一種人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法

一種人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法，包括以下步驟：（1）采集人脂肪組織；（2）獲取和分離人脂肪干細胞；（3）干細胞培養；（4）檢測、凍存；（5）建庫。本發明采用D-Hanks平衡鹽液配制的含有Ⅰ型和Ⅵ型膠原酶的混合膠原酶對脂肪組織進行消化，使得組織消化的更徹底，明顯降低雜細胞數量和除去組織塊；用含有10-15%胎牛血清、103-105U/mlLIF的MCDB-201培養液對分離后的干細胞進行培養，細胞增殖快、形態好，能有效抑制干細胞的分化，保證原代干細胞的特性，同時還能促進人脂肪干細胞的長期生長，以及保持自我更新及多向分化潛能等特點；將得到的干細胞建庫保存，保證了更為優質的種子細胞來源。
【專利說明】一種人脂肪干細胞的分罔培養方法和干細胞庫的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及人脂肪干細胞的分離培養方法及其干細胞庫的構建方法，屬于醫學和生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]干 細胞研究是近年來醫學和生物學領域中最引人注目的熱點之一。干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。通過研究他們的分化潛能，擴增能力，分化后的細胞功能以及取材是否安全方便等問題，選擇最合適的干細胞源來進行組織細胞再生修復。人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年來從人體脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發現脂肪干細胞在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞、神經細胞等，同時具有較低的免疫原性和免疫調節功能，移植同種異基因ADSCs將不會引起強烈的免疫反應和后期的排斥反應，為ADSCs的同源異體移植提供了有利條件。此外，ADSCs來源廣泛，可以通過脂肪抽吸術或脂肪切除術從任何人體內獲得，安全無痛苦，且在體外培養穩定，擴增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成為目前研究的新熱點，不論在再生醫學還是基因治療方面都具有重大的應用潛力。
[0003]人們通過美容、肥胖過度或其他原因進行的吸脂手術或脂肪切除術，不僅能夠將手術后廢棄的脂肪組織通過提取分離獲取所需的脂肪干細胞，達到治療各種疾病的目的，還能通過吸脂或脂肪切除達到減肥的效果。
[0004]中國專利ZL201010120944.4公開了一種“人脂肪成體干細胞的獲取方法及該干細胞庫的構建方法”，方便了人們有效儲存和使用脂肪干細胞資源，該專利中采用I型膠原酶對脂肪組織進行消化，消化產物濾網過濾去除未消化組織塊，離心后用DMEM完全培養液重懸細胞，最后接種到細胞培養瓶中培養，4-5天后換新鮮培養液，待細胞長滿后消化傳代；中國專利申請CN201210018269.3針對現有的細胞分離方法作了進一步的改進，采用I型、II型和IV型的混合膠原酶進行消化，該方法雖然使得消化效果有所提高，但不能夠完全去除組織塊和大量雜細胞；另外將細胞接種至培養瓶中培養時，使用的培養液保存不太穩定，細胞增殖較低，有一定分化，導致凍存的干細胞庫中細胞的純度仍受影響。
[0005]為克服上述技術的不足，我們在實際操作中更進一步的改進和優化了脂肪干細胞的分離培養方法，使得組織消化的更徹底，明顯降低雜細胞數量和除去組織塊，采用的培養基具有細胞增殖快、形態好，有效抑制干細胞的分化，保證原代干細胞的特性，同時還能促進人脂肪干細胞的長期生長，以及保持自我更新及多向分化潛能等特點，從而保證了更為優質的種子細胞來源。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于克服以上分離提取技術的不足，而提供的一種人脂肪干細胞的分離培養方法，其具有操作簡便、應用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細胞資源的特點。[0007]本發明提供的人脂肪干細胞的分離培養方法中，其采用D-Hanks平衡鹽溶液配制的混合膠原酶對脂肪組織進行消化，所述混合膠原酶由I型膠原酶和IV型膠原酶組成。
[0008]所述混合膠原酶的1%母液配制方法為:100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.7gI型膠原酶、0.3g IV型膠原酶。
[0009]使用混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為0.1%-0.2%(m/v)。優選終濃度為
0.l%(m/v)。
[0010]消化得到的脂肪干細胞在含胎牛血清的MCDB-201培養液中培養1_2天后將原有培養液吸棄，更換新鮮培養液，繼續培養24h后再次換新鮮培養液。
[0011]所述含胎牛血清的培養液中還含有LIF。
[0012]具體地說，所述培養液是含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養液。
[0013]優選地，培養液是含有12%胎牛血清、103U/ml LIF的MCDB-201培養液。
[0014]為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案:
[0015]一種人脂肪干細胞的分離培養方法，包括以下步驟:
[0016](I)采集人脂肪組織；
[0017](2)獲取和分離人脂肪干細胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂`肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機中以1600-1800轉/分鐘的轉速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復清洗，清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細胞；
