專利名稱：一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法
技術領域：
本發明屬于生物技術酶工程技術領域，具體涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，可在生物活性肽的制備過程中動態監測水解過程，實現水解的可視化，從而最大程度的獲取目標活性肽。
背景技術：
近年來已發現一些天然免疫活性肽如胸腺肽，可誘導淋巴細胞分化、增殖與成熟， 提高免疫低下小鼠的免疫活性。然而天然免疫活性肽在生物體中含量較少，制備成本高，價格昂貴。雖然化學方法可以大量合成免疫活性肽，但化學合成的免疫活性肽存在副反應和副產物較多的問題，其應用和發展受到限制。而酶法水解具有成本低、安全性好，并且易于大量制備等優點，因此目前生物活性肽的制備研究主要集中在酶法水解上面。但是蛋白酶解的程度對于活性肽的免疫效果具有重要的影響，其可以用水解度來表示。隨著對生物活性肽生理功能認識的不斷深入，發現水解度對酶解產物的生物學活性、 活性組分得率、肽段組成和分子量分布均有影響。適當控制酶解條件和水解度可以提高生物活性肽的生成量。例如，對乳鐵蛋白水解產物的抑菌活性與水解度進行相關分析發現，在一定水解度范圍內(DH小于10% )，隨著乳鐵蛋白水解度的提高，酶解產物的抑菌活性增強，但是水解度過大時酶解產物的抑菌活性卻發生下降。因此，確定水解度就對于蛋白酶解產物的免疫調節活性具有重要作用，而實現蛋白酶的可控水解也就具有重要的意義。目前國內外的可控酶解的理論與方法主要集中在數學動力學模型模擬和酶解進程控制上，這為生物活性肽的制備及工業化應用提供了有益的參考。但目前對蛋白酶促水解反應的動力學研究發展較緩慢，其原因是雖然在方程中引入了產物抑制常數和底物常數，但大多仍停留在用米氏方程描述反應過程階段。同時，由于酶解過程是一個相當復雜的過程，易受到各種外界條件影響，如溫度波動、PH變化、酶活變化、攪拌速率不同、底物多樣化等等，使得數學動力學方程十分繁瑣復雜、難于真實地描述反應的全過程。因此動力學模型是有局限性的，完全依靠動力學模型難以實現酶解的可控操作，新的可控酶解理論與技術成為生物活性肽制備中亟待解決的重要課題。而生物傳感器可以在線直接或間接監測酶解過程中產生的活性肽含量和分子量分布，可以有效實現活性肽的可控制備，顯示出巨大優勢。生物傳感器技術把生物活性物質的檢測，巧妙地與傳感器技術、計算機輔助控制方法相結合，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜體系中進行在線連續監測等特點。其原理是在傳感器的化學電極的敏感面上組裝固定化酶膜，當酶膜接觸待測物質時，該膜對待測物質作出響應，催化它的固有反應，轉化為電極中的電流或電位的變化，由計算機撲捉電信號，轉化為測定該物質的數量數據。這樣生物傳感器就能夠快速、可靠地獲得酶解過程中某種或幾種特定的氨基酸含量來間接反映產物水解度和多肽分布的信息，實現酶解的在線動態監測，為生物免疫活性肽制備的全自動控制提供了可能。所以，基于生物傳感器建立的人工神經網絡 (Artificial Neural Networks,ANNs)可用來實現生物活性肽制備的可視化。其具有自學習、自組織和自適應功能，可以充分逼近任意復雜的非線性關系，大規模并行處理，使快速進行大量運算成為可能，有很強的魯棒性和容錯性。正是由于BP-ANNs獨特優勢，構建鱈魚免疫活性肽制備的動態監控模型具有可行性。因此，在線動態監控模型的建立將為鱈魚蛋白免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發奠定了理論基礎和技術支持。但根據文獻調研和國內外查新結果可知，生物傳感器在生物活性肽的酶法制備研究中尚未有報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，從而解決目前沒有能夠及時準確地在線監控鱈魚免疫活性肽酶解制備的問題，為免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發提供技術支持，為鱈魚免疫活性肽實現在線控制制備提供了可操作依據。可應用于生產鱈魚免疫活性肽及其他生物活性肽的在線監控制備。本發明的一個方面確定鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16 17%時終止水解而制備的。本發明的另一個方面涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，包括如下的步驟1)建立并訓練人工神經網絡，包括網絡訓練樣本的制備、參數確定以及網絡的訓練步驟；A、網絡訓練樣本的制備訓練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進行測定；B、人工神經網絡參數確定包括有網絡模型的隱層數、傳遞函數、訓練函數、學習函數、輸入層節點、輸出層節點、隱層節點數；。C、人工神經網絡的訓練與建立以訓練樣本為基礎，根據選定的輸入層節點的不同，建立并訓練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網絡模型；2)確定酶解系統中初始的底物濃度、初始加酶濃度；3)利用生物傳感器監測水解反應中的特定的氨基酸每隔一定時間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內，利用特定氨基酸的氧化酶電極進行檢測；4)將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數輸入到訓練好的人工神經網絡，得出水解產物的水解度，從而實現免疫活性肽的在線監測。本發明確定了鱈魚蛋白的最佳水解度，從而為獲得最佳免疫效果的鱈魚免疫活性肽奠定了基礎。在確定了最佳水解度后，本發明建立了在線監控方法，可以通過生物傳感器-人工神經網絡模型可以在線監測水解反應程度。即使當水解條件波動時，如溫度、pH、 攪拌速率等變化時，其仍可以準確監測水解反應的程度。因此，本發明的方法具有很好的推廣應用前景。
