專利名稱：一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法
技術領域：
本發明具體涉及一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，屬于生物信息技術領域。
背景技術：
腫瘤是一種細胞因損傷或惡變而獲得無限增殖能力的疾病，腫瘤化療是目前治療惡性腫瘤的主要手段。然而，腫瘤耐藥性，尤其是獲得性多藥耐藥性已成為當前腫瘤化療的主要障石導(An overview of cancer multidrug resistance :a still unsolved problem, 參見 Lage, H.，et al，Cell.Mol. Life. Sci.，2008，65，3145)。絕大多數應用于臨床的腫瘤化療藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡而產生治療效果的，因此，抗凋亡途徑是腫瘤細胞發生耐藥的主要機制。鑒于細胞凋亡的重要生物學作用，科學家們深入研究后發現調控細胞凋亡通路的因素很多，一般認為主要與線粒體、Caspase家族和B-細胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, 以下簡稱Bcl-2)蛋白家族有關。Bcl-2蛋白家族作為重要的細胞凋亡調節因子，主要在線粒體凋亡通路中發揮重要作用(The Bcl-2 family arbiters of cell survival，參見 Adams, J. M.，et al. Sci.，1998，281，1322.)。Bcl-2蛋白家族可分為促凋亡和抗凋亡兩類。促凋亡和抗凋亡蛋白的共同結構特征是大部分都有保守的羧基端跨膜結構域，這個跨膜結構域可以使它們固定在不同的細胞器上面，包括核膜、內質網、線粒體外膜等。迄今為止，人們在哺乳動物中發現了約25個 Bcl-2蛋白家族成員。根據它們所含同源結構域(BHl BH4)的不同及其在細胞凋亡中的特殊作用，Bcl-2蛋白家族可分為三大類即抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等)、促凋亡蛋白(Bax、Bak等)和僅有BH3結構域的促凋亡蛋白(Bid、Bad)。抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的相對平衡決定了細胞的命運。科學家們發現該家族中的抗凋亡蛋白成員(比如 Bcl-2，Bcl-Xl等)在許多惡性腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、急慢性白血病等)中過度表達，導致癌癥治療中無法誘導細胞凋亡的發生，從而影響腫瘤化療和放療的效果，以致產生耐藥性。因此，Bcl-2蛋白已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點，為今后尋找新型抗腫瘤藥物提供了重要方向。現有藥物發現技術存在著研究周期長、耗資巨大、成功率低的缺陷。近年來，隨著生物信息學的發展與計算機模擬技術的提高，許多基于計算機模擬技術的新型藥物發現技術被提出，其中，基于分子對接技術的高通量虛擬篩選技術占據重要地位。
發明內容
概述針對現有技術的不足，本發明提供一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其要點是1)模擬Bcl-2蛋白的三維結構以及活性結合位點的確定；2)建立用于虛擬篩選的小分子配體庫；幻建立針對Bcl-2蛋白的計算機虛擬篩選系統；4)利用步驟3)對步驟幻的小分子配體庫進行篩選，初步確定了 10個與活性位點有較高親和能力的化合物，為研發新型抗癌藥物Bcl-2抑制劑提供基礎。詳述本發明的具體技術方案，一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，步驟如下1) Bcl-2蛋白的結合位點的確定及三維結構的處理；2)對ZINC小分子配體進行類藥性篩選，通過篩選的配體組成小分子配體庫；3)利用剛性對接技術建立以Bcl-2蛋白為靶點的計算機快速篩選系統；4)運用步驟幻的計算機快速篩選系統對步驟2、中的小分子配體庫進行篩選，最終篩選出10個與Bcl-2蛋白具有潛在高親和能力的化合物。如步驟1)所述Bcl-2蛋白的結合位點的確定及三維結構的處理，步驟如下在蛋白質數據庫中搜尋獲得Bcl-2蛋白的三維結構(采用核磁共振技術解析獲得，PDBcode :202F)，該結構為Bcl_2蛋白與陽性藥物的復合物；使用SYBYL7. 3 (Tripos Inc.)分析蛋白活性位點，選擇陽性化合物的三維結構A/LI0_1000，并將其抽出(見
