專利名稱：：以雙螺旋寡核酸干擾mRNA作為有效的抗癌劑的制作方法
技術領域：
：本發明是提供一種應用雙股寡核酸(oligonucleotides)干擾有關癌化(carcinogenesis)基因的mRNA，尤其是指Wntl，Wnt2或Her3基因，以作為新的抗癌齊!j(anti-tumouragent)。
背景技術：
：RNA干擾(RNAinterference)是一種以后轉錄基因沉默化(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)為基礎的現象，同時也是一種用于分析生物體內許多途徑中的功能及角色的絕佳工具。此技術在功能基因體學、對應生化途徑、決定藥物治療方向以及基因治療上都相當重要。后轉錄基因沉默化(PTGS)第一次描述是在植物上(Napoli,C，C.LemieuxandR.Jorgensen.IntroductionofaChimericChalconeSynthaseGeneintoPetuniaResultsinReversibleCo-SuppressionofHomologousGenesintrans.PlantCell2:279-289,1990)。在1998年，AndrewFire及CraigMello等2人第一次在動物即線蟲(C.e/ega"力上描述RNA干擾(RNAi)(Fire,A.etal.1998.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinGafewoWzaM/toe/egfl似.Nature391,806-810)，長且雙股的RNA分子會誘發后轉錄基因沉默化。然而，在哺乳類細胞上應用核甘酸(nucleotides)也會誘發免疫反應(增加干擾素(interferon)量)，以及T.Tuschl,SM.Elbashir等人發現應用短且雙股的核甘酸(19-21bp)并不會誘發免疫反應(Elbashir，S.M,J.Harborth,W.Lendeckel，A.Yalcin,K.WeberandT.Tuschl.2001.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature411:494-498)。基因沉默化(Genesilencing)是以雙股RNA(dsRNA)分子為基礎，也稱為siRNA。RNAi是一種對于由雙股RNA所誘發的細胞轉化反應，會分解掉同源mRNA(homologousmRNA)。甚至有一些雙股RNA的副本(copies)會完全破壞掉一細胞中所形成的特定基因的轉錄本(transcripts)。所選擇的mRNA的破壞開始于RNA分解酶III(RNAseIII)的活化，使長發夾狀雙股RNA(dsRNA)或單股RNA(ssRNA)片段斷裂為長度為21-23核甘酸的雙股小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。siRNA為事先制備可從外部傳入細胞內。接下來，siRNA分子與一核酸酶復合物(nucleasecomplex)結合組成一RNA誘發沉默復合體(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)。由于該RNA誘發沉默復合體中解螺旋酶(helicase)的活性，雙股RNA會解開為單股。在形成該單股RNA分子后會黏合至互補mRNA上。后轉錄基因沉默化的最后步驟為利用RNA誘發沉默復合體的核酸酶(RISCnucleases)來分解所選擇的mRNA。與傳統方法如抑制(knockouts)相比，基因沉默化在動物以及細胞株模式中均可快速且輕松完成(RNAi機制如圖2所示)。本案發明人已完成深入研究并確認沉默化與癌化有關基因的表達，如Wntl基因，利用該基因的雙股寡核酸(siRNA)加以抑制腫瘤細胞增殖是一相當有效的方法。Wntl是一種能與"巻曲"內膜接受器結合并傳送一訊號至細胞質磷酸蛋白質(cytoplasmaticphosphoproteins)的分泌蛋白質，其依序抑制肝醣合成酶激酶3Beta型(glycogensynthasekinase3Beta,GSK-3Beta)(PoIaUsetal，Wntsignalingandcancer,GenesDew2000Aug1;14(15):1837-51)的持續高活性。該結果顯示細胞核中的乙型鈣調蛋白(Beta-catenin)量的穩定性及生長性。