專利名稱：：用于計數細胞的方法用于計數細胞的方法與相關申請的交叉參考本申請要求于2007年4月20日提交的美國臨時申請號60/925，368的利益，所述美國臨時申請在此引入作為參考。
背景技術：
：本發明涉及醫學設備、醫學診斷學和細胞計數領域。微觀流體系統已顯示用于研究細胞功能、細胞和組織工程改造、疾病診斷、血樣制備和藥物開發的獨特希望。最近，微觀流體從全血中分離白細胞亞群的純群體的用途已吸引了用于即時現場(point-of-care)診斷學的許多興趣。盡管在細胞分離方法后的原理可以容易地適應于廣泛臨床應用，但檢測這些分離的細胞仍是待解決的技術挑戰。用于檢測和定量微型設備內的表面固定細胞的光學顯微鏡術的使用不代表用于即時現場應用的最佳解決方案。這是因為光學檢測方法依賴于可以增加檢測的成本和復雜性的穩定光程、透鏡作用、濾光和聚焦裝置。此外，由于在單次時可用的小檢測面積，光學檢測趨向于是低通量的。同時，大多數一般使用的細胞計數策略如流式細胞術和阻抗測量(即Coulter計數器)不能應用于附著在表面上的細胞，盡管小型化平臺已由幾個研究者實現。通過基質阻抗感知檢測附著細胞的可替代技術要求在電極表面上的細胞覆蓋度達到用于可檢測測量的接近一致。仍未報道使用非光學方法檢測在相對大體積中的大表面積上的少數細胞的研究-包括甚至微量設備的微升體積，盡管存在關于在微觀流體應用中的非光學檢測法的需要。細胞的檢測和計數對于醫學診斷學特別是AIDS、癌癥診斷和病原體檢測是基本的。盡管檢測細胞的大多數現有方法是光學的(即，顯微鏡術)，但電檢測是明顯更簡單、更廉價的，并且更順應即時現場設備。迄今，基于阻抗光譜學(即，由細胞的存在引起的電阻抗中變化的檢測)的完整細胞的電檢測和計數已證明是非常實際且價廉的，但局限于大細胞群體或同質細胞類型(例如，紅細胞的Coulter計數)。發明概述在一個方面，本發明的特征在于計數樣品中的細胞(例如，哺乳動物、真菌、原生生物或細菌細胞)的方法，這通過下述實現將樣品引入通道內，使通道內的細胞裂解，并且測量起因于裂解的至少一種細胞組分的至少一種性質。在這個方面，細胞組分指示通道中裂解的細胞數目。在另一個方面，本發明的特征在于計數樣品中的細胞(例如哺乳動物、真菌、原生生物(protest)或細菌細胞)的方法，所述方法包括下述步驟將樣品引入通道(例如，微觀流體通道)內，將非導電溶液引入通道內(例如，糖溶液)，對通道應用電場，測量通道的阻抗，用裂解性非導電溶液(例如，去污劑溶液)替換非導電溶液，并且允許至少一種細胞裂解，對通道應用電場，并且測量通道的阻抗。在這個方面，裂解后阻抗中的減少指示樣品中的細胞數目。在這個方面，例如使用自頂向下(top-down)電極、IDT電極或雙軌(tworail)電極測量阻抗。希望地，裂解前非導電溶液的阻抗大于1，000歐姆、大于10，000歐姆、大于100，000歐姆、大于1，000,000歐姆或更大。在另一個方面，本發明的特征在于診斷受試者中的狀況的方法，這通過下述實現將包含細胞群體(例如，CD4輔助細胞)的樣品(例如，人血樣)引入通道內，使通道內的細胞群體裂解，并且測量起因于裂解的至少一種細胞組分的至少一種性質。在這個方面，細胞組分指示通道中裂解的細胞數目，并且細胞數目對于狀況是在診斷上有價值的。在另一個方面，本發明的特征在于用于計數細胞的試劑盒，包括設備、非導電溶液(例如，糖溶液)和裂解性非導電溶液(例如，去污劑溶液)。在這個方面，設備包括微觀流體通道和電極(例如，自頂向下電極、IDT電極和雙軌電極)，以測量微觀流體通道的阻抗。在前述方面的任何一個中，去污劑可以是triton-X或tween-20。在前述方面的任何一個中，細胞組分可以是離子(例如，鉀、鈣和鈉)或酶(例如，乳酸脫氫酶)。在前述方面的任何一個中，起因于裂解的性質可以是阻抗。在這個方面，阻抗可以使用自頂向下電極、IDT電極和雙軌電極進行測量。在前述方面的任何一個中，阻抗可以例如使用單個頻率(例如，760Hz)或使用離子敏感性電極(例如，鉀、鈉或鈣離子特異性電極)進行測量。可替代地，起因于裂解的性質可以是質量。在這個方面，質量可以使用微觀或毫微機械共振器進行測量。在前述方面的任何一個中，測量可以包括光學檢測、表面等離振子共振或側向流動擴散測定。在一個優選實施方案中，性質使用熒光探針進行測量，并且離子是鉀。在另一個優選實施方案中，細胞組分是核，并且起因于裂解的性質是阻抗。在另外一個優選實施方案中，微觀流體通道具有10μ1的體積。在上述方法的任何一種中，細胞群體和狀況可以選自表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>“裂解”指細胞膜(例如，植物細胞、動物細胞和細菌細胞的膜)的破壞。為了本發明的目的，術語“裂解”意欲包括細胞膜的完全破壞(“完全裂解”)、細胞膜的不完全破壞(“部分裂解”)和細胞膜的透化。術語“裂解”還意欲包括其他生物膜(例如核膜和線粒體膜)的破壞。“選擇性裂解”指對異質細胞群體(例如人血樣)應用試劑，從而使得裂解所需細胞亞群，同時不希望的細胞仍保持完整。“透化”指細胞膜這樣的破壞，從而使得在相同程度上膜對其正常不可透過的特定細胞內組分能夠逸出細胞，同時其他組分仍保留在細胞內。“細胞組分”指在細胞內或其上發現的任何化學種類或復合物。為了本發明的目的，這個術語意欲包括生物化合物或復合物(例如，酶、核酸、蛋白質、細胞器和細胞膜復合物)，以及其他種類(例如，離子和有機分子)。“至少一種細胞組分的性質”指特定細胞組分的可測量特征。附圖簡述圖IA是顯示阻抗測量設置的圖解。將樣品通過入口(箭標)經由注射器泵遞送到微通道內。圖IB是顯示使用阻抗光譜學測量細胞離子釋放的圖解。在微觀流體設備內分離的靶細胞被裂解，以釋放細胞內離子。這導致體積電導變化的增加，這可以使用表面圖案化電極和阻抗光譜學進行監控，以檢測細胞數目。圖IC-圖IE是顯示電極布局和設備裝配細節的示意圖(C)叉指(IDT)共面電極，(D)簡單雙軌共面電極和(E)自頂向下電極。電極在底部載玻片(對于IDT和雙軌電極設計)或在兩個載玻片(對于自頂向下電極設計)上形成圖案，其中使用標準凈室(cleanroom)技術和金濕法蝕刻方法。所有設備通過使2片載玻片與50μm厚的PDMS墊圈(三角形)結合進行制備。