體表面脂膜分子中的鄰二醇結構氧化為醛基，然后與抗癌藥物反應，得產品。
6.一種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，原料抗癌藥物和生物納米磁小體中的一方含有羧基，另一方含有氨基，其特征是以N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺與含羧基的一方反應，使羧基轉化為N-琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與含氨基的一方反應，得產品。
7.一種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，原料抗癌藥物含有巰基或二硫鍵，生物納米磁小體脂膜含有氨基，其特征是采用一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基，另一端含有二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的異型偶聯劑，將異型偶聯劑與生物納米磁小體反應，使磁小體連接二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基，然后由以下三個途徑之一得產品(1)將連接了二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的磁小體直接與含巰基的抗癌藥物反應；(2)將含二硫鍵的抗癌藥物與二硫蘇糖醇反應使二硫鍵轉化為巰基，再與連接了二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的磁小體反應；(3)連接了二硫鍵的磁小體與二硫蘇糖醇反應使二硫鍵轉化為巰基，然后與含二硫鍵的抗癌藥物反應。
8.-種權利要求1的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，生物納米磁小體脂膜和抗癌藥物分別含有氨基，其特征是將生物納米磁小體及抗癌藥物分別與異型偶聯劑反應，使磁小體及抗癌藥物分別連接二硫鍵或一方連接二硫鍵另一方連接N-琥珀酰亞胺基，再將其中連接二硫鍵的一方與二硫蘇糖醇反應而還原成巰基，然后與未還原的另一方反應，得產品；所說的異型偶聯劑是一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亞胺酯基、N-琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基或碳化二亞胺酯基，另一端含有二硫鍵或N-琥珀酰亞胺基的化合物。
9.根據權利要求8所述的生物納米磁性靶向抗癌藥物的制備方法，其特征是所說的異型偶聯劑與抗癌藥物或納米磁小體中的一方反應之前，先與聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖類聚合物反應，使偶聯劑與聚合物連接，再與N-羥基丁二酰亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺反應，使聚合物上的羧基轉化為N-琥珀酰亞胺酯基或碳化二亞胺酯基，然后與該方原料反應。
10.根據權利要求3或4或5或6或7或8或9所述的方法，其特征是各步反應均在純水或磷酸緩沖溶液中攪拌或間斷地脈沖超聲下進行，生物納米磁小體的每次反應后產物均用磁鐵吸出并純水或緩沖溶液洗滌。
全文摘要
本發明涉及一種生物納米磁性靶向抗癌藥物，由生物納米磁小體與抗癌化學藥物偶聯而成，生物納米磁小體是趨磁細菌細胞內形成的納米磁性顆粒，粒徑35－120nm，主要成分為Fe
文檔編號H01F1/032GK1927400SQ200610096409
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月25日 優先權日2006年9月25日
發明者唐喜慶 申請人:唐喜慶