專利名稱：Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法及應用，具體涉及以Bcl-2蛋白為靶點的抑制劑的三維定量構效關系模型的建立及利用該模型進行快速藥物篩選，屬于生物信息技術領域。
背景技術：
惡性腫瘤(又稱癌癥)是目前威脅人類健康的重大疾病，其發病率和死亡率一直以來居高不下。據世界衛生組織統計，目前全球每年有超過700萬人死于癌癥。為了戰勝癌癥，各國均投入了大量人力物力進行研究。目前臨床上癌癥治療手段主要依靠細胞毒性藥物，而該類藥物存在著毒副作用大、選擇性差、易產生耐受等缺點，因此，開發低毒、高效、 成藥性好的新型抗腫瘤藥物已成為當前藥物的研究熱點。隨著人們對對細胞凋亡機制的研究，越來越多的新型抗腫瘤靶點被提出。從分子水平來看，腫瘤耐藥的發生與某些功能蛋白非正常性調控細胞凋亡途徑有關。調控細胞凋亡的途徑有很多，其中B-細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，以下簡稱Bcl_2)蛋白家族作為重要的細胞凋亡調節因子，在線粒體凋亡通路中發揮著重要作用(參見Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells, J. Μ. , et al. Nature，1998，281，1322.)。值得一提的是，Bcl_2 蛋白往往僅在腫瘤細胞中高表達，這對于發現無毒或低毒的新型抗腫瘤藥物有著重要意義。迄今為止，人們在哺乳動物中發現了約25個Bcl-2蛋白家族成員，可分為三大類即抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等)、促凋亡蛋白(Bax、Bak等)以及只含BH3 結構域的促凋亡蛋白(Bid、Bad)(參見 Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Petros, A.M. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 2001,98, 3012) 研究發現，抗凋亡蛋白Bcl-2在腫瘤細胞中過度表達，導致癌癥治療手段無法有效誘導腫瘤細胞凋亡，從而影響腫瘤化療和放療的效果(參見The role of Bcl-2 family members intumorigenesis, Kirkin, V.，et al. BBA-Mol. Cell. Res.，2004，1644，229)。結構生物學研究發現，Bcl-2蛋白表現有一個細長的疏水口袋，是其與促凋亡蛋白BH3結構域結合的關鍵位點(參見 Antimycin A mimics a cell-death-inducing Bcl-2 homology domain 3, Tzung，S. P.，et al. Nat. Cell. Biol.，2001，3，183)。從 BH3 結構域的模擬物出發，研究抑制 Bcl-2蛋白的藥物分子，將有利于阻斷促凋亡蛋白與Bcl-2蛋白的結合，解決臨床相關腫瘤治療的耐藥性問題。目前，對于抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的研究主要有三種策略基因沉默技術(如使用反義寡核苷酸或RNAi技術)、BH3結構域模擬肽類和化學小分子抑制劑。但是研究發現， 反義寡核苷酸分子在抑制Bcl-2蛋白表達的同時，由于缺乏靶向性而易產生副作用。同時， BH3結構域模擬肽親和力較差，難以滲透進入細胞內，且對腫瘤細胞的選擇性不佳。因此非肽類小分子Bcl-2抑制劑，其分子質量較低，通常具有較高的細胞滲透性，有利于提高其在體內的生物利用度，且對癌細胞具有較高的特異性。因此研究非肽類Bcl-2小分子藥物已成為Bcl-2蛋白抑制劑的研究熱點。其中以ABT-737為代表的一系列小分子Bcl_2蛋白抑制劑具有較高的生物活性及良好的選擇性，ABT-737目前已進入II期臨床研究(參見 Studies Leading to Potent, Dual Inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL, Bruncko, M. ， et al. J. Med. Chem.，2007，50，641)。隨著生物信息學的發展，計算機輔助藥物設計在現代新藥研發中發揮著越來越重要的作用。其中，三維定量構效關系模型(3D-QSAR)是一種借助分子的理化性質參數或結構參數，以數學和統計學手段定量研究有機小分子與生物大分子相互作用、有機小分子在生物體內吸收、分布、代謝、排泄等生理相關性質的方法。這種方法廣泛應用于藥物、農藥、 化學毒劑等生物活性分子的合理設計，在藥學研究中發揮著非常重要的作用。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法及應用。本發明需要解決的技術問題是傳統藥物研究主要依靠高通量篩選進行先導化合物的發現，但是，隨著組合化學的發展，已有的化合物庫非常龐大，對每一種化合物進行生物學活性篩選需要耗費大量的人力、物力、財力。是本發明的目的是建立一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型， 可以快速、經濟的預測化合物與Bcl-2蛋白的結合能力。本發明技術方案如下本發明根據現有已知的小分子抑制劑，利用三維定量構效關系技術，建立Bcl-2 蛋白抑制劑三維定量構效關系模型。該方法采用分子相似性分析、分子構象優化、參數優化等技術進一步增加模型的準確性。一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法，包括如下步驟(1)根據與Bcl-2蛋白的結合能力的大小，將已知的小分子抑制劑根據生物學活性指標分為三類；每類隨機選取一到兩個抑制劑作為測試集，其余的組成訓練集；生物學活性指標采用結合常數Ki的負對數PKi (PKi = log Ki)，其中PKi < 7，7 < PKi < 8，PKi > 8，分別代表與Bcl-2蛋白結合結合能力弱、結合能力中等、結合能力強；(2)根據已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結合后的三維結構，利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結構；將訓練集和測試集中已知的小分子抑制劑的二維結構轉換為三維結構，并利用陽性化合物的空間三維結構進行分子相似性分析，得到初步三維空間結構模型；經構象優化獲得優化的三維空間結構模型。