一種人周圍神經三維結構的重建方法
【專利摘要】本發明公開了一種人周圍神經三維結構的重建方法，包括以下步驟：化學萃取人周圍神經；冷凍干燥萃取后的周圍神經；利用MicroCT掃描冷凍干燥后的周圍神經；人周圍神經的三維重建。該方法使人周圍神經能用CT掃描成像，并重建周圍神經的三維結構，具有良好效果。
【專利說明】
一種人周圍神經三維結構的重建方法
技術領域
[0001]本發明涉及組織工程技術領域，具體地說，涉及一種人周圍神經三維結構的重建方法及其三維打印技術工藝。
【背景技術】
[0002]理論上，去細胞神經具有與天然神經一致的從微觀到宏觀的三維結構，可為再生神經提供最理想的通道。以此為模板建立去細胞神經的數字化模型，是實現組織工程神經結構仿生的關鍵環節。目前，在軟組織三維結構虛擬重建方面的研究方法主要包括用影像學的方法獲取圖像和計算機輔助設計(computer aided design，CAD)生成組織三維圖像模型。
[0003]影像學三維重建需要的技術主要包括計算機斷層掃描(computedtomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和光學顯微鏡成像。將這些技術所獲取的連續二維圖像一層層疊合起來，形成實體的立體圖像。CT或yCT(micr0CT)成像的優點在于成像的分辨率很高，尤其是yCT，其獲取的圖像可以分辨組織巨微結構(ΙΟμπι以內)甚至可以用于分析組織支架的機械性能，進而幫助改進支架巨微結構的設計和制造。其缺點在于具有電離輻射，不能區分具有相同密度的軟組織。MRI的分辨率沒有CT和光學顯微鏡高，曝光時間也相對較長。但是利用yMRI(microMRI)也成功重建出質量很高的三維圖像。Dhenain等利用場強為11.7T的yMRI掃描小鼠胚胎，其體素值為20-80μπι，能用圖像分割算法分割胚胎主要的發育器官掃描圖像。Cecchini及其同事也利用場強為4.7Τ(體素值為137Χ273 X 273ym3)的MRI掃描大鼠的唾液腺，重建出了能夠區分腺管的腺體三維圖像，并成功用3D打印機打印出其樹脂模型。在圖像拼接軟件的幫助下，基于連續組織切片的光學顯微鏡成像得以用于組織的三維重建。由于光學顯微鏡的視野有限，所以要想得到一張高分辨率的二維圖像，必須對一張組織切片分視野成像，然后利用圖像拼接軟件將同一張組織切片圖像的不同部分拼接起來。雖然耗時耗力，但是光學顯微鏡成像具有CT和MRI不可比擬的區分不同組織的能力。原因很簡單，它的圖像能區分單個細胞，很容易分辨巨微結構，為精確的圖像分割提供了可能。在光學顯微鏡成像周圍神經三維重建方面，戚劍等做了大量富有成效的工作。
[0004]基于連續二維圖像的三維模型儲存形式是由體素值組成的體積模型，體素值在體積模型里就如一塊一塊磚，每塊磚都有一定的長寬高。因此，這些“磚”組成的體積模型表面比較粗糙，有很多直角，甚至有開口的地方。利用CAD軟件就能“磨平”這些“直角”，“關閉”存在的“開口”，使三維模型表面變得更光滑平整，更適于3D打印。CAD還能在原來三維模型的基礎上對模型進行其它設計。Lee等用CT掃描出上頌髁的二維圖像，三維重建后將數據導入CAD軟件solidworks，在原來三維圖形的基礎上設計了均勻分布的網眼，然后打印出其明膠支架。不僅如此，CAD最重要是設計支架的三維模型。比如，whatley等用CAD設計軟件Microsoft Visual Bas i c設計出了人工椎間盤三維模型。Cho及其同事用CATIA V5(Dassault Systemes)軟件設計出了更復雜的人工耳支架模型，對人工耳里層的骨架部分和表面部分進行不同的設計，使之更復合人體解剖學原理。目前世界范圍內重建的水平也僅停留在神經束水平(10微米以上)，對神經內膜管的重建由于技術限制未能有突破。