圖1 本發明的在線監控方法的流程圖。
具體實施例方式本發明的一個方面是確定鱈魚免疫活性肽的制備條件，將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，當水解度在0 16%時，隨著水解度的增加，水解產物的免疫活性呈增加趨勢；當水解度為16 17%時，水解產物呈現最高的免疫活性；當水解度大于17%時，隨著水解度的增加，水解產物的免疫活性呈減小趨勢。因此鱈魚免疫活性肽可以控制水解度為16 17%進行水解制備。鱈魚免疫活性肽制備條件的確定是通過體外淋巴細胞增殖實驗對水解產物進行活性篩選，通過動物實驗進行體內免疫活性驗證，確定制備鱈魚免疫活性肽所用的蛋白酶為胰蛋白酶，蛋白濃度25g/L、pH值8. 0、溫度(50士 1) °C、時間290min和加酶量24U/mg, DH為16. 87%，其水解產物體外脾淋巴細胞平均增殖率為28. 45%。該條件下的水解產物能顯著提高正常小鼠的淋巴細胞轉化活性(P < 0. 05)、遲發型變態反應(ρ < 0. 05)和單核巨噬細胞的吞噬能力(P <0.05)。對于免疫功能低下小鼠，該水解產物能顯著提高小鼠的免疫器官指數(P < 0. 05)；顯著促進小鼠的遲發型變態反應(ρ < 0. 05)，提高小鼠脾淋巴細胞的增殖能力(P < 0. 05)，提高小鼠的細胞免疫功能；提高血清溶血素含量(P < 0. 05)，促進小鼠的體液免疫功能；顯著促進小鼠的碳廓清能力(P < 0. 01)和腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(P < 0. 05，P < 0. 01)，促進小鼠的非特異性免疫功能。因此該條件下得到的水解產物對增強體內免疫活性效果顯著。如圖1所示，本發明的另一個方面涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監控方法，包括如下的步驟第一步建立并訓練人工神經網絡。包括網絡訓練樣本的制備、參數確定以及網絡的訓練步驟。1)網絡訓練樣本的制備。訓練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進行測定。酶解反應的水解度根據水合茚三酮法測定；游離谷氨酸和游離賴氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經網絡參數確定。主要包括網絡模型的隱層數、傳遞函數、訓練函數、 學習函數、輸入層節點、輸出層節點、隱層節點數。<1>隱層數的確定。一個三層的BP網絡可以完成任意的N維到M維的映射，即對任何實際問題都可先選用1個隱層。<2>傳遞函數確定。一個三層前饋網絡，當隱層激活函數取非線性函數，輸入輸出層傳遞函數取線性激活函數，就能夠以任意精度逼近任意連續函數。因此，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數。<3>網絡訓練函數采用trainlm。LM法是梯度下降法與高斯-牛頓法的結合和改進，是一種收斂速度快、魯棒性好的算法，適用于前向神經網絡的訓練。既具有梯度下降法的全局收斂特性，又具有高斯-牛頓法的局部快速收斂性。適應性學習函數采用LEARNGDM。<4>由于各因素數據的單位不統一，為了加快訓練網絡的收斂性，改善網絡收斂誤差，更利于數據處理，數據在輸入前可作歸一化預處理。歸一化處理可以采用如下公式=Xi =(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，χ為訓練樣本的輸入數據，Xi為歸一化后的數據，Xfflax與Xmin分別為訓練樣本X中的最大值與最小值。<5>輸入層與輸出層節點的確定。輸入層節點為初始酶濃度、初始底物濃度&、水解產物的游離谷氨酸濃度[GLU]、終產物的游離賴氨酸濃度[LYS]；輸出層節點為DH。<6>隱層節點數的確定。最基本原則在滿足精度要求的前提下取盡可能緊湊的結構，即取盡可能少的隱層節點數。隱層節點數N2可取為禮=機+N3 +d(a =1 10)， 其中輸入節點為N1，輸出節點為N3, α為經驗值。合理隱層節點數應綜合考慮網絡結構復雜程度和誤差大小的情況下確定。3)人工神經網絡的訓練與建立。以訓練樣本為基礎，根據選定的輸入層節點的不同，分別建立并訓練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網絡模型；最后對訓練樣本進行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。