在蓋玻片上鉆孔，并且與PDMS口裝配，以充當樣品入口和出口。圖2A和2B是顯示隨細胞濃度而變的阻抗譜和阻抗變化的曲線圖，其中使用在芯片外(Off-chip)獲得的細胞裂解物。在IDT設備上測量的DI水和具有不同起始細胞濃度的細胞裂解物的(A)阻抗大小和(B)相譜。在每個細胞濃度時在IOO-IO6Hz頻率范圍中執行3-5次掃描。圖2C-2E是顯示隨細胞濃度而變的在重對數尺度中標繪的在760Hz時測量的阻抗大小的曲線圖，其中使用(C)自頂向下電極、(D)IDT電極和(E)雙軌電極。(C)-(E)中的實心點是擬合二參數冪方程的實驗測量。最小二乘方擬合顯示為曲線圖中的實線和方程。誤差條指示來自在單個設備內的3-5次連續測量的標準差。圖3A是顯示隨細胞濃度而變的用于擬合阻抗譜和引出的電導的電路模型示意圖。在我們的研究中使用等價電路，以模擬用于引出體積溶液電導Rstjl的電極/電解質系統，所述Rstjl與細胞離子釋放直接關聯。圖3B和3C是顯示在IDT電極芯片中使用具有3000個細胞/mL細胞濃度的在芯片外細胞裂解物樣品標繪的阻抗大小(B)和相(C)譜的曲線圖。十字是實驗數據并且實線顯示擬合曲線。圖3D-3F是顯示體積電導的曲線圖。Rstjl從使用⑶自頂向下電極、(E)IDT電極和(F)雙軌電極測量的譜引出。使用所有電極幾何結構觀察到測量的體積溶液電導(實心點)和細胞濃度之間的線性關系，并且最佳擬合顯示為(D)-(F)中的實線和方程。(D)-(F)中的誤差條指示來自在單個設備內的3-5次連續測量的標準差。圖4是顯示在熒光顯微鏡下觀察到的在不同濃度低電導率糖溶液中隨時間而變的活細胞百分比的曲線圖。使CD4+T細胞捕獲在抗體固定的設備中，隨后以IOmL/分鐘在不同濃度的糖溶液中流動2分鐘。溶液流動停止后，使細胞在室溫下在這種溶液中溫育8分鐘，并且每30秒在熒光顯微鏡下計數完整細胞數目。通過完整細胞數目除以在每種糖溶液注射前的細胞總數目來計算完整細胞百分比。圖5A是顯示在細胞捕獲和在芯片上(on-chip)裂解的過程期間在760Hz下的阻抗大小的曲線圖。分別的溫育步驟在曲線圖之上標記，并且這些標記的步驟之間的陰影區是在溶液交換過程中的過渡態。在裂解溶液注射前和后10分鐘的阻抗降低與細胞裂解相關，并且用作細胞數目指示物。圖5B是顯示電導變化與在微觀流體設備內捕獲的細胞數目比較的曲線圖。體積溶液電導從阻抗譜中引出，并且采取在裂解溶液中的流動前和后10分鐘的阻抗降低作為計數細胞的指示物。這種電導變化與在微觀流體芯片內捕獲的細胞數目成比例增加，從而暗示固定細胞可以通過其離子釋放的電測量進行計數。關系的非線性可能起于離子在測量時間內的不完全擴散。圖中的每個數據點代表來自1個設備的測量。發明詳述一般而言，本發明的特征在于定量樣品中的細胞或其組分的方法，這通過下述實現使細胞裂解，隨后為至少一種細胞組分的測量。本發明的方法對于定量例如在與細胞大小相比較大的表面積或體積上的小細胞數目尤其有用。在優選實施方案中，本發明的方法在微觀流體設備中執行。在其中需要定量在細胞異質混合物(例如，來自人血樣)內的一種或多種細胞亞群的本發明的方面中，本發明的特征在于所需細胞亞群的選擇性裂解。可替代地或另外地，本發明的特征在于在裂解前分離一種或多種所需細胞亞群。在這個方面，一種或多種所需細胞群體可以以小體積在微觀流體設備中被捕獲。在這些實施方案中，僅裂解且定量所需亞群。I.使細胞裂解的方法本發明的裂解方法包括完全裂解、部分裂解、選擇性裂解和細胞的透化。在一個實施方案中，裂解方法包括化學裂解(例如，用低滲(hyopotonic)溶液)，或使用去污劑例如triton-X,tween-20和其他商購可得的去污劑的裂解或部分裂解，以及裂解物用于細胞或其組分計數的后續分析。在另一個實施方案中，本發明的方法的特征在于電裂解(例如，通過應用足以引起細胞裂解的直流電、交流電或脈沖電場)和裂解物用于細胞計數的后續分析。電裂解可以通過使電極構建到用于測量阻抗的芯片內來完成(例如，參見下文)，或可以用另外的電極組來執行，例如在與用于測量阻抗的電極構建相對的表面上。在另一個實施方案中，本發明的特征在于機械裂解和裂解物用于細胞計數的后續分析。機械裂解方法包括對細胞應用超聲波，使細胞冷凍且融化，使細胞加熱，對細胞使用微尺度或毫微尺度的針、鋒利探針、刀刃和脊以及本領域已知的其他工具在芯片上的勻漿。本發明的特征還在于在性質上是生物學的裂解。例如，裂解可以是由裂解病毒感染的結果，與免疫系統組分相互作用的結果(例如，暴露于補體)，或與成孔生物分子(例如，孔蛋白)相互作用的結果。本發明的特征還在于在細胞異質混合物內的細胞亞群的特異性裂解。在這個方面，誘導裂解的試劑可以與結合部分連接，所述結合部分與在所需細胞亞群上的細胞表面標記特異性結合。可替代地，裂解試劑可以以這樣的濃度或大小引入，所述濃度或大小足以使所需細胞亞群裂解，但不足以使剩余的不希望的細胞裂解。其他裂解方法是本領域已知的。II.測量細胞內容物的方法本發明的特征在于通過測量通過細胞裂解釋放的細胞內內容物來定量細胞的方法。本發明的方法可以是全定量、半定量、或定性的，這依賴于所需精確性。A.電本發明的特征在于用于測量細胞的細胞內內容物的電方法。在一個實施方案中，樣品中的細胞用等滲、非導電溶液(例如，8.5%蔗糖)漂洗。細胞保持完整，同時周圍介質的電導率大大降低，并且測量的阻抗增加。接下來，加入低滲、非導電溶液(例如，2%蔗糖)，裂解細胞。細胞內離子從細胞釋放到介質內導致電導率中的增加，以及阻抗中可測量的降低。因為目前存在于介質中的基本上所有離子都來自細胞，所以細胞的絕對數目可以基于測量的阻抗進行測定。在相同設備中已知參考溶液的事前或后續測量可以用于校準每次測量。在另一個實施方案中，本發明的特征在于使用溫和去污劑以釋放完整細胞核。核的數目可以使用微型coulter計數器進行計數。Coulter計數器通過測量當顆粒經過導電介質中的小孔時阻抗中的變化工作。在另一個實施方案中，本發明的特征在于使用離子敏感性電極或微電極，以檢測特異性離子(例如，鉀、鈉或鈣)的濃度，并且裂解物中的離子濃度可以與捕獲的細胞數目關聯。B.光學本發明的特征還在于用于測量優選在微觀流體設備上的細胞的細胞內內容物的方法。在一個實施方案中，本發明的特征在于基于胞質酶的活性測量的半定量比色法。