[0005]隨著3D打印技術和組織工程技術的興起，讓打印人體組織的大膽設想越來越現實，打印周圍神經，不僅是對周圍神經缺損修復的巨大貢獻，對于3D打印器官也有巨大的啟發和推動作用，而3D打印器官，比如打印人體軟組織最關鍵也是最基礎的一環是對軟組織的巨微結構的三維重建，對重建的精度和保真度都有很高要求。印出復合患者身體特定解剖結構的組織工程支架。
[000?]周圍神經三維重建可有以下幾種方式:計算機斷層掃描(computed tomography,CT)后重建、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)重建和光學顯微鏡成像重建，光學顯微鏡成像雖然精度高，但是無法保證連續圖片的對齊，已有不少研究，但是都無法完整重建神經內膜管。核磁共振成像精度不夠，即使是目前精度最高的核磁共振技術也無法重建神經內膜管。近年來，隨著Micro CT的出現，對重建人體微細結構有極大幫助，但是眾所周知，CT只能對人體密度較高的硬組織成像，比如骨骼，對人體軟組織比如神經無法成像。
[0007]目前，國際和國內范圍內的周圍神經解剖結構的三維重建大多采用切片染色-光學顯微鏡成像-連續斷層圖像層疊重建的方法。但是該方法重建的周圍神經三維結構精度不能達到巨微級(ΙΟμπι以內)，不能有效重建神經內膜管。而且該方法重建的連續的周圍神經束(更不用說神經內膜管)，即連續斷層圖像不能有效對齊導致整段周圍神經三維模型不連續。
【發明內容】
[0008]為了克服現有技術中存在的缺陷，提高人周圍神經3D打印的可操作性，本發明提出了一種人周圍神經三維結構的重建方法及基于該重建方法的3D打印方法，使得能夠體外獲得可用于醫療領域的人周圍神經。
[0009]本發明提供的人周圍神經三維結構的重建方法包括以下步驟:
[0010]第一步:化學萃取人周圍神經；
[0011]第二步:冷凍干燥萃取后的人周圍神經；
[0012]第三步:利用MicroCT掃描冷凍干燥后的人周圍神經，對以下掃描參數進行設置:
[0013]能量/電流強度，平均數據，樣本值，投射/180°。
[0014]進一步地，所述掃描參數還包括:掃描視野，過濾值，校正值，積分時間，視野直徑，體素大小。
[0015]本發明還提供一種人周圍神經3D打印的方法，該方法包括上述人周圍神經三維結構的重建方法。
[0016]本發明的人周圍神經三維結構的重建方法的有益效果為:
[0017]1、本發明采用Micro CT掃描人周圍神經樣本，使精度達到了重建神經內膜管的要求，連續斷層圖像在重建時自動對齊，同時解決了目前在周圍神經三維重建時精度不夠和三維模型連續性欠佳的問題。
[0018]2、在CT的臨床應用中，CT只能對人體密度較高的硬組織成像，比如骨骼，而對人體軟組織比如神經無法成像。現有技術中還沒有利用CT對人體軟組織成像的報導。本發明對周圍神經樣本進行冷凍干燥，在充分保持人體軟組織原始結構的同時使之適于CT掃描，解決了軟組織重建不能采用CT掃描的問題。并且本發明提出了兩種Micro CT掃描人周圍神經樣本的參數設置，使周圍神經可以在不同精度下重建。
[0019]3.為研發療效更好、適應癥更廣的優質臨床周圍神經缺損修復材料奠定理論基礎，解決現存神經修復材料不足的問題。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明的人周圍神經三維重建的流程圖；
[0021]圖2A和2B為根據本發明實施例的人周圍神經microCT掃描后的斷層圖像，其中，圖2A為MicroCT掃描神經橫斷面圖像，其清晰顯示了整個神經橫斷面和神經束(分辨率3μπι，物理尺寸7.79mm X 6.92mm)，圖2B為MicroCT掃描神經橫斷面圖像，其清晰顯示了神經束和神經內膜管(分辨率1.2μηι，物理尺寸1.86mm X 1.44mm)；