[0018](3)干細胞培養:將獲得的干細胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養瓶，加入IOmL含胎牛血清的培養液，置于37°C、C02濃度5%的培養箱中進行培養，1-2天后將原培養液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養液，棄去非貼壁細胞，以后每24小時更換培養液一次，待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0.25%胰酶-EDTA進行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養后的人脂肪干細胞；
[0019](4)檢測、凍存:檢測和凍存同時進行，在細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、細胞計數及活力測定、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細胞中加入胎牛血清，比例干細胞數/胎牛血清為1-2X106細胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內；24小時后，按照編號放到相應冷凍架上移入液氮中長期保存，待檢測結果出來之后，將檢測不合格的細胞按照其編號將相應的凍存細胞連同凍存管一同廢棄。
[0020]所述步驟(1)中，人脂肪組織是人體吸脂手術中獲得的廢棄物，采集至人體腹部、大腿或皮下脂肪。
[0021]本發明的又一目的是提供上述人脂肪干細胞庫的構建方法。便于人們有效儲存和使用干細胞資源.[0022]構建方法包括以下步驟:[0023](1)采集人脂肪組織；
[0024](2)獲取和分離人脂肪干細胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的DHanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機中以1600-1800轉/分鐘的轉速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復清洗，清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細胞；
[0025](3)干細胞培養:將獲得的干細胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養瓶，加入IOmL 含有 10-15% 胎牛血清、103-105U/ml LIF 的 MCDB-201 培養液，置于 37°C、C02 濃度 5%的培養箱中進行培養，1-2天后將原培養液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養液，棄去非貼壁細胞，以后每24小時更換培養液一次，待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0.25%胰酶-EDTA進行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養后的人脂肪干細胞；
[0026](4)檢測、凍存:檢測和凍存同時進行，在細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、細胞計數及活力測定、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細胞中加入胎牛血清，比例干細胞數/胎牛血清為1-2X106細胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內；24小時后，按照編號放到相應冷凍架上移入液氮中長期保存，待檢測結果出來之后，將檢測不合格的細胞按照其編號將相應的凍存細胞連同凍存管一同廢棄；
[0027](5)建庫:將獲得的每一份人脂肪干細胞按供者姓名、身份證號碼及存儲日期分別保存，建立每一份干細胞的詳細檔案的電腦數據庫，建立人脂肪干細胞庫。
[0028]以下通過試驗例，進一步闡述本發明所述分離培養方法的有益效果:
[0029]試驗例1、人脂肪干細胞提取分離方法研究
[0030]將采集到的人脂肪組織分別采用以下方法進行消化，研究消化液的組成和濃度對細胞分離的影響，然后將消化后的細胞接種至細胞培養瓶中培養，培養過程中對細胞狀態進行記錄:
[0031]方法1、按照實施例1-3的分離培養方法，消化液母液是用100ml DHanks平衡鹽溶液中加入0.7g I型膠原酶、0.3g IV型膠原酶的方法獲得，選擇混合膠原酶的終濃度分別為 0.05%,0.1%、0.15%、0.2%、0.25% ；
[0032]方法2、按照專利ZL201010120944.4實施例1的方法，消化液為0.2%的I型膠原
酶磷酸鹽緩沖液，終濃度為0.1% ；
[0033]方法3、按照專利申請CN201210018269.3說明書第2頁優選實施方案的方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.5g I型膠原酶、0.25g II型膠原酶、
0.25g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15%-0.2% ；
[0034]方法4、按照實施例1-3的分離培養方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.6g I型膠原酶、0.4g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15% ；
[0035]方法5、按照實施例1-3的分離培養方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.5g I型膠原酶、0.5g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15% ；[0036]方法6、按照實施例1-3的分離培養方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.8g I型膠原酶、0.2g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15%。
[0037]對上述消化方法得到的干細胞進行培養，對P0-2代細胞進行連續觀察，結果如下表:
[0038]表1不同消化液對脂肪干細胞分離的影響
【權利要求】