這個類別中的一個例子是乳酸脫氫酶(LDH)測定，這測量細胞質酶LDH在其從細胞中釋放后的活性。這個實施方案可能涉及用表面活性劑裂解固定的細胞(例如，富集的群體)以釋放LDH,隨后使裂解物與酶促溶液混合，所述酶促溶液在與LDH反應后改變顏色。最終溶液的光學吸光度在使用已知細胞濃度的裂解物獲得的標準曲線上作圖，以估計裂解細胞數目。在另一個實施方案中，本發明的特征在于使用表面等離振子共振(SPR)的半定量光譜法。在這個實施方案中，裂解物中的特定組分例如蛋白質可以使用特異性抗體或其他捕獲部分捕獲在金屬表面上，并且捕獲的物質可以使用sra光譜學進行定量。在另一個實施方案中，本發明的特征在于用于檢測裂解物溶液中的鉀離子的基于寡核苷酸的熒光探針。熒光信號可以與細胞數目關聯。在另一個實施方案中，本發明的特征在于對于細胞裂解物的毛細管離子電泳。這種方法可以與UV吸光度的測量組合使用，以測定與細胞濃度關聯的特異性離子的存在。在另一個實施方案中，本發明的特征在于基于側向流動擴散的測定。在這種方法中，細胞數目基于細胞裂解物中分子內容物的擴散進行測定。識別且與細胞裂解物中的靶分子結合的分子帶可以形成圖案。可以將裂解物引入側向流動設備中，并且在特定濃度閾值下通過靶分子行進的距離可以與原始樣品中的細胞數目關聯。C.機械本發明的特征在于用于定量細胞的細胞內內容物的機械方法。質量是可以用于定量細胞數目的基本性質。在這個實施方案中，細胞裂解物可以使用微觀和毫微機械共振器進行干燥并且稱重，所述共振器允許測量下至毫塵克(attogram)范圍的質量。可替代地，特異性裂解物組分可以使用抗體官能化(或其他捕獲部分)支架進行捕獲且稱重。特異性蛋白質的質量隨后可以與裂解物中的細胞數目關聯。III.適應癥本文描述的方法可以廣泛用于自動化檢測和計數任何細胞群體。該方法用于檢測和計數樣品中的所有細胞，或與樣品的剩余細胞分離的細胞。本發明特別適合于自動化檢測和定量相對低濃度的細胞，例如100-1000個細胞/毫升。在一個實施方案中，本發明的特征在于來自血液樣品的CD4+細胞的計數。本發明還可以用于例如計數來自血液的罕見上皮癌細胞，計數在其表面上表達的指示疾病的特異性抗原受體的細胞，計數來自血液的靶嗜中性粒細胞，計數來自血液的特異性單核細胞，并且計數在其他體液例如尿、腦脊液、唾液和痰中的細胞。在本發明的一些方法中，具有特定細胞表面抗原的細胞的定量用于診斷或評估特定醫學狀況。細胞可以首先使用對于所需細胞表面抗原特異性的結合部分進行捕獲，并且隨后使用上述方法中的任何一種進行定量。表2闡述了其中特異性細胞計數是多種醫學和臨床診斷學所需的應用的示例性列表。表2還闡述了可以用于分離所示細胞群體的示例性捕獲分子。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>此外，應當指出細胞計數的組合將對于多種醫學應用有用。這些可以包括⑴血細胞分類計數-包括嗜中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和血小板，()兒科AIDS診斷(例如，⑶4與⑶8比)，(iii)瘧疾(PfEMPs(寄生蟲衍生蛋白質)實驗對象組)，(iv)用于監控且區分病毒和細菌感染的單核細胞和淋巴細胞。此外，本發明包含了其中單獨或組合捕獲特異性細胞的任何細胞計數。IV.實施例為了解決檢測固定在相對大表面積上或在大體積中的少量細胞的需要，我們研究了細胞內離子從固定在微觀流體通道中的裂解細胞的釋放，其中使用表面形成圖案的電極，以通過阻抗光譜學測量體積電導變化。哺乳動物細胞包含相當大量的離子，并且經過細胞膜的離子轉運的緊密控制對于正常細胞功能和對周圍環境的應答是重要的。當細胞懸浮于低滲介質中時，細胞內離子的被動擴散和主動抽吸至細胞外環境用于調整至低滲環境。此處，我們顯示通過細胞內離子的控制釋放，可以執行阻抗測量以測定微觀流體通道中存在的細胞數目。使用捕獲且固定的CD4T細胞作為例子，根據我們在從全血中分離這些細胞的先前成功，我們證實細胞裂解物阻抗光譜學具有20個細胞/μL的檢測閾值，這足夠用于臨床和研究應用。基于細胞離子釋放的阻抗光譜學的建模由于離子釋放的電導與電容變化比較當細胞釋放離子時，影響體積電導和電容。在一般的哺乳動物細胞中，細胞質^S^^150mM(Aidley,等人，IonChannels:MoleculesinAction,CambridgeUniversityPress,Cambridge,UK,1996.)。給定0.2pL的體積，一般的淋巴細胞因此包含總共3xl0_14摩爾離子。在IOyL微型室(在這個研究中使用的微觀流體設備的體積)中裂解后，這些離子促成離子濃度的3nM增加。因此，對于每100個淋巴細胞，在10μL室中的完全裂解將使溶液離子濃度增加0.3μΜ。如果我們通過假定所有釋放的離子都是鉀和氯離子，并且鉀和鈉離子具有可比較的電遷移率(Ohno，編輯，ElectrochemicalAspectsofIonicLiquids,ffiley-Interscience,c2005,Hoboken,NJ,2005.)來簡化情況，那么溶液電導率可以根據離子濃度中0.3μM的增加計算為增加0.03/MQ-cm(0megaEngineering,TechnicalConductivityandResistivity.Accessed:December30,2006.)。這個電導率變化超過用去離子水可見的增加(0.055/MQ-cm)的50%。在比較中，電容僅微弱地依賴于在稀釋溶液中的離子濃度。對于氯化鈉溶液，例如，對于在稀釋溶液中離子濃度(<IOOmM)中的每納摩爾增加，介電常數僅降低10_7。使用相似計算，相對于去離子水(80的介電常數)，從100個淋巴細胞中釋放的總離子僅使溶液電容減少4xl0_7。這個變化比體積電導中的變化低幾個數量級。因此，細胞離子釋放主要促成溶液電導變化，這可以使用阻抗光譜學容易地檢測。阻抗譜的建模為了理解隨細胞數目而變的溶液電導，我們執行建模研究以從使用表面形成圖案的電極中獲得的阻抗譜弓丨出在微觀流體設備中的體積電導。電解質溶液中的電極可以使用如圖3A中所示的等價電路進行建模(Gomez-Sjoberg，等人，J.Microelectromech.Syst.