[0022]圖3A和3B為根據本發明實施例重建的周圍神經三維模型，其中圖3A為短段周圍神經三維重建后的三維數字模型(分辨率3μ??，物理尺寸7.79mmX 6.92mm X 2.72mm)，圖3B為短段周圍神經三維重建后的三維數字模型切面圖(分辨率1.2μπι，物理尺寸1.86mmX 1.44mmX1.09mm)ο
【具體實施方式】
[0023]為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0024]本發明實施例提供一種人周圍神經三維結構的重建方法，包括以下步驟:
[0025]第一步:化學萃取人周圍神經；
[0026]第二步:冷凍干燥萃取后的人周圍神經；
[0027]第三步:利用MicroCT掃描冷凍干燥后的人周圍神經，其中設置掃描參數如下:
[0028]掃描視野為9mm
[0029]能量/電流強度:551^，1(^厶，6￥
[0030]過濾:0.1mmAl
[0031]校正:55kVp，0.1_Al ,BH:有機玻璃(PMMA板)
[0032]積分時間:1500ms
[0033]平均數據:3
[0034]視野直徑:10.2mm
[0035]體素大小:3μπι
[0036]樣本:3400
[0037]投射/180。:1500。
[0038]也可以進行第二次掃描，其中第二次掃描參數如下:
[0039]掃描視野設置為4mm
[0040]能量/電流強度:551^?，7244，砑[0041 ]過濾:0.1mm Al
[0042]校正:55kVp，0.1_Al ,BH:有機玻璃(PMMA板)
[0043]積分時間:1500ms
[0044]平均數據:3
[0045]視野直徑:4.0mm
[0046]體素大小:1.2μηι
[0047]樣本:3400
[0048]投射/180。:1500。
[0049]根據本發明的實施例，第一步的化學萃取人周圍神經的目的是:去除人周圍神經中的細胞成分，保留其基本的神經基膜管結構及相關基質成分。
[0050]該化學萃取人周圍神經的步驟包括以下操作:去除神經周圍的脂肪與結締組織，切段，將該神經組織置于滅菌注射用水中靜置7h，將該神經組織浸泡于3%的Triton-x-100(曲拉通X-100)溶液中，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌，然后將神經組織放入4%脫氧膽酸鈉溶液中振蕩，用4%多聚甲醛儲存神經，4°C冷凍箱中保存待用。
[0051 ]根據本發明實施例，第二步的冷凍干燥操作的目的是:去除去細胞神經中的水分，并最大限度的保留其完整結構。
[0052]該冷凍干燥的具體步驟為:將多聚甲醛固定的人去細胞周圍神經放在冷凍干燥機里，在負20度的條件下干燥72小時，放在密封干燥的容器里儲存備用。
[0053]第三步的利用MicroCT掃描冷凍干燥后的人去細胞周圍神經是用于得到去細胞周圍神經的連續斷層掃描圖像。
[0054]本發明實施例還提供一種人周圍神經3D打印方法，該打印方法包括人周圍神經三維結構的重建方法。
[0055]以下通過具體實施例對本發明的三維結構重建方法進行詳細描述。
[0056]實施例1
[0057]圖1顯示了本發明的人周圍神經三維重建的流程圖，具體操作如下:
[0058]獲取人周圍神經，顯微鏡下去除神經周圍的脂肪與結締組織，切成小段。室溫下將該神經組織置于滅菌注射用水中靜置7h。無菌操作下除去滅菌注射用水，將神經組織浸泡于5001111，3%的1^如111-100(曲拉通乂-100)溶液中，常溫下搖蕩2411(中等速度，130?140g/min)。無菌操作臺中去除Triton液，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌震蕩3次，去舊充新，震蕩1min/次。將洗滌后的神經組織放入4%脫氧膽酸鈉溶液中振蕩24h。無菌操作臺中去除4 %脫氧膽酸鈉溶液，用PBS緩沖液洗滌震蕩3次，去舊充新，震蕩1min/次。無菌操作臺中用PBS洗滌震蕩6次，I Omin/次。用4 %多聚甲醛儲存神經，4 °C冷凍箱中保存待用。
