副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型和方法

副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型和方法
【專利摘要】本發明公開了一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型和方法。所述預測模型通過Weibull方程表示為y(x)＝b*(xn)，尺度因子表示為b＝c×IL+d；副溶血性弧菌接種到對蝦上，對不同接種水平下的對蝦進行多次去殼實驗，獲得對蝦去殼前后的表面菌落總數和細菌的遷移數量并計算遷移率，將實驗數據輸入到預測模型中，獲得第一、第二線性模型參數及其形狀因子，采用構建獲得的預測模型對被測對蝦去殼過程進行預測，獲得去殼環節中的遷移率數據。本發明能準確、客觀、定量的反映對蝦中副溶血性弧菌在去殼加工環節所發生的交叉污染情況，為對蝦蝦仁的質量安全和產品衛生標準提供技術支持，在海產品加工管理，安全性評價以及風險預警、風險評估方面有廣闊的應用前景。
【專利說明】
副溶血性弧菌在對郵去亮環節交叉污染的預測模型和方法
技術領域
[0001] 本發明設及預測食品微生物學技術領域，具體地說，是一種副溶血性弧菌在對郵 去殼環節交叉污染的預測模型和方法。
【背景技術】
[0002] 副溶血性弧菌(V化rio par址aemolyticus)是海產品中廣泛存在的一種食源性致 病菌，我國已有多起由于食用污染了的致病性副溶血性弧菌的海產品而導致食物中毒的報 道。對郵郵仁在加工生產過程中，副溶血性弧菌會通過去殼操作釋放出來并通過手套進一 步向下遷移傳播。然而目前，國內外交叉污染遷移研究多集中于廚房加工烹煮環節的風險 研究。但在冷凍郵仁的生產加工中，不規范的操作會導致郵仁與操作人員手套發生交叉污 染，所W交叉污染是郵仁去殼加工中普遍存在的可引發細菌數量變化的重要環節。目前并 沒有探究工廠南美白對郵去殼加工環節副溶血性弧菌交叉污染細菌遷移情況的報道。因而 建立的交叉污染預測模型可W用來描述對郵去殼時副溶血性弧菌交叉污染遷移的數量規 律，為南美白對郵郵仁的質量安全和產品衛生標準提供技術支持，便于管理部口及時準確 的獲知食品的風險程度，制定行業及市場的監管政策，在海產品加工管理，安全性評價W及 風險預警、風險評估方面有廣闊的應用前景。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種副溶血性弧菌在對郵去殼環節 交叉污染的預測模型和方法。
[0004] 本發明采用的技術方案是：
[0005] -、一種副溶血性弧菌在對郵去殼環節交叉污染的預測模型：
[0006] 所述預測模型通過Weibull方程采用W下公式表示，采用We化Ull方程模擬不同接 種水平下的對郵中副溶血性弧菌遷移率隨對郵已去殼數量的變化：
[0007] y(x)=b*(x")
[000引其中，y(x)-副溶血性弧菌的遷移率（％)，b-尺度因子，n-形狀因子，X-對郵已 去殼加工的數量。
[0009] 上述公式作為一級模型。
[0010] 在上述公式擬合過程中，參數間的自相關性過高會降低二級模型的可靠性，為避 免Weibull模型中形狀因子與尺度因子的自相關性過高，利用整體數據擬合的方法，固定n 值，在最小二乘法的基礎上對所有數據進行We化Ull模型擬合(Global Fit)，得到各遷移曲 線尺度因子與形狀因子的參數估計結果。
[0011] 副溶血性弧菌在南美白對郵去殼加工環節交叉污染過程中，Weibull模型的形狀 因子與環境因素并沒有明顯的相關關系，但是尺度因子與對郵表面的初始接種水平有一定 的線性相關關系，因此上述線性擬合Weibull模型中的尺度因子b與對郵表面初始接種水平 IL存在定量關系，所述的尺度因子b采用W下公式表示：
[0012] b = cXIL+d
[OOK]其中，b-尺度因子，IL-對郵表面接種水平。C，d-第一、第二樂性模型參數。
[0014] 上述公式作為二級模型。
[0015] 當形狀因子n=l時，曲線呈直線，副溶血性弧菌的遷移率與對郵已去殼加工的數 量之間關系呈線性；
[0016] 當形狀因子n〉l時，曲線呈上凸狀，表示隨對郵已去殼數量的增加，副溶血性弧菌 的遷移率逐漸增加；