，2005，14，829-838.Gomez，等人，Sens.ActuatorB-Chem.，2002，86，198—208.)，其中Cdi，是介電電容(它包含來自電極周圍的所有材料，包括溶液的介電貢獻)，Rstjl是體積溶液阻抗(經過本體溶液的電荷轉運)，Zdl是界面阻抗(所謂的Warburg阻抗)，其解釋在界面處的離子梯度中的變化，并且Rsct是在芯片上的線路的電阻。界面阻抗可以表示為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(1),其中j=V("I)，η和B是依賴于電解質和電極性質的參數。這是將一直正確地擬合在整個頻率范圍內的測量數據的最簡單模型。材料與方法化學制品蔗糖購自MallinckrodtBaker，Inc.(Paris，Kentucky)。葡萄糖和錐蟲藍溶液(0.4%)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。Ficoll-PaquePlus購自GEHealthcareAmershamBiosciencesCorp(Piscataway，NJ)。3_巰基丙基三甲氧基硅烷購自Gelest(Morrisville，PA)。金載玻片得自FisherScientific(FairLawn，NJ)。磷酸緩沖鹽水(PBS)得自Mediatech(Herndon，VA)。凍干的牛血清清蛋白(BSA)得自AldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI)。偶聯劑GMBS(N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧琥珀酰亞胺酯)和NeutrAvidin得自PierceBiotechnology(Rockford,IL)。生物素化的小鼠抗人抗CD4(克隆13b8.2)購自BeckmanCoulter(Somerset,NJ)。設備制造3種類型的設備，從而實現3種不同的電極設計，包括叉指(IDT)共面電極、簡單雙軌共面電極和上及下電極(圖1C-D)。金電極使用標準光刻法和金濕法蝕刻方法進行構建。IDT電極指是3.Smmx15μm，具有35μm的間距。它們覆蓋在微觀流體通道內的整個區域，并且插入3個相同區段內，以探測室的不同部分。關于IDT電極的連接軌和簡單雙軌電極的軌是100μm寬，具有3.8mm的間距。上下電極是5cmx4mm金墊。對于所有設備，頂端和底部載玻片(75mmx25mm)與具有5cmx4mm開口的50μm厚的PDMS墊圈結合，形成閉合的微觀流體通道。PDMS墊圈通過使PDMS旋涂(spin-coating)在透明載玻片上，隨后手工切割所需大小的窗口進行制備。在頂端玻璃上鉆2個孔，并且與PDMS口裝配，以形成流體入口和出口。用于測量來自在芯片外裂解物的阻抗的設備在裝配后直接使用。用于細胞捕獲和在芯片上裂解的設備用單克隆CD4抗體進行官能化，并且用包含1%BSA和ImMEDTA的PBS進行預處理，如先前所述(Cheng，等人，LabChip,2007，7，170-178.)。細胞制備和在芯片上的細胞分離外周血單核細胞(PBMCs)通過Ficoll密度梯度離心(Ferrante，等人，J.Immunol.Methods,1980，36，109-117.English,等人，J.Immunol.Methods,1974，5，249-252.)由新鮮抽取的血液制備，并且維持在RPMI-1640培養基中。為了分離⑶4+T淋巴細胞，將維持在RPMI-1640培養基中的PBMCs以5μL/分鐘的流速注射入抗⑶4抗體官能化的微電極設備內進行不同時間長度，隨后使用包含BSA和ImMEDTA的PBS從設備中漂洗未結合的細胞。在微觀流體設備內捕獲的細胞數目在相差顯微鏡下進行人工計數(Cheng，等人，LabChip，2007，7，170-178.)。用于阻抗測量的在芯片外的樣品制備為了制備在芯片外的細胞裂解物，培養的PBMCs使用血細胞計數器進行人工計數，隨后用RPMI-1640在印pendorf管中稀釋至0_3，500個細胞/μL的不同濃度，具有ImL的終體積。其后，使細胞在1200g下沉淀5分鐘，并且用ImL低導電介質(8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖)輕輕洗滌3次。最后一次洗滌后，使細胞重懸浮于ImL無菌去離子水中，并且在室溫下靜置20分鐘用于細胞裂解。隨后從最低濃度開始以15μL/分鐘的流速，將每種細胞裂解物注射入微電極設備內，并且在信號穩定后獲得阻抗譜。設備在裂解物注射之間用去離子水以50μL/分鐘的流速漂洗，直至阻抗測量達到關于去離子水的原始值。使用糖溶液的在芯片上的細胞裂解的光學表征為了鑒定在控制速率下裂解細胞的低導電介質，我們使包含8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖的低電導生存力維持溶液稀釋至不同終濃度。使用注射器泵(HarvardApparatus)將這些溶液以15μL/分鐘的流速順次注射入具有捕獲的CD4+T淋巴細胞的微觀流體通道內進行1分鐘，并且允許細胞在每種溶液中裂解10分鐘。這些細胞使用Fluo-3進行預染色，并且通過表面固定的抗體在微觀流體通道中捕獲，其中使用先前描述的方法(Cheng，等人，LabChip，2007，7，170-178.)。在實驗過程自始至終每30秒獲取熒光圖像，并且計數熒光細胞數目以估計完整細胞數目。用于阻抗光譜學的在芯片上的制備為了檢測表面固定的細胞，使用包含8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖的低電導率洗滌溶液以20μL/分鐘的流速從通道中洗掉在PBS緩沖液中存在的離子，直至阻抗信號穩定。接下來，包含2%蔗糖和0.07%葡萄糖的低電導細胞裂解溶液以10μL/分鐘的速率流動1分鐘用于細胞裂解。引入裂解溶液后，流動停止，并且細胞在這種溶液中維持另外10分鐘，以允許細胞裂解達到穩定狀態。細胞裂解后，將去離子水以20μL/分鐘的流速注射5-10分鐘以獲得參考譜。整個過程自始至終連續監控阻抗。