而Wnt-l的過度表達在許多種類癌癥中已受到注意，包括肺癌、結腸癌和乳癌，以及頭部、頸部的肉瘤腫瘤(Katohetal.ExpressionandregulationofWNTlinhumancancer:up-regulationofWNTlbybeta-estradiolinMCF-7,InJOncol,2003Jan;22(1):209-12)。抗WNT-1單株抗體(Anti-WNT-lmonoclonalantibodies)為已知。應用該抗體會增加細胞凋亡、減少腫瘤細胞增殖(H460和MCF-7株)，如同抑制可移植鼠科肺癌的反應(H460)(BiaoHe，AMonoclonalAntibodyagainstWnt-1InducesApoptosisinHumanCancerCells,Neoplasia,Vol.6，No.1,January/February2004,pp.7-14)。在上述報告中，BiaoHe等人同樣利用化學上未修飾的siRNA用于乳癌細胞株，結果使得細胞凋亡速率增加。抗WNT-1單株抗體會誘發肉瘤細胞中的細胞凋亡(A-204)(IwaoMikami，EfficacyofWnt-1monoclonalantibodyinsarcomacells,BMCCancer2005，5:53,24May2005)，以及在NCI-H1703和H28肺癌細胞中(LiangYou,InhibitionofWnt隱lSignalingInducesApoptosisinP-Catenin-DeficientMesotheliomaCells,CancerResearch64,3474-3478,May15,2004)。此研究也利用在MCF-7乳癌細胞，以及NCI-H1703和H28肺癌細胞中的化學上未修飾的siRNA，結果使得細胞凋亡的速率增加。You等人同樣利用未修飾的siRNA，其會誘發和單株抗體一樣相似程度的細胞凋亡。在結腸癌細胞中可以得到類似結果(Heetal,BlockadeofWnt-1signalinginducesapoptosisinhumancolorectalcancercellscontainingdownstreammutations,Oncogene2005,24:3054-3058)。在最近報告中，Fukutomi等人(Hepatology2005;41:1096-1105)指出在經修飾的肝腫瘤細胞中WNT-1的siRNA沉默化僅有間接效果。這些實驗利用表達C型肝炎病毒核蛋白(typeChepatitisviruscoreprotein)的肝癌細胞株細胞。表達C型肝炎病毒核蛋白是透過編碼該蛋白質的載體加以轉染這些細胞。此蛋白質的存在會增強WNT-1表達以及細胞增殖。應用對于上述細胞中WNT-1有特異性的siRNA會引起表達的沉默化以及抑制增殖。然而，這種實驗模型，并無法提供假設在利用WNT-1特異性的siRNA、在未以病毒蛋白質修飾的細胞中同樣會誘發一類似效果的證據。在WO2004032838專利案中是揭露一種將一細胞與一可阻止WNT與其接受器間相互作用的化合物接觸、加以抑制腫瘤細胞增殖的方法。如同這樣抑制的例子，是利用一抗WNT-1蛋白質的單株抗體。該專利同時揭露在應用siRNA于WNT-1蛋白質后，在許多腫瘤株中細胞的凋亡發生狀況。尚未有上述公開資料揭露任何在抑制未修飾的腫瘤細胞增殖中，活化siRNA機制的寡核酸的作用，也尚未得知這樣的作用。透過細胞凋亡加以根除細胞并不是一個用以增強抗腫瘤活性的充分機制，因為在許多種類的腫瘤中，此機制是被中斷或被抑制的。在其它因素的中，與p53基因中的一系列突變有關聯，而其是用來調控此過程。此過程的無效也有可能是缺少促細胞凋亡蛋白因子(proap叩toticproteins)如許多種類腫瘤中的Bax或Bid,或細胞凋亡抑制物如Bcl-2的表達量增加。只有腫瘤攝取(tumourtake)及/或腫瘤細胞增殖的抑制性可作為抗腫瘤活性(anti-tumouractivity)的證據。已修飾的細胞上的實驗并無法協助預測自然、未經修飾細胞在腫瘤中所發生的變化。以單株抗體作為可能的處理在生物體上會具有一相當大引起免疫反應的風險。此外，單株抗體相當的昂貴，同時并無法保證它們的制造在個別接受者中均會有重復不變的反應，因為在制造過程中是使用基因改造生物。故，亟需尋求一個新穎且有效率的處理法，其具有抗癌性質但不會引起免疫反應。這樣的藥物在制造上必須要能簡單而且較不昂貴，最好能利用一可再現的技術性制作程序。