圖1)； 修復蛋白末端殘基并采用Kollman All方法計算整個蛋白的電荷。如步驟2)所述，對ZINC小分子配體進行類藥性篩選，通過篩選的配體組成小分子配體庫，步驟如下ZINC小分子數據庫是由加州大學舊金山分校藥物化學系Sioichet實驗室建立并維護的免費數據庫。最新版本為ZINC8，擁有超過1300萬個化合物；在本步驟中，我們選擇了 Fragment-like片段數據庫以及Analyticon天然產物數據庫進行研究；類藥性篩選采用里賓斯基五規則(化合物的分子量小于500道爾頓；化合物結構中的氫鍵給體的數量不超過5個；化合物中氫鍵受體的數量不超過10個；化合物的脂水分配系數的對數值IogP 在-2到5之間；化合物中可旋轉鍵的數量不超過10個)；最終獲得含約2萬個化合物的小分子化合物庫；使用Concord(SYBYL7. 3，Tripos Inc.)獲得小分子的三維立體結構，并采用Gasteiger-HUckel方法計算電荷。如步驟3)所述，利用剛性對接技術建立以Bcl-2蛋白為靶點的計算機快速篩選系統，步驟如下建立針對Bcl-2蛋白的計算機虛擬篩選系統采用的操作系統為Wxmtu-10. 10 ；下載并安裝加州大學舊金山分校發布的分子建模及分析軟件 Chimera (versionl. 5. 3)；申請 Dock(version6. 1)的使用證書(http //dock, compbio. ucsf. edu/)，并下載該程序的源代碼，經過編譯獲得可運行的二進制程序，進行安裝；安裝完成后，進行如下步驟a.生成靶點蛋白分子表面利用步驟1)中處理過的Bcl-2蛋白結構，使用 Chimera中的DMS程序生成分子表面，得到文件rec. ms ；b.生成負模使用Dock軟件包中附帶的sphgen程序去生成對接需要的球形負模，輸入命令sphgen，得到文件rec. sph (步驟b需要一個INSPH文件，在Dock軟件包中獲得)；c.選擇一簇負模進行對接步驟1)中已獲得陽性化合物的結構，因此選擇陽性化合物周圍10埃的負模進行對接，鍵入下列命令“sphere_selector rec. sph ligand. mol210. 0” (此處ligand. mol2文件為步驟1)中抽出的陽性化合物)，得到文件sphere_ selector, sph ；d.身材高恒格柵首先鍵入命令show<box.in，其中box.in 文件包含以下內容Y5sphere_selector.sph1rec_box.pdb獲得rec_box.pdb文件；運行命令“grid-i grid.in”其中grid.in文件包括以下內容
權利要求
1.一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，步驟如下1)Bcl-2蛋白的結合位點的確定及三維結構的處理；2)對ZINC小分子配體進行類藥性篩選，通過篩選的配體組成小分子配體庫；3)利用剛性對接技術建立以Bcl-2蛋白為靶點的計算機快速篩選系統；4)運用步驟(3)的計算機快速篩選系統對步驟O)中的小分子配體庫進行篩選，最終篩選出10個與Bcl-2蛋白具有潛在高親和能力的化合物。
2.如權利要求1所述的一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其特征在于，如步驟1)所述，Bcl-2蛋白的結合位點的確定及三維結構的處理在蛋白質數據庫中搜尋獲得Bcl-2蛋白的三維結構(采用核磁共振技術解析獲得， PDBcode :202F)，該結構為Bcl-2蛋白與陽性藥物的復合物；使用SYBYL7. 3 (Tripos Inc.) 分析蛋白活性位點，選擇陽性化合物的三維結構A/LI0_1000，并將其抽出(見圖1)；修復蛋白末端殘基并采用Kollman All方法計算整個蛋白的電荷。