[0059]使用瑞典SCANCO MEDICAL公司的yCT50掃描神經樣本，CT設置掃描參數如下:
[0060]1、將Micro CT掃描視野設置為9mm[0061 ] 能量/電流強度:551^，1(^六，6￥
[0062]過濾:0.1mmAl
[0063]校正:55kVp，0.1_Al ,BH:有機玻璃(PMMA板)
[0064]積分時間:1500ms
[0065]平均數據:3
[0066]視野直徑:10.2mm
[0067]體素大小:3μπι
[0068]樣本:3400
[0069]投射/180。:1500
[0070]2、將Micro CT掃描視野設置為4mm
[0071]能量/電流強度:551^?，7244，砑
[0072]過濾:0.1mmAl
[0073]校正:55kVp，0.1_Al ,BH:有機玻璃(PMMA板)
[0074]積分時間:1500ms
[0075]平均數據:3
[0076]視野直徑:4.0mm
[0077]體素大小:1.2μπι
[0078]樣本:3400
[0079]投射/180。:1500。
[0080]圖2A和2B顯示了掃描后得到的DCM格式的神經連續斷層掃描圖像。
[0081 ] 利用SCANCO MEDICAL公司的與yCT50配套的掃描圖像處理軟件重建連續的DCM格式的神經連續斷層掃描圖像，重建后的結果如圖3A和圖3B所示。
[0082]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，本發明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.一種人周圍神經三維結構的重建方法，包括以下步驟: 第一步:化學萃取人周圍神經； 第二步:冷凍干燥萃取后的人周圍神經； 第三步:利用Micro CT掃描冷凍干燥后的人周圍神經，掃描過程中對以下參數進行控制:能量/電流強度，平均數據，樣本值，投射/180°。2.根據權利要求1所述的重建方法，其特征在于，所述第三步中所述參數還包括:掃描視野，過濾值，校正值，積分時間，視野直徑，體素大小。3.根據權利要求1所述的重建方法，其特征在于，所述第三步中參數設置為: 能量/電流強度:55kVp，109μA，6W， 平均數據:3， 樣本值:3400， 投射/180°:1500。4.根據權利要求2所述的重建方法，其特征在于，所述第三步中參數設置為 掃描視野為9mm， 過濾值:0.1mm Al， 校正值:55kVp，0.1mm Al， 積分時間:1500ms， 視野直徑:10.2mm， 體素大小:3μηι。5.根據權利要求1所述的重建方法，其特征在于，所述第一步的化學萃取人周圍神經包括以下步驟:去除神經周圍的脂肪與結締組織，將所述神經浸泡于Triton-x-100溶液中，將所述神經放入脫氧膽酸鈉溶液中振蕩，用多聚甲醛儲存所述神經。6.根據權利要求1所述的重建方法，其特征在于，所述第二步的操作包括:將所述神經于負20度冷凍干燥。7.—種人周圍神經三維結構的3D打印工藝，包括根據權利要求1所述的人周圍神經三維結構的重建方法。
【文檔編號】G06T17/00GK105913490SQ201610279150
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】戚劍, 劉小林, 朱爽, 簡裕濤, 劉江輝, 朱慶棠
【申請人】中山大學附屬第醫院, 中山大學附屬第一醫院