1.一種人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集人脂肪組織； (2)獲取和分離人脂肪干細胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機中以1600-1800轉/分鐘的轉速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復清洗，清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細胞； (3)干細胞培養:將獲得的干細胞按照2-3XIOVcm2的密度接種于培養瓶，加入IOmL含胎牛血清的培養液，置于37°C、C02濃度5%的培養箱中進行培養，1-2天后將原培養液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養液，棄去非貼壁細胞，以后每24小時更換培養液一次，待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0.25%胰酶-EDTA進行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養后的人脂肪干細胞； (4)檢測、凍存:檢測和凍存同時進行，在細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、細胞計數及活力測定、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細胞中加入胎牛血清，比例干細胞數/胎牛血清為1-2 X IO6細胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和 冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內；24小時后，按照編號放到相應冷凍架上移入液氮中長期保存，待檢測結果出來之后，將檢測不合格的細胞按照其編號將相應的凍存細胞連同凍存管一同廢棄。
2.根據權利要求1所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:人脂肪組織是人體吸脂手術或脂肪切除術中獲得的廢棄物，采集至人體腹部、大腿或皮下脂肪。
3.根據權利要求1所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:混合膠原酶是以D-Hanks平衡鹽溶液配制的混合膠原酶，所述混合膠原酶由I型膠原酶和IV型膠原酶組成。
4.根據權利要求3所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:所述混合膠原酶的1% (m/v)母液配制方法為:100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.7g I型膠原酶、0.3g IV型膠原酶。
5.根據權利要求1所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:使用所述混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為0.1%-0.2% (m/v)。
6.根據權利要求5所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:所述混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為0.1% (m/v)。
7.根據權利要求1所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:所述含胎牛血清的培養液中還含有LIF。
8.根據權利要求1或7任一所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:所述培養液是含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養液。
9.如權利要求8所述的人脂肪干細胞的分離培養方法，其特征在于:所述培養液是含有12%胎牛血清、103U/ml LIF的MCDB-201培養液。
10.如權利要求1-8任一所述的人脂肪成體干細胞庫的構建方法，其特征在于，包括: (1)采集人脂肪組織； (2)獲取和分離人脂肪干細胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機中以1600-1800轉/分鐘的轉速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復清洗，清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細胞； (3)干細胞培養:將獲得的干細胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養瓶，加入IOmL含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養液，置于37°C、C02濃度5%的培養箱中進行培養，2-3天后將原培養液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養液，棄去非貼壁細胞，以后每1-2天更換培養液一次，待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0.25%胰酶-EDTA進行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養后的人脂肪干細胞； (4)檢測、凍存:檢測和凍存同時進行，在細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、細胞計數及活力測定、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細胞中加入胎牛血清，比例干細胞數/胎牛血清為1-2X106細胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內；24小時后，按照編號放到相應冷凍架上移入液氮中長期保存，待檢測結果出來之后，將檢測不合格的細 胞按照其編號將相應的凍存細胞連同凍存管一同廢棄； (5)建庫:將獲得的每一份人脂肪干細胞按供者姓名、身份證號碼及存儲日期分別保存，建立每一份干細胞的詳細檔案的電腦數據庫，建立人脂肪干細胞庫。
【文檔編號】G06F19/28GK103667187SQ201210336264
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2012年9月12日
【發明者】張芝庭 申請人:貴州神奇集團控股有限公司