<l>GLU-BP-ANNs的動態監控模型隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數，網絡訓練函數采用trainlm，適應性學習函數采用LEARNGDM，輸入層節點分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產物的谷氨酸濃度[Glu]，輸出層節點為DH，隱層節點數為10。對樣本值與擬合值進行回歸分析R2值為 0. 9967，擬合誤差范圍在0-4. 14%，擬合平均相對誤差值為1.06%。<2>LYS-BP-ANNs的動態監控模型隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數，網絡訓練函數采用trainlm，適應性學習函數采用LEARNGDM，輸入層節點分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產物的游離賴氨酸濃度[LYS]，輸出層節點為DH，隱層節點數為11。對訓練樣本進行仿真，其擬合誤差范圍在0 4. 56%，擬合平均相對誤差值為0. 94%。第二步確定酶解系統中初始的底物濃度、初始加酶濃度，在一定溫度、不斷攪拌的條件下進行酶解反應。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應溫度。第三步利用生物傳感器監測水解反應中的特定的氨基酸。每隔一定時間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內，利用特定氨基酸的氧化酶電極進行檢測。生物傳感器進樣的固定體積為25 μ L，測定時間為20秒，清洗時間為25秒。監測的特定氨基酸分別為谷氨酸和賴氨酸。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數進行歸一化處理后，輸入到訓練好的人工神經網絡，得出水解產物的水解度，從而實現免疫活性肽的在線監測。為獲得免疫活性肽，將水解產物的目標水解度控制在16 17%范圍，若符合要求，沸水浴中滅活酶5min終止水解反應，然后迅速冷卻至室溫，調pH至中性，離心；若不在此范圍， 繼續進行酶解反應，直到符合要求，終止酶解反應。實施例1 :GLU-BP-ANNs模型在線監測制備免疫肽第一步建立并訓練GLU-BP-ANNs網絡模型。1)網絡訓練樣本的制備。訓練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離谷氨酸進行測定。酶解反應的水解度根據水合茚三酮法測定；游離谷氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經網絡參數確定。隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數， 隱層與輸出層之間使用線性purelin函數，網絡訓練函數采用trainlm，適應性學習函數采用LEARNGDM，輸入層節點分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、產物的谷氨酸濃度[Glu]， 輸出層節點為DH，隱層節點數為10。3)人工神經網絡的訓練與建立。以訓練樣本為基礎，建立并訓練了 GLU-BP-ANNs網絡模型；最后對訓練樣本進行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。對樣本值與擬合值進行回歸分析R2值為0. 9967，擬合誤差范圍在0-4. 14%，擬合平均相對誤差值為1. 06%。第二步底物為鱈魚排高壓勻漿，確定酶解系統中初始的底物蛋白濃度為25g/L、 初始胰蛋白酶濃度為600U/mL，在不斷攪拌的條件下進行酶解反應。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應溫度50°C。第三步利用生物傳感器監測水解反應中的谷氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物傳感器內，利用谷氨酸氧化酶電極進行檢測。測定時間為20秒，清洗時間為25秒。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、谷氨酸濃度等參數進行歸一化處理后， 輸入到訓練好的人工神經網絡，通過已建立的GLU-BP-ANNs監控反應體系的水解程度，利用生物傳感器監測反應體系中游離[Glu]變化，當網絡顯示水解度在16-17%范圍內時終止水解反應，分別進行5次獨立的水解實驗，得到DH值試驗值與仿真輸出值，經歸一化處理后見表1。表IGLU-BP-ANNs監測鱈魚排免疫肽制備