阻抗光譜學測量使用Agilent4284LCR計(AgilentTechnologiesInc.，PaloAlto,CA)獲得阻抗測量。微電極設備通過鉬探針與LCR計連接；實驗設置的示意圖顯示于圖IA中。阻抗測量過程通過定制的LabView(NationalInstrumentsCorp.,Austin,TX)虛擬儀器和GPIB界面自動化。阻抗譜在ΙΟΟΗζ-ΙΜΗζ的頻率范圍中進行測量，其中使用1.5的頻率增加因子，和250mV的振幅。結果在這個研究中使用的所有設備都由在具有5CmX4mmX50ym尺度的通道內形成圖案的表面微電極組成。當用特異性抗體固定并且在控制流動條件下操作時，這個通道設計先前已顯示以高效率(>90%)從未加工的全血中特異性分離⑶4+T淋巴細胞(純度>95%)(Cheng，等人，LabChip，2007，7，170-178.)。在目前的研究中，我們進一步使微電極在抗體官能化的微通道中形成圖案用于電檢測分離的細胞的目的。使用對于在芯片上的細胞裂解和計數合適的電極布局(圖1C)，由于在通道內85%親和表面面積的維持，對于從全血中的⑶4+T細胞分離，分離純度和得率保持超過90%。使用在芯片外的細胞裂解物的阻抗測量為了測試使用阻抗光譜學的來自原代細胞的離子釋放的檢測靈敏度，我們首先在具有去離子水的印pendorf管中使已知濃度的PBMCs裂解，并且使用3種不同電極設計的微觀流體設備測量裂解物的阻抗上下電極、IDT共面電極和簡單雙軌共面電極。圖2A和2B顯示對于使用IDT電極測量的0-3，000個細胞/μL的細胞濃度隨頻率而變的阻抗大小和相譜。我們觀察到每個大小譜具有2個區域——在IOOHz-IOkHz頻率范圍中的恒定阻抗區和在更高頻率范圍(>100kHz)下阻抗減少的區域。隨著逐漸增加的細胞濃度，在低頻率范圍中在阻抗大小中存在一致減少，和相峰值至更高頻率的移動。這強烈暗示細胞濃度的半定量測量可以使用細胞離子釋放進行測定。得自其他2種電極設計的阻抗大小譜顯示相似的性質，但不同的絕對值；使用雙軌電極測量的阻抗大小比來自IDTs的那些高2個數量級，來自IDTs的那些比上下電極高2個數量級。其中在大小譜上阻抗開始降低的轉變點對于上下電極在約IOkHz時發生，但對于簡單雙軌電極移動至約IkHz。為了檢查阻抗譜區分細胞濃度的能力，我們對于3種類型的電極設計標繪出與細胞濃度比較在760kHz下的阻抗大小(圖2C-2E)。由于對于所有3種電極在這個頻率下阻抗大小的最大分離，我們選擇760kHz作為測量頻率。阻抗大小對細胞濃度的應答在重對數尺度曲線中是線性的，類似于在與我們的研究相關的范圍中在簡單電解質溶液的電阻和溶質濃度之間的關聯(OmegaEngineering,TechnicalConductivityandResistivity.AccessedDecember30,2006.這指出來自細胞的離子內容物的釋放和其中細胞裂解的介質的后續電導與細胞數目成比例。此外，使用離子釋放以檢測細胞看起來是非常靈敏的，并且可以檢測在低導電溶液中少至20個細胞/微升。阻抗建模和參數引出因為細胞離子釋放主要促進體積電導變化，所以我們使用圖3A中所示的電路模型以擬合阻抗大小和相譜，其中使用在MATLAB中的最小二乘方標準，以引出體積電導值Gstjl=l/RS0lo通過迭代模型中的每個初始條件，模型和實驗數據之間的最小二乘方誤差降至IJ最氐，至IO-13或更小的值(Vetter,Electrochemicalkineticstheoreticalandexperimentalaspects,NewYork:AcademicPress,1967.EvgenijBarsoukov禾口J.R.Macdonald,Impedancespectroscopy:theory,experiment,andapp1ications,Hoboken，NJ.=Wiley-Interscience,c2005.，2005.)。隨后終止擬合，并且引出且記錄參數。圖3B和3C顯示使用來自包含3，000個細胞/μL溶液的裂解物的阻抗大小和相譜的一般擬合測量(十字)和擬合曲線(實線)之間的緊密匹配指出所選擇的電路模型良好地預測實驗系統。從所有譜中引出體積電導后，我們標繪隨細胞濃度而變的體積溶液電導(圖3D-3F中的實心圓圈)。對于所有3種電極設計，溶液電導隨著促成離子濃度的細胞數目線性增加，從而證實我們關于離子釋放和溶液電導變化與細胞數目成比例的假設。我們還觀察到Rstjl值控制在IOO-IOkHz的中間頻率范圍中的阻抗大小測量。這指出體積電導可以通過測量在單個頻率下的阻抗大小進行估計，其中使用簡單的手提式設置代替LCR計。電導曲線的斜率代表每種電極設計的測量靈敏度。我們觀察到上下電極具有最高的檢測靈敏度(9.18Χ10_7(歐姆·細胞))，而簡單雙軌電極具有最低的靈敏度(9.92ΧΙΟ—11"歐姆細胞))；IDT電極的檢測靈敏度在兩者之間(1·90Χ10-8/(歐姆細胞))。為了容易顯現在微觀流體設備內的細胞以及細胞離子釋放的靈敏檢測，我們選擇IDT電極用于進一步的細胞捕獲和在芯片上的裂解實驗。使用低滲糖溶液的在芯片上的細胞裂解的光學表征證實使用在芯片外的裂解物和阻抗光譜學通過其離子釋放檢測細胞的可行性后，我們對測試這種策略檢測且定量在微觀流體設備內捕獲的細胞有興趣。為了完成在芯片上的細胞裂解物阻抗光譜學，我們需要首先用非導電、等滲溶液替換富含電解質的全血或鹽水緩沖液，以減少在微觀流體通道中的本底電導率且確立基線測量。使用DI水用于細胞裂解的在芯片外的實驗無法直接應用于在芯片上的細胞裂解，因為懸浮于DI水中的細胞立即裂解，并且裂解物可以在阻抗測量前從芯片中洗掉。給定細胞在其中裂解的介質盡可能是非導電的需要，以及洗掉來自血樣自身的離子和蛋白質內容物的需要，我們評估了作為細胞洗滌和細胞穩定溶液的不同的低導電介質。我們發現包含8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖的基于糖的洗滌溶液滿足離子去除和細胞穩定的2個標準。這種溶液的阻抗接近于去離子水，但細胞生存力可以維持超過60分鐘(Chiou，等人，Nature2005，436，370-372.)。