[0017] 當形狀因子n<l時，曲線呈凹狀，表示隨對郵已去殼數量的增加，副溶血性弧菌的 遷移率逐漸放緩。
[0018] 二、一種副溶血性弧菌在對郵去殼環節交叉污染的預測模型的構建方法，包括W 下步驟：
[0019] A)利用副溶血性弧菌菌株接種到對郵上，對不同接種水平下的對郵進行多次連續 去殼實驗，獲得對郵去殼前、后的表面菌落總數，進而獲得細菌的遷移數量并采用W下公式 計算遷移率；
[0020]
[0021] B)將所有連續去殼實驗中的對郵已去殼加工數量與其對應的遷移率和對郵表面 接種水平輸入到所述預測模型中，獲得第一線性模型參數C、第二線性模型參數d及其形狀 因子n，從而完成預測模型的構建。
[0022] 每次所述去殼實驗中，將副溶血性弧菌接種至其中一個對郵上作為污染源，然后 進行去殼。
[0023] 所述的副溶血性弧菌接種采用W下方式:將對郵浸泡于副溶血性弧菌菌液30min 后取出置于無菌稱量盤上，再置于生物安全柜中靜置30minW確保菌液接種至郵表面。
[0024] =、一種副溶血性弧菌在對郵去殼環節交叉污染的預測方法，包括W下步驟：
[0025] 1)構建預測模型，通過Weibull方程采用W下公式表示：
[0026] y(x)=b*(x")
[0027] 其中，y(x)-副溶血性弧菌的遷移率（％ )，b-尺度因子，n-形狀因子，X-對郵已 去殼加工的數量。
[0028] 所述的尺度因子b采用W下公式表示：
[0029] b = cXIL+d
[0030] 其中，b-尺度因子，IL 一對郵表面接種水平。c，d-第一、第二線性模型參數。
[0031] 2)利用副溶血性弧菌菌株接種到對郵上，對不同接種水平下的對郵進行多次連續 去殼實驗，獲得對郵去殼前、后的表面菌落總數，進而獲得細菌的遷移數量并采用W下公式 計算遷移率；
[0032]
[0033] 3)將所有連續去殼實驗中的對郵已去殼加工數量與其對應的遷移率和對郵表面 接種水平輸入到所述預測模型中，獲得第一線性模型參數C、第二線性模型參數d及其形狀 因子n;
[0034] 4)利用步驟3獲得的模型對被測對郵去殼過程進行預測，獲得去殼環節中的遷移 率數據，完成對對郵去殼環節交叉污染的預測。
[0035] 本發明將一級模型與二級模型相結合，來預測步驟b)所述的不同初始接種水平下 對郵去殼環節交叉污染的遷移率。并在實施例通過與實際測量值進行比較，W評價所述預 測模型的準確性。
[0036] 本發明的有益效果是：
[0037] 本發明模型能準確、客觀、定量地反映副溶血性弧菌在南美白對郵中的遷移情況， 為對郵郵仁的品質控制和安全食用對郵提供了技術支持。
[0038] 同時本發明交叉污染預測模型可便于管理部口及時準確地獲知食品風險程度，審U 定行業及市場的監管政策，利于正確指導生產者進行安全生產，在食品工業的安全性評價、 品質控制與管理W及風險預警、風險評估方面有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0039] 圖1為實施例副溶血性弧菌在南美白對郵去殼的細菌遷移情況的曲線圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0041] 本發明的實施例如下：
[0042] 1.材料與方法
[0043] 1.1試驗菌株與原材料
[0044] 副溶血性弧菌，于-80°C ,25%甘油保存。
[0045] 采用南美白對郵，購置于超市，冰鮮運至實驗室，分裝于自封袋中，-20°C冰箱膽存 備用。
[0046] 1.2試驗藥品、耗材與設備
[0047] 含有3%氯化鋼的膜蛋白腺大豆肉湯(TSB)、硫巧膽薦瓊脂培養基(TCBS)、含有3% 氯化鋼的緩沖蛋白腺水(BPW)均購于美國BD公司。
[0048] 帶濾膜的均質袋購置于杭州大微生物公司。
[0049] 實驗中使用的主要儀器設備為：拍打式均質機（型號400，Seward，倫敦，英國）；螺 旋接種儀（型號WASP2, Don Whitley Scientific,希普利，英國）；全自動菌落計數儀 (Synbiosis,劍橋，英國）；高壓滅菌鍋（日本S洋）；電子天平(梅特勒公司）;MiIli-Q超純水 純化系統(美國Mi 11 ipore公司）；定量移液器(德國化pendorf公司）；高精度低溫培養箱（日 本=洋）。
[0化0] 1.3試驗方法
[0化1] 1.3.1細菌培養及接種