S0E0Glu試驗值擬合值相對誤差 (%)0.57140.71430.42550.7080.7211.720.57140.71430.43970.7530.751-0.230.57140.71430.43500.7350.7410.820.57140.71430.44440.7440.7612.290.57140.71430.43970.7310.7512.81由表可以看出，試驗的相對誤差僅在0. 23% 2. 81 %范圍，對于特別復雜的水解反應來說，已經在一定程度上實現了仿真監控，對控制水解反應有重要意義。活性實驗發現，此法制備的水解產物可以顯著的促進免疫細胞增殖活性，具有較好的免疫增強活性。實施例2 第一步建立并訓練LYS-BP-ANNs網絡模型。1)網絡訓練樣本的制備。訓練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離賴氨酸進行測定。酶解反應的水解度根據水合茚三酮法測定；游離賴氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經網絡參數確定。一個隱含層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數，網絡訓練函數采用trainlm，適應性學習函數采用LEARNGDM，輸入層節點分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產物的賴氨酸濃度 [LYS]，輸出層節點為DH，隱層節點數為11。3)人工神經網絡的訓練與建立。以訓練樣本為基礎，建立并訓練了 LYS-BP-ANNs 網絡模型；最后對訓練樣本進行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。對訓練樣本進行仿真，其擬合誤差范圍在0 4. 56%，擬合平均相對誤差值為0. 94%。第二步底物為鱈魚排高壓勻漿，確定酶解系統中初始的底物蛋白濃度為25g/L、初始胰蛋白酶濃度為600U/mL，在不斷攪拌的條件下進行酶解反應。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應溫度50°C。第三步利用生物傳感器監測水解反應中的賴氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物傳感器內，利用賴氨酸氧化酶電極進行檢測。測定時間為20秒，清洗時間為25秒。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、賴氨酸濃度等參數進行歸一化處理后， 輸入到訓練好的人工神經網絡，通過已建立的LYS-BP-ANNs監控反應體系的水解程度，利用生物傳感器監測反應體系中游離賴氨酸變化，當網絡顯示水解度在16-17%范圍內時終止水解反應，分別進行5次獨立的水解實驗，得到DH值試驗值與仿真輸出值，經歸一化處理后見表2。表2LYS-BP-ANNs監測鱈魚排免疫肽制備
權利要求
1.一種鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16 17%時終止水解而制備的。
2.制備權利要求1所述的鱈魚免疫活性肽的在線監控方法，包括如下步驟1)建立并訓練人工神經網絡，包括網絡訓練樣本的制備、參數確定以及網絡的訓練步驟；2)確定酶解系統中初始的底物濃度、初始加酶濃度；3)利用生物傳感器監測水解反應中的特定的氨基酸每隔一定時間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內，利用特定氨基酸的氧化酶電極進行檢測；4)將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數輸入到訓練好的人工神經網絡，得出水解產物的水解度，從而實現免疫活性肽的在線監測。
3.如權利要求1所述的在線監控方法，其特征在于所述的步驟1)中的網絡訓練樣本的制備，具體如下利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進行水解反應，分別對每一酶解反應的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進行測定。
4.如權利要求1所述的在線監控方法，其特征在于所述的步驟1)中的人工神經網絡參數確定包括有網絡模型的隱層數、傳遞函數、訓練函數、學習函數、輸入層節點、輸出層節點、隱層節點數。
5.如權利要求1所述的在線監控方法，其特征在于所述的步驟1)中的人工神經網絡的訓練與建立以訓練樣本為基礎，根據選定的輸入層節點的不同，建立并訓練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs 網絡模型。
全文摘要
本發明涉及一種鱈魚免疫活性肽，及其制備的在線監控方法。所述的鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16～17％時終止水解而制備的。并建立了GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網絡模型，從而對鱈魚免疫活性肽的制備了在線監控方法。本發明確定了鱈魚蛋白的最佳水解度，從而為獲得最佳免疫效果的鱈魚免疫活性肽奠定了基礎。在確定了最佳水解度后，本發明建立了在線監控方法，可以通過生物傳感器-人工神經網絡模型可以在線監測水解反應程度。即使當水解條件波動時，如溫度、pH、攪拌速率等變化時，其仍可以準確監測水解反應的程度。因此，本發明的方法具有很好的推廣應用前景。
文檔編號G06N3/02GK102559822SQ20121000361
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月7日 優先權日2012年1月7日
發明者侯虎, 張朝輝, 李八方, 趙雪 申請人:中國海洋大學