(3)以步驟⑵制得的優化的三維空間結構模型的公共剛性骨架為模板進行分子疊合；用小分子探針搜尋疊合后化合物周圍的力場信息；力場信息包括立體場與靜電場；(4)對步驟C3)獲得的力場信息進行優化后，與訓練集中的小分子抑制劑的生物學活性值進行偏最小二乘法回歸，獲得Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型。所述步驟(2)中已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結合后的三維結構從蛋白質數據庫 http://www. pdb. org/下載，該三維結構通過核磁共振解析獲得；所述步驟⑵中利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結構是指使用
4SYBYL7. 3 (Tripos Inc.)分析Bcl_2蛋白活性位點，并抽出與陽性化合物結合的活性域的
三維結構。所述步驟( 中的構象優化是指使用Tripos力場進行優化，加Gasteiger-HUckel 電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數為1000次。所述步驟(4)中對力場信息進行優化后是指對率柱濾值和閾值進行調整，以交叉驗證系數q2為表征模型的合理性，Q2 > 0. 5即表示該模型具有較好的合理性，Q2值越高表示分析活性的能力越強。該步驟可增加模型的合理性、消除噪聲、提高分析速度。所述構建方法還包括利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型對測試集中小分子抑制劑活性進行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型進行評價，同時以r2pred衡量模型的篩選能力，r2pred= (SD-PRESS)，其中其中SD代表測試集生物活性值與訓練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實驗值的平方差的和。該步驟可檢驗構建模型的準確性。利用上述Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法在藥物快速篩選中的應用。有益效果本發明利用已知生物活性的Bcl-2蛋白抑制劑，采用三維定量構效關系技術，構建了合理的生物活性預測模型，可以快速預測活性未知化合物的Bcl-2蛋白結合常數，在短時間內獲取活性化合物線索，相比傳統的高通量篩選技術大大提高了篩選效率，降低了成本。
圖1、已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結合后的三維結構示意圖；其中，結合位點用斷線圓圈標出；圖2、已知的小分子抑制劑與陽性化合物的分子相似性分析；圖3、初步Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型示意圖；圖4、模型分析活性值與實際活性值的線性回歸曲線；圖5、實施例2中札-276與Bcl_2蛋白結合后的三維結構示意圖；圖6、利用模型分析獲得的WL-276的三維構象示意圖。
具體實施例方式以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明的保護范圍。實施例1本發明涉及利用已知的小分子抑制劑(參見Mudies Leading to Potent, Dual Inhibitors of Bcl-2 and Bcl—xL，Bruncko, M.，et al. J. Med. Chem.，2007，50，641)構建 Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的方法。該方法包括如下步驟(1)根據論文報道中涉及的已知的小分子抑制劑共31個，其生物學活性以結合常數Ki表示。用結合常數Ki的負對數PKi (PKi = Iog Ki),將該類抑制劑分為三類，其中PKi < 7，7 < PKi < 8,PKi > 8，分別代表與Bcl-2蛋白結合結合能力弱、結合能力中等、結合能力強。從三類中抽取沈個已知的小分子抑制劑作為訓練集建立預測模型，其余5個已知的小分子抑制劑作為測試集進行驗證。(2)目前已有Bcl-2蛋白與陽性化合物復合物的三維結構報道。從蛋白質數據庫 (http://www. pdb. org/)下載編號為202F的PDB文件(Bcl_2蛋白與陽性化合物的復合三維結構)，使用3 (Tripos Inc.)分析蛋白活性位點，選擇陽性化合物的三維結構并將其抽出(見附圖1)。已知的小分子抑制劑的二維結構使用Accelrys Draw 4.0(Accelrys Inc.)構建，并運用Concord(STO17· 3，Tripos Inc.)將二維結構轉換為三維結構。以陽性化合物的三維結構為模板，使用Surflex-sim(STO17. 3，Tripos Inc.)搜尋已知的小分子抑制劑與陽性化合物三維結構最為相似的構象。(見附圖2)搜尋獲得的構象使用Tripos力場進行優化，加feisteiger-HUckel電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數為1000次，得到優化的三維空間結構模型。(3)以步驟(2)得到的優化的三維空間結構模型的公共剛性骨架為模板進行分子疊合；利用CoMFA (STO17. 3, Tripos Inc.)進行分子力場(分子力場包括立體場和靜電場) 的搜尋，獲得力場信息。(4)對步驟C3)獲得的力場信息通過調整柱濾值和閾值進行優化，最終選擇柱濾值=2.2kCal/mol，閾值(立體場和靜電場)=7^al/mol，將力場信息與訓練集中的小分子抑制劑的生物學活性值進行偏最小二乘法回歸，獲得q2 = 0. 568的三維定量構效關系模型(見附圖3)。(5)利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型對測試集中小分子抑制劑活性進行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型進行評價，同時以r2p,ed衡量模型的篩選能力，r2p,ed = (SD-PRESS)，其中其中SD代表測試集生物活性值與訓練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實驗值的平方差的和，預測相關系數r2pral = 0. 