[0052]實驗菌株解凍后分別接種至含有3%化Cl的TSB液體培養基中，于37°C下過夜培養 12h，然后轉接至3%化Cl的TSB液體培養基中進行傳代培養化，使得菌液濃度達到Slog CFU/ml，利用TSB液體培養基進行梯度稀釋至71og CFU/ml和61og CFU/ml的副溶血性弧菌 液，W此作為副溶血性弧菌的初始接種液用于不同南美白對郵初始接種水平的去殼遷移研 究。
[0053] 新鮮活郵購置于超市，去頭修剪處理后儲存于-20°C冰箱內。凍郵在實驗前一天轉 移至4°C環境下解凍，解凍后在75%酒精中浸泡2minW殺滅對郵表面微生物，取出后用無菌 水反復沖洗，直至無酒精味后置于無菌稱量盤中備用。
[0054] 菌株的接種:將上述菌液倒入燒杯中，將郵浸泡30min后取出置于無菌稱量盤上， 于生物安全柜中靜置30minW確保菌液接種至郵表面。采用6,7,81og C即/ml的初始菌液接 種到郵表面的濃度分別為5，6，71og CFU/g。
[0055] 1.3.2南美白對郵連續去殼試驗及副溶血性弧菌遷移數量的測定
[0056] 每一組接種水平下選擇15只郵為一組，選擇兩只無菌郵進行接種，其中一只用于 測定初始接種在對郵表面的菌量，另一只作為交叉污染發生的污染源，其余13只郵均為待 去殼的無菌郵，開始依次連續對郵進行去殼，整個去殼過程中不更換手套，觀察細菌從第1 只接種郵連續遷移到第14只對郵的數量變化情況。
[0057] 去殼后的每一只郵仁分開放置到含有25ml含有3%化Cl的緩沖蛋白腺水的無菌均 質袋中，將均質袋放入均質機中WImin，250巧m的條件進行拍打。
[005引取Iml均質液于離屯、管中，依次梯度稀釋后吸取50山通過螺旋接種儀自動鋪盤，每 一個樣本做兩個平行，即取兩份分別到螺旋接種儀上進行檢測獲其平均值。
[0059] 鋪盤結束后，放置于37°C培養箱中培養8到IOh后，用全自動菌落計數儀計數。
[0060] 2 結果
[0061] 2.1副溶血性弧菌在南美白對郵去殼環節中細菌的遷移曲線
[0062] 副溶血性弧菌在南美白對郵去殼環節中細菌的遷移曲線如圖1所示。從圖上可W 看出，細菌遷移程度呈現兩個可區分的趨勢，剛開始遷移呈現快速下降的遞減趨勢，隨后遷 移速率放緩呈現拖尾的曲線走向。同一接種水平下，隨著去殼數量的增加，細菌遷移率隨之 降低。不同接種水平下，隨著對郵初始污染水平的降低，副溶血性弧菌遷移率隨之增大。
[0063] 表 1
[0064]
LUU65」 巧巧甲，INU巧不極測限W h的江巧效但。 1 2.2-級模型
[
[0067]表 2 [006引
[
[0071] 表格中，b VS na表示兩個參數間的相關性。
[0072] 其中，通過對遷移率數據進行We化Ull模型擬合，分別對各因素組合下的細菌遷移 曲線進行Weibull模型擬合所得到的模型相關系數R2較高，然而，各組模型參數b及n間的自 相關系數也較高，表示兩個模型參數相對獨立性較低，可能引起參數估計值的非獨立性同 時，無法利用現有的數學模型進行數據擬合。因此，本研究采用W全部數據為整體的參數估 計模型擬合方法，固定We化Ul 1方程中的形狀因子，一方面減小n值的置信區間，一方面降低 Weibull模型中的二參數間的自相關性。利用整體數據擬合的方法，固定n值，再對各遷移曲 線尺度因子進行估計，雖然部分We化Ull模型的相關系數有所減小，但二參數間的自相關性 明顯減低，估計值更加準確。此外，二參數的置信區間的減小，表明第二種模型擬合方法對 參數值的估計更加精確。因此，在本研究中采取W全部數據為整體的參數估計模型擬合方 法進行細菌遷移曲線擬合，并在此基礎上對模型尺度因子b建立二級預測模型。
[007；3]表 4
[0074]
123 其中，參數b與參數n為利用整體數據擬合的方法，固定n值，在最小二乘法的基礎 上對所有數據進行Weibull模型擬合的結果，W此結果用于二級模型的線性擬合。 2 2.3 二級模型 3 用We化Ull模型擬合對郵初始污染水平對副溶血性弧菌在南美白對郵去殼加工環 節交叉污染細菌遷移的影響，方程為：
[007引 b = -0.03IL+0.26
[0079] 2.4模型的驗證
[0080] 實施例將所建立的一級模型與二級模型相結合，來預測=種初始污染水平下，交 叉污染遷移至南美白對郵中副溶血性弧菌菌數，并與實際測量值進行比較，W評價模型的 準確性。