這種溶液用去離子水進一步稀釋可以預期減少溶液摩爾滲透壓濃度，從而使得裂解速度可以通過稀釋因子中的調整得到控制。為了測試在低電導率糖溶液中的淋巴細胞生存力和裂解，我們分離在官能化微通道內的來自PBMCs的CD4+T淋巴細胞，如所述的(Cheng，等人，LabChip，2007，7，170-178.)。洗掉未結合的細胞后，我們引入低導電8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖洗滌溶液，以及更低滲的糖溶液。糖溶液流動停止后，通過熒光顯微鏡術每30秒計數在成像區域(600mmx800mm)上的完整細胞數目。圖4顯示在8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖溶液中與時間比較的活細胞百分比，并且在這種溶液的不同稀釋度中。淋巴細胞在8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖中保持完整至少30分鐘；裂解在更稀釋的糖溶液中加速。基于這些結果，8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖溶液用作初始洗滌溶液，并且選擇包含2%蔗糖和0.07%葡萄糖的溶液用于在芯片上的細胞裂解。用這種組合，我們觀察到在溶液交換的第一分鐘中最高達15%的捕獲細胞裂解，從而使由于流動的離子喪失降到最低，而約80%的細胞在10分鐘內裂解，從而使得及時測量成為可能。用于在芯片上的細胞裂解的阻抗光譜學就細胞洗滌和裂解最優化無離子、低導電溶液后，我們接下來測量在芯片上的細胞捕獲和細胞裂解后的阻抗變化。從培養基中捕獲CD4+T細胞，用PBS溶液漂洗，用等滲的8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖溶液再次漂洗。測量阻抗基線后，將低電導性細胞裂解溶液(2%蔗糖/0.07%葡萄糖)引入微觀流體設備內，并且允許細胞裂解10分鐘。用去離子水獲得參考譜。實驗自始至終，連續獲得阻抗譜。然而，在100-10，OOOHz之間的單個頻率下的阻抗測量非常良好地反映起于細胞裂解的溶液電性質的變化。例如，圖5A顯示在芯片上的細胞裂解前和后在760Hz的頻率下獲得的阻抗大小的一般變化。當細胞在PBS中時，由于鹽水緩沖液的高離子濃度，阻抗大小保持在低千歐姆范圍中。在引入低導電的8.5%蔗糖/0.3%葡萄糖洗滌溶液后，阻抗急劇增加至超過10千歐姆。當細胞在洗滌溶液中維持于穩定狀態時，阻抗大小略微減少，可能是由于在低滲環境中的低水平細胞離子釋放。注射無離子2%蔗糖/0.07%葡萄糖裂解溶液后，我們注意到初始阻抗突升。這隨后為阻抗的突然下降和隨后較緩慢的阻抗減少。在細胞裂解過程中的這種兩相阻抗降低匹配在相同溶液中細胞裂解的光學觀察(圖4)，從而暗示阻抗大小的減少起于捕獲細胞的裂解。應用上文描述的擬合程序后，在裂解溶液引入前和后10分鐘，我們從阻抗譜和電導變化中引出體積電導。當我們比較這個電導變化與在微觀流體設備內的手工細胞計數時(圖5B)，顯而易見的是體積電導變化與促成離子的捕獲細胞數目成比例。這成功地證實細胞可以通過細胞裂解物的阻抗和電導的電測量在微觀流體設備內進行檢測和計數。討論我們在此處描述了使用阻抗光譜學通過基于細胞離子釋放的體積電測量檢測且定量微觀流體設備中的固定細胞的方法。由于其對于管理HIV感染患者的臨床重要性(DepartmentofHealthandHumanServices(October6,2005)GuidelinesfortheUseofAntiretroviralAgentsinHIV-I-InfectedAdultsandAdolescents.Accessed20March2006.)，我們選擇CD4+T淋巴細胞作為用于檢測的靶細胞。微觀流體CD4計數器的最直接用途將是區分200個細胞/μL的⑶4閾值用于治療決策(CentersforDiseaseControlandPreventionRevisedclassificationforHIVinfectionandexpandedsurveillancecasedefinitionforAIDSamongadolescentsandadultsinMMWRMorbidityandMortalityWeeklyReport1-19(1992).WorldHealthOrganization(4November2005)PatientMonitoringGuidelinesforHIVCareandART.Accessed20March2006.)。細胞裂解物阻抗光譜學的檢出限明顯符合這個要求，并且顯示在開發可以即時現場使用的微觀流體CD4計數診斷工具中的希望。此外，這種細胞計數策略并不限于血細胞的檢測，還可以應用于具有豐富離子內容物的任何生物靶。就我們所知，分離且檢測在平方毫米大小面積上的1個細胞，或檢測在微升體積中的20個細胞的能力，代表使用非光學方法計數固定細胞的最靈敏方法。在本研究中使用的微芯片設備由在微觀流體通道內制造的表面形成圖案的微電極組成。微通道壁用單克隆抗CD4抗體進行官能化，并且電極使用牛血清清蛋白進行鈍化。選擇通道設計和樣品流動條件，以確保以高效率從全血中特異性分離⑶4+T淋巴細胞，如先前所述(Cheng，等人，LabChip，2007，7，170-178.)。用對于在芯片上的細胞裂解和計數合適的電極布局(圖1C)，由于>85%親和表面面積的維持，來自全血的分離純度和得率保持超過90%。當在光學顯微鏡下觀察時，非常少細胞非特異性附著在電極表面上，從而證實用于細胞分離預期的設備性能。使用表面電極通過完全細胞裂解和體積電導測量進一步檢測分離的細胞。作為鑒定產生最佳檢測靈敏度的頻率范圍的努力，我們在這個研究中獲得隨頻率而變的阻抗大小和相譜，并且使譜擬合電路模型以引出體積電導。用最佳頻率范圍(在圖2A中的100-10,000Hz)的了解和Rstjl值在這些頻率下控制阻抗大小的觀察，人們通過使用手提式設置監控在單個頻率下(例如760Hz)的阻抗大小，可以以秒估計體積電導。因此，從細胞捕獲到細胞裂解和檢測的整個過程可以在少于10分鐘內完成。特別地，對于HIV感染患者中⑶4細胞的檢測和監控，200個細胞/μL用作臨床決策點。