568，活性預測值與實際值的線性回歸(見附圖4)。實施例2采用實施例1所述的一種構建Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的方法對母核不同的Bcl-2蛋白抑制劑進行活性分析。1. WL-276為目前新近報道的已知的小分子抑制劑，它可以有效地抑制Bcl_2蛋白，其母核結構為2-硫代-4-噻唑烷酮，與實施例1中建立模型所采用的已知的小分子抑制劑母核結構不同；2.采用 Accelrys Draw 4. 0(Accelrys Inc.)構建 WL-276 的二維結構，并運用 Concord (SYBYL7. 3，Tripos Inc.)將二維結構轉換為三維結構；3.因為WL-276與已有三維結構的陽性化合物結構差異較大，為了獲得與真實值更為接近的WL-276三維結構，采用分子對接程序Surflex-Dock (STO17. 3，Tripos Inc.) 模擬WL-276與Bcl-2蛋白的結合模式(見附圖5)，采用理論結合值最高的構象作為WL-276 的最終構象；4.使用實施例1中的模型對步驟3獲得的WL-276三維構象進行分析(見附圖6)，分析活性值PKi = 8. 027(目前已報道生物活性最好的ABT-737的PKi = 9，15)，分析結果顯示該化合物具有較好的Bcl-2蛋白抑制能力；生物活性測試確認了 WL-276對Bcl_2蛋白白勺抑制能力(#JAL WL-276, an antagonist against Bcl-2 proteins, overcomes drug resistance and suppresses prostate tumor growth, Wang, L. , et al. Cancer. Res., 2008，68，4377)。
權利要求
1.一種Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法，包括如下步驟(1)根據與Bcl-2蛋白的結合能力的大小，將已知的小分子抑制劑根據生物學活性指標分為三類；每類隨機選取一到兩個抑制劑作為測試集，其余的組成訓練集；生物學活性指標采用結合常數Ki的負對數PKi,其中PKi < 7，7 < PKi < 8，PKi > 8，分別代表與Bcl_2 蛋白結合結合能力弱、結合能力中等、結合能力強；(2)根據已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結合后的三維結構，利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結構；將訓練集和測試集中已知的小分子抑制劑的二維結構轉換為三維結構，并利用陽性化合物的空間三維結構進行分子相似性分析，得到初步三維空間結構模型； 經構象優化獲得優化的三維空間結構模型；(3)以步驟(2)制得的優化的三維空間結構模型的公共剛性骨架為模板進行分子疊合；用小分子探針搜尋疊合后化合物周圍的力場信息；(4)對步驟C3)獲得的力場信息進行優化后，與訓練集中的小分子抑制劑的生物學活性值進行偏最小二乘法回歸，獲得Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中已知Bcl-2蛋白與陽性化合物結合后的三維結構從蛋白質數據庫http://WWW. pdb. org/下載，該三維結構通過核磁共振解析獲得。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中利用分析軟件獲得陽性化合物的空間三維結構是指使用STOYL7. 3分析Bcl-2蛋白活性位點，并抽出與陽性化合物結合的活性域的三維結構。
4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟O)中的構象優化是指使用 Tripos力場進行優化，加feisteiger-HUckel電荷，能量收斂限為0. 05kcal/mol，最大迭代次數為1000次。
5.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(4)中對力場信息進行優化后是指對率柱濾值和閾值進行調整，以交叉驗證系數q2為表征模型的合理性，Q2 > 0. 5即表示該模型具有較好的合理性，Q2值越高表示分析活性的能力越強。
6.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，還包括利用步驟(4)制得的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型對測試集中小分子抑制劑活性進行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值與實際活性值的線性回歸曲線，對Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型進行評價，同時以！^^衡量模型的篩選能力，r2pred= (SD-PRESS)，其中其中 SD代表測試集生物活性值與訓練集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表測試集生物活性分析值與實驗值的平方差的和。該步驟可檢驗構建模型的準確性。
7.權利要求1所述的Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法在藥物快速篩選中的應用。
全文摘要
本發明涉及Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型的構建方法及應用，屬于生物信息技術領域。該方法根據現有已知的小分子抑制劑，利用三維定量構效關系技術，建立Bcl-2蛋白抑制劑三維定量構效關系模型，采用分子相似性分析、分子構象優化、參數優化等技術進一步增加模型的準確性。本發明可以快速預測活性未知化合物的Bcl-2蛋白結合常數，在短時間內獲取活性化合物線索，相比傳統的高通量篩選技術大大提高了篩選效率，降低了成本。
文檔編號G06F19/10GK102262715SQ20111014639
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日
發明者侯旭奔, 方浩 申請人:山東大學