3.如權利要求1所述的一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其特征在于，如步驟2、所述，對ZINC小分子配體進行類藥性篩選，通過篩選的配體組成小分子配體庫ZINC小分子數據庫是由加州大學舊金山分校藥物化學系Sioichet實驗室建立并維護的免費數據庫。最新版本為ZINC8，擁有超過1300萬個化合物；在本步驟中，我們選擇了 Fragment-like片段數據庫以及Analyticon天然產物數據庫進行研究；類藥性篩選采用里賓斯基五規則；最終獲得含約2萬個化合物的小分子化合物庫；使用Concord(STO17. 3， Tripos Inc.)獲得小分子的三維立體結構，并添加采用Gasteiger-HUckel方法計算電荷。
4.如權利要求1所述的一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其特征在于，如步驟3)所述，利用剛性對接技術建立以Bcl-2蛋白為靶點的計算機快速篩選系統建立針對Bcl-2蛋白的計算機虛擬篩選系統采用的操作系統為Wxmtu-10. 10 ；下載并安裝加州大學舊金山分校發布的分子建模及分析軟件 Chimera (versionl. 5. 3)；申請 Dock(version6. 1)的使用證書(http://dock. compbio. ucsf. edu/)，并下載該禾呈序的源代碼，經過編譯獲得可運行的二進制程序，進行安裝；步驟3)的具體實施步驟a.生成靶點蛋白分子表面利用步驟1)中處理過的Bcl-2蛋白結構，使用Chimera中的DMS程序生成分子表面，得到rec. ms ；b.生成負模使用Dock軟件包中附帶的sphgen程序去生成對接需要的球形負模，輸入命令sphgen就可以了，得到rec. sph (步驟b需要一個INSPH文件，在Dock軟件包中獲得)；c.選擇一簇負模進行對接步驟1)中已獲得陽性化合物的結構，因此選擇陽性化合物周圍10埃的負模進行對接，鍵入下列命令“sphere_selector rec. sph ligand. mol210. O” (此處ligand. mo 12為步驟1)中抽出的陽性化合物)，得到sphere_selector. sph ；d.生成格柵首先鍵入命令show< box. in，其中box. in文件包含以下內容Y 5sphere_selector, sphrec_box. pdb獲得rec_box. pdb文件；運行命令“grid-i grid, in”其中grid, in文件包括以下內容
5.如權利要求1所述的一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其特征在于，如步驟4)所述，運用步驟幻的計算機快速篩選系統對步驟幻中的小分子配體庫進行篩選，最終篩選出10個與Bcl-2蛋白具有潛在高親和能力的化合物；鍵入如下命令即可進行快速篩選docli6-i rigid, in。其中rigid, in為剛性對接配置文件，具體內容如下
6.如權利要求1所述的一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，其特征在于，如需利用步驟3)中建立的計算機虛擬篩選系統對其他化合物庫進行篩選，只需將步驟4)rigid, in文件中的zinc. mol2替換成所需篩選的小分子庫。
全文摘要
本發明涉及一種快速發現以Bcl-2蛋白為靶點的先導化合物的方法，包括以下步驟1)Bcl-2蛋白的結合位點的確定及三維結構的處理；2)建立用于虛擬篩選的小分子配體庫；3)建立針對Bcl-2蛋白的計算機虛擬篩選系統；4)利用步驟3)對步驟2)的小分子配體庫進行篩選，初步確定了10個與活性位點有較高親和能力的化合物。采用本發明可以在短時間內發現具有潛在活性的化合物，大大提高了效率，為研發新型抗癌藥物Bcl-2抑制劑提供基礎。
文檔編號G06F19/16GK102222176SQ201110146209
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日
發明者侯旭奔, 方浩 申請人:山東大學