發明內容本案發明人己經完成一系列實驗，并推斷出利用siRNA抗與癌化有關的基因，例如Wntl基因，在腫瘤細胞株上會對于腫瘤細胞增殖有一強力抑制。此抑制為齊lj量相關(dose國dependent)。本發明成功地帶來一個透過抑制腫瘤細胞生長的腫瘤治療法問題的解決方法，利用該RNA干擾機制加以分解與癌化有關基因的mRNA，例如編碼WNT-1的基因。本發明提供誘發細胞凋亡或抑制癌癥細胞生長的方法，如以寡核酸作為8一有效的抗癌劑。另外，本發明的應用在接受治療病人身上僅有一非常有限會引起免疫反應的危險。雙股寡核酸的制造為一可再現的程序，同時容易利用標準設備，即所謂的RNA合成器加以完成。這樣的寡核酸可能根據迄今已揭露的許多算法中之一加以設計，例如實施例1中所提出者。有興趣的mRNA基因序列可由數據庫中取得，例如可選用基因銀行(GenBank)以及NCBI參照序列數據庫(NCBIReferenceSequence)。mRNA目標序列的第二級結構可利用計算機折迭算法(computerfoldingalgorithm)設計。抗挑選出來mRNA序列的siRNA則可利用已知的算法經由計算機仿真(insilico)來產生。可在網絡上找到許多算法，其是設計用來產生抗特定mRNA序列的siRNA。這些算法一般而言是根據相似但其中有些微差異的方程式。大部分的方程式是根據siRNA設計中的塔斯爾規則(Tuschlrules),但其中有一些同時也使用雷諾茲規則(Reynoldsrules)。眾所皆知，對于由其它算法之一所產生的siRNA必須進行核對。這就是為什么在我們的方法中要根據不同方程式使用不同的算法。在一些算法所產生的siRNA也是根據它們的熱力學加以分析。在siRNA分子間自由能(freeenergy)的分布在描述已知序列的潛力上是一非常重要的因素。這個特征在通過RNA誘發沉默復合體(RISC)辨別引導股(guidestrand)時相當的重要，因為這個復合體是辨認將被合并的一股的5'端，而且作為引導股。已知一不轉錄股(antisensestrand)的5'端應該會較3'端不穩定，故5'端的自由能應該要比3'端的要高。根據這些規則在5'端與3'端間的GC比例(GCcontent)應該會有差異。更多的GC比例配對會在一不轉錄股的3'端。根據siRNA在熱力學上的穩定性以及潛力，分子間GC比例的總數也很重要。在功能性siRNA其GC比例應該介于30%60%之間，可確保一設計的d叩lex穩定不會被解開且夠穩定以避免在細胞質內自行解開。在熱力學分析上會建議設計siRNA在不轉錄股的位置10處為一低穩定度。此位置為一斷裂部位故應該不會在引導股和目標mRNA間形成一強力混合，尿嘧啶堿基(Ubase)是建議在此位置。另一在siRNA設計中需要考慮的因素為標定二級結構的親近性(accessibility)。此因素敘述在mRNA分子上目標區域的一單股motif。在細胞質中mRNA從未以一單股狀態存在，它的二級結構含有很多發夾狀、環狀以及其它結構，其為在特定mRNA分子中堿基間部份配對的結果。在siRNA設計上最大的問題之一為避免潛在性的"關閉目標(off-target)"作用。此作用發生在如果特定siRNA不僅把需要的mRNA,還把其它mRNA作為目標。在這例子中有許多象blast或clustal的算法，可預測與任何已知副本(transcript)的可能的相互影響關系。1.有興趣的mRNA的基因序列是由數據庫中取得，例如選用GenBank以及NCBI的ReferenceS叫uence。抗所選取mRNA序列的siRNA是利用已知算法經由計算機仿真(insilico)來產生。2.接著將所設計的序列是按照根據下列規則的所有過濾數值(totalfilteringscore)加以排列(a)在算法中的頻率其為一描述有多少算法設計特定siRNA的數值，該數值是由方程式描述a=l*算法數量(b)單股區域機率其為一描述在特定mRNA分子的目標區域中有一單股motif機率的數值。該數值是利用計算機折迭算法(computerfoldingalgorithm)計算或根據下列方程式計算lMasM射Mss-二級結構的數目，其中在一目標區域有一單股motif。Mt-所預估的二級結構總數。(c)與其它mRNA序列互補其為一描述關閉目標(off-target)的可能性的數值，該數值是由方程式描述C=-2*分子數量(d)不轉錄股(antisensestrand)5'端的自由能其為一描述該siRNA5'端的穩定度的數值。