我們在此處顯示免疫親和細胞捕獲方法與電檢測法的整合可以滿足這個檢測閾值。我們描述的微觀流體設備能夠從血液中分離特異性細胞類型并且定量細胞數目，并且可以充當用于手提式儀器的一次性使用的藥液筒，以提供在即時現場背景中簡單、快速和花費得起的細胞計數。與光學相反，電檢測細胞的能力呈現了下述關鍵優點(i)無標記檢測，(ii)可自動化，和對開發小型臺式或手提式儀器的適應性，(iii)與微觀流體設備的可整合性；和(iv)在生理學和臨床上相關的細胞濃度范圍中的檢測靈敏度。與計數細胞的其他電方法相比較，細胞裂解物阻抗光譜學顯示檢測在靈敏度中幾個數量級的改善。這是由于細胞在無離子、低電導率糖溶液中穩定時減少的本底電導和在低滲裂解后從哺乳動物細胞釋放的豐富的離子內容物。溶液電導在細胞裂解過程中的變化從阻抗測量譜中引出。我們證實細胞裂解物的體積電導與原始細胞數目成比例，這構成細胞裂解物阻抗光譜學的基礎。這種方法足夠靈敏以檢測在具有10μL體積和2cm2腳印(footprint)的設備中的低至20個細胞/微升，這代表<10_4體積替換和<10_4表面覆蓋度。為了測量在微觀流體設備中的體積電導，我們使微通道內的表面電極形成圖案并且使用簡單電路對阻抗譜建模，所述簡單電路包含與總體溶液電阻(RsJ總和和界面阻抗(Zdl)平行的介電電容(Cdi)。根據實驗擬合，我們觀察到Zdl的大小一般比溶液電阻Rstjl小得多。因此，Rstjl在低頻率范圍下(依賴于電極幾何結構<I-IOkHz)控制電路，從而導致相對恒定的阻抗，不依賴于頻率變化。在低頻率范圍中Rstjl的支配也作為相譜的凸峰觀察至IJ。隨著溶液的離子濃度增加，體積溶液電阻減少，從而使其中Rstjl支配的范圍移動至更高頻率，并且降低在那個相同范圍中的總體阻抗。另一方面，在高頻率范圍中(IO-IOOkHz),介電電容器(Cdi)占支配地位，從而導致隨著頻率增加的阻抗大小降低。在甚至更高的頻率下(>100kHz)，電化學設備和連接線的電感都促成阻抗譜，從而導致所有阻抗曲線的合并,這與溶液電導率無關(Katz，等人，Electroanalysis,2003,15，913-947.)。使用阻抗光譜學在微型設備中監控生物離子釋放是研究微生物代謝和生長的良好確立的技術(Gomez-Sjoberg，等人，J.Microelectromech.Syst，2005，14，829-838.Gomez，等人，Sens.ActuatorB-Chem.，2002，86，198-208.)。然而，相似的方法先前對于哺乳動物細胞尚未報告，可能是由于其對無離子環境的不耐受性，所述無離子環境是減少用于通過細胞釋放的離子的靈敏測量的本底電導所必需的。我們在此處證實在無離子糖溶液中維持原代細胞生存力的可能性和通過阻抗光譜學測量由于細胞離子釋放的體積電導變化的可行性。這個策略在原理上不同于檢測貼壁細胞的非光學策略，例如表面阻抗光譜學、場效應傳感器和機械支架(Koch，等人，J.Micromech.Microeng.，1999，9，159-161.Ehret,等人，Biosens.Bioelectron.,1997,12,29-41.Fromherz,等人，Science,1991，252，1290-1293.Bull，等人，Am.J.Clin.Pathol.，1965，44，678和Tiruppathi，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，1992，89，7919—7923.Giaever,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，1991，88，7896-7900.)。這些方法基于檢測細胞的電或物理性質和周圍介質之間的差異。這種差異一般是小的；因此特征性傳感元件和靶實體通常具有可比較的尺寸用于靈敏檢測，除非差異是人工增強的(Katz,等人，Electroanalysis,2004，16，19-44.Wang，Anal.Chim.Acta，2003，500，247-257.)。相比之下，在我們的方法中，電信號通過利用在靶細胞內預先存在的大量離子得到放大。這允許以非常低表面覆蓋度或體積替換靈敏檢測細胞，無需顯著的另外操作。我們策略的另一個優點是傳感器設計中的靈活性。使用簡單雙軌、共面電極或上下電極靈敏測量體積阻抗的可能性指出，人們可以使用簡單金屬板或線以用更不復雜的技術實現我們的方法，而無需犧牲檢出限。當比較3種電極幾何結構時，上下電極顯示最高的檢測靈敏度，而簡單雙軌電極具有最低的檢測靈敏度。假定流體通道中的溶液是簡單導體，在每種條件下測量的理論電導可以使用下面等式進行計算G=omA/L(2)其中σ是溶液電導率，A是在電極之間的溶液橫斷面面積，L是電極之間的間距，并且m是電極重復。因為溶液電導率不依賴于設備設計，所以這種幾何因素基本上決定測量靈敏度。當幾何因子(mA/V)就本研究中使用的3種電極設計進行計算時，我們對于上下、IDT和簡單電極分別獲得400、150和0.065cm的值。這個幾何因子順序匹配我們的來自電導圖的測量靈敏度(圖3d-3f)。然而，當我們使用Eq.2計算理論電導時，這通過假定每個細胞在完全裂解后釋放10_14摩爾離子，預測的電導比使用在芯片外的裂解物獲得的測量高1-3個數量級，從而指出在體積中的離子不促成導電至相同的水平。事實上，DeSilva等人已假定通過與固定蛋白質橋接的面內電極島的電導通過水合蛋白質層的離子電導控制(Desilva，等人，Biosens.Bioelectron.，1995，10，675-682.)。將他們的模型應用于我們的系統，占支配地位的電導層可以接近于基質，并且比通道尺寸薄得多，從而解釋了測量和使用Eq.2計算的電導之間的偏差。當使用IDT電極在芯片上和在芯片外裂解實驗之間比較阻抗大小時，我們還觀察到數量級差異。這個差異可能解釋這2種類型設備的分別制備用于在芯片外裂解物實驗的設備不實施表面修飾，而用于在芯片上裂解的那些在電極之間的縫隙中包含多層化學制品和蛋白質，從而改變縫隙的電性質。此外，用于在芯片上裂解實驗的電極用清蛋白預處理，這可能改變在電極上的電子轉移動力學和離子擴散特征(Katz，等人，Electroanalysis，2003，15,913-947.)