[0081] 具體是采用預測標準誤差作為本模型的驗證指標。預測標準誤差（Standard error Of prediction)SEP是指預測模型預測值和實驗觀測值差異的標準偏差，用W衡量 和驗證預測模型的準確度。SEP越小，說明預測模型能夠更好的描述實驗數據。實施例的SEP 的表達式和結果如下：
[0082]
[0083] 其中，X-模型預測的細菌遷移率，y-實際測量的細菌遷移率，否一實際測量所得 的遷移率的平均值，n-對郵去殼的數量。
[0084] 研究證明，SEP值可允許的范圍在0.00-35%，當SEP達到最大值35%時，誤差可W 達到0.51〇的〇,在可允許的誤差范圍內，實施例結果是SEP = 25%表示模型預測的效果良好， 由此可見，本實施例通過模型驗證證實了本發明模型能準確、客觀、定量的反映南美白對郵 中副溶血性弧菌在去殼加工環節所發生的交叉污染情況。
[0085] W上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明方法的前提下，還可W做出若干改進和補充，運些改進和補充也應視為 本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型，其特征在于:所述預測模 型通過Weibull方程采用以下公式表示： y(x) = b*(xn) 其中，y(x)-副溶血性弧菌的迀移率（％ )，b-尺度因子，η-形狀因子，X-對蝦已去殼 加工的數量。2. 根據權利要求1所述的一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型，其 特征在于:所述的尺度因子b采用以下公式表示： b = c X IL+d 其中，b-尺度因子，IL 一對蝦表面接種水平，c，d-第一、第二線性模型參數。3. 根據權利要求1所述的一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型，其 特征在于： 當形狀因子n = 1時，副溶血性弧菌的迀移率與對蝦已去殼加工的數量之間關系呈線 性； 當形狀因子η>1時，隨對蝦已去殼數量的增加，副溶血性弧菌的迀移率逐漸增加； 當形狀因子n〈l時，隨對蝦已去殼數量的增加，副溶血性弧菌的迀移率逐漸放緩。4. 一種如權利要求1~3任一所述的副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模 型的構建方法，其特征在于包括以下步驟： A) 利用副溶血性弧菌菌株接種到對蝦上，對不同接種水平下的對蝦進行多次連續去殼 實驗，獲得對蝦去殼前、后的表面菌落總數，進而獲得細菌的迀移數量并采用以下公式計算 迀移率； my 被污染物體表面的菌落總數imw 伽十祝染響_爾總數(哪）XlQQ% B) 將所有連續去殼實驗中的對蝦已去殼加工數量與其對應的迀移率和對蝦表面接種 水平輸入到所述預測模型中，獲得第一線性模型參數c、第二線性模型參數d及其形狀因子 n，從而完成預測模型的構建。5. 根據權利要求4所述的一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型的構 建方法，其特征在于:每次所述去殼實驗中，將副溶血性弧菌接種至其中一個對蝦上作為污 染源，然后進行去殼。6. 根據權利要求4或5所述的一種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測模型 的構建方法，其特征在于:所述的副溶血性弧菌接種采用以下方式:將對蝦浸泡于副溶血性 弧菌菌液30min后取出置于無菌稱量盤上，再置于生物安全柜中靜置30min以確保菌液接種 至蝦表面。7. -種副溶血性弧菌在對蝦去殼環節交叉污染的預測方法，其特征在于包括以下步 驟:采用權利要求1~3任一所述預測模型，通過權利要求4所述方法獲得預測模型的第一線 性模型參數c、第二線性模型參數d及其形狀因子n，對被測對蝦去殼過程進行預測，獲得去 殼環節中的迀移率數據。
【文檔編號】G06Q10/06GK106022516SQ201610326696
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】李延斌, 肖興寧, 汪雯, 方維煥, 傅迎春
【申請人】浙江大學