。盡管在這2種類型設備之間的絕對阻抗大小中的差異，使用在相同制備下的設備獲得的測量清楚地顯示可比較的性能，如用參考溶液譜觀察到的。應當指出的有趣觀察是當使細胞維持在低導電洗滌溶液中時的輕微阻抗降低。這可能指出來自捕獲的細胞的離子釋放，盡管在光學顯微鏡術下有完整形態學。因為洗滌溶液是輕微低滲的(270m0sm)，所以當首先暴露于洗滌溶液時細胞可能膨脹。已知瞬時滲透膨脹和隨后的調節性體積減少(RVD)引起由K+和Cl—通道的平行激活誘導的KCl流出(Pedersen,等人，Comp.Biochem.Physiol.A-Mol.Integr.Physiol.，2001，130，385-399.Okada,等人，J.Physiol.-London,2001,532,3-16.Pasantes-Morales,等人，Neurochem.Res.，2000,25，1301-1314.Charras,等人，Nature2005，435，365-369.)，這可以導致觀察到的溶液電導減少。這個觀察暗示可能使用電方法直接研究對低滲溶液和RVD的細胞應答。與基于細胞大小的光學測量的常規方法相比較，此種測量可以提供更佳的靈敏度，所述常規方法是低流通量的并且傾向于測量誤差。響應環境摩爾滲透壓濃度中的變化的細胞離子釋放和體積調整還可以解釋如圖4中觀察到的異質細胞裂解。因為已報告記憶和天然T細胞包含不同的離子儲備(Sigova，等人，FEBSLett.，1999，447，34-38.)，所以這些細胞具有調整至低滲條件的不同能力，并且顯示不同的裂解速度是不驚訝的。其他實施方案上述說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在此引入作為參考。在不背離本發明的范圍和精神的情況下，本發明的所述方法和系統的各種修飾和變化對于本領域技術人員將是顯而易見的。盡管本發明已結合具體實施方案進行了描述，但應當理解如要求保護的本發明不應不當地限制于此種具體實施方案。事實上，對于本領域技術人員顯而易見的用于執行本發明的所述模式的各種修飾預期在本發明的范圍內。其他實施方案在權利要求中。權利要求一種計數樣品中的細胞的方法，其包括將所述樣品引入通道內；使所述通道內的所述細胞裂解；并且測量起因于所述裂解的至少一種細胞組分的至少一種性質；其中所述細胞組分指示所述通道中裂解的細胞數目。2.權利要求1的方法，其中所述細胞組分是離子。3.權利要求2的方法，其中起因于所述裂解的所述性質是阻抗。4.權利要求2的方法，其中所述性質使用熒光探針進行測量，并且所述離子是鉀。5.權利要求1的方法，其中所述細胞組分是酶。6.權利要求5的方法，其中所述酶是乳酸脫氫酶。7.權利要求1的方法，其中所述測量包括光學檢測。8.權利要求1的方法，其中所述測量包括使用表面等離振子共振。9.權利要求1的方法，其中所述測量包括使用側向流動擴散測定。10.權利要求1的方法，其中所述細胞組分是核，并且其中起因于所述裂解的所述性質是阻抗。11.權利要求1的方法，其中起因于所述裂解的所述性質是質量。12.權利要求11的方法，其中所述測量包括使用微觀或毫微機械共振器。13.權利要求1的方法，其中所述通道是微觀流體通道。14.權利要求3的方法，其中所述阻抗使用選自下述的電極進行測量自頂向下電極、IDT電極和雙軌電極。15.權利要求3的方法，其中所述阻抗在單個頻率下進行測量。16.權利要求15的方法，其中所述單個頻率是760Hz。17.一種計數樣品中的細胞的方法，其包括下述步驟將所述樣品引入通道內，將非導電溶液引入所述通道內；對所述通道應用電場；測量所述通道的阻抗；用裂解性非導電溶液替換所述非導電溶液，并且允許至少一種細胞裂解；對所述通道應用電場；和測量所述通道的阻抗；其中裂解后所述阻抗中的減少指示所述樣品中所述細胞的數目。18.權利要求17的方法，其中所述阻抗使用選自下述的電極進行測量自頂向下電極、IDT電極和雙軌電極。19.權利要求17的方法，其中所述通道是微觀流體通道。20.權利要求1或17的方法，其中所述細胞選自哺乳動物、真菌、原生生物和細菌細胞。21.—種診斷受試者中的狀況的方法，其包括(a)將包含細胞群體的樣品引入通道內；(b)使所述通道內的所述細胞群體裂解；和(c)測量起因于所述裂解的至少一種細胞組分的至少一種性質；其中所述細胞組分指示所述通道中裂解的細胞數目，并且所述細胞數目對于所述狀況是在診斷上有價值的。22.權利要求21的方法，其中所述樣品是人血樣。23.權利要求22的方法，其中所述細胞群體包括CD4輔助細胞。24.權利要求23的方法，其中所述細胞群體由CD4輔助細胞組成。25.權利要求21的方法，其中所述細胞群體和所述狀況選自表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>26.一種用于計數樣品中的細胞的試劑盒，所述試劑盒包括設備、非導電溶液和裂解性非導電溶液，其中所述設備包括微觀流體通道和電極，以測量所述微觀流體通道的阻抗。27.權利要求26的試劑盒，其中所述電極選自自頂向下電極、IDT電極和雙軌電極。28.權利要求27的試劑盒，其中所述非導電溶液是糖溶液。29.權利要求27的試劑盒，其中所述裂解性非導電溶液包括去污劑。30.權利要求29的試劑盒，其中所述去污劑選自triton-X或tween-20。31.權利要求27的試劑盒，其中所述電極是離子敏感性電極。32.權利要求31的試劑盒，其中所述離子敏感性電極特異性檢測選自鉀、鈉和鈣離子的離子濃度。33.權利要求26的試劑盒，其中所述微觀流體通道具有10yl的體積。全文摘要本發明的特征在于定量樣品中的細胞的方法，這通過下述實現，使細胞裂解，隨后為至少一種細胞內組分的測量。本發明的方法對于定量例如在與細胞大小相比較大的表面積或體積上的小細胞數目尤其有用。在優選實施方案中，本發明的方法使用微觀流體設備執行。文檔編號G06M11/02GK101828192SQ200880020891公開日2010年9月8日申請日期2008年4月21日優先權日2007年4月20日發明者D·伊里米亞,L·扎米爾,L·楊,M·托納,R·巴什爾,U·德米爾奇,W·羅德里格斯,X·程,Y·-S·劉申請人:綜合醫院公司;普渡研究基金會