該數值是根據最近RNA的熱電學變量(then加dynamicsparameters)力口以計算。(e)不轉錄股3'端的自由能其為一描述該siRNA5'端的穩定度的數值。該數值是根據最近RNA的熱電學變量(thermodynamicsparameters)加以計算。(f)不轉錄股上位置IO的自由能其為一描述一斷裂處的穩定度的數值。該數值是根據最近RNA的熱電學變量加以計算。(g)GC比例(GCcontent)其為一描述siRNA分子的穩定度的數值。該數值是根據方程式加以計算其中Ncr兩股中鳥糞嘌呤堿基(Gbases)的數量NT-不轉錄股中堿基的總數。3.為了更進一步分析所選擇最佳15個siRNA。4.接著篩選增殖的抑制，完成mRNA以及蛋白質量的減少。該實驗是以高于或等于80。/。的轉染效率(transfectionefficiency)實施。(a)每一序列的抑制數值(inhibitionscore)是利用因子s求出、"/、s=1-a附，、ic-i附J其中Rs-以一具有siRNA的探針(probe)的測量結果Rm-以一空白探針(blankprobe)的測量結果Rc-以一控制的探針的測量結果說明書第8/27頁i.0當s值小于0.50ii.1當s值介于0.51-0.60iii.2當s值介于0.61-0.70iv.3當s值介于0.71-0.80v.4當s值介于0.81-0.卯vi.5當s值介于0.91-1.00接著將序列依照該抑制數值加以排序。(b)為了更進一步分析siRNA其排序多于或等于所選擇的最佳序列的50%。(c)每一序列中mRNA量數值(mRNAlevelscore)的減少量是利用因子r求出:r=100-芒*層其中:數值:Es-以具有siRNA的探針偵測的目標基因相對應表達量Ec-以具有控制的探針偵測的目標基因相對應表達量i.0當r值小于50ii.l當r值介于51-60iii.2當r值介于61-70iv.3當r值介于71-80v.4當r值介于81-90vi.5當r值介于91-100接著將序列依照該mRNA程度數值的減少量加以排序。(d)每一序列中蛋白質量數值(proteinlevelscore)的減少量是利用因子t求出:t=100-尸c:，其中:Ps-以一具有siRNA的探針所偵測的蛋白質〕PC-以一控制的探針所偵測的量數值:0當t值小于501當t值介于51-602當t值介于61-703當t值介于71-804當t值介于81-905當t值介于91-100接著將序列依照該蛋白質量數值的減少量加以排序。5.所有的序列具有最后篩選因子(screeningfactor)z的特征<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中a-依照抑制數值加以排序b-依照mRNA量數值的減少量加以排序c-依照蛋白質量數值的減少量加以排序。6.接著將帶有大于或等于50%最佳序列的z因子的siRNA，但沒有超過3是根據細胞死亡機制分析。序列是依照下列加以排序(a)存活的細胞(b)-1*壞死細胞(116"(^(^6113)%(c)+1*初期凋亡細胞(6&1^apoptoticcells)%(d)+2*凋亡細胞％。7.接著求出劑量相關(dose-dependent)影響的數值(a)求出達到超過65。/。沉默化(silencing)效果的最低劑量，(b)求出該影響仍可被偵測到的最長時間。另外，為了減少免疫反應，所設計的寡核酸最好不要長于30bp，較佳長度為21-23bp。轉錄(sense)及不轉錄(antisense)的寡核酸可能為對稱或不對稱，即代表2端核甘酸可能為未雜合(unhybridized)，再形成黏合端(stickyends)。為了增強它們的溫度以及酵素的穩定度、藥物動力學、生物有效性(bioavailability)以及細胞攝取(cellularuptake)特性，該寡核酸可能進行化學修飾。化學修飾可能與磷酸鹽(phosphates)、核醣(ribose)或核酸酶(nucleases)本身有關，上述化學修飾可能僅與選定的核甘酸有關，即末端或中間，或整個寡核酸。該寡核酸可被傳送進入腫瘤細胞，不需載體，和利用一載體一樣，分為病毒性和非病毒性。病毒性載體的例子有腺病毒(Adenoviruses)或類腺病毒(adeno-likeviruses),其可促進該寡核酸在傳入腫瘤細胞后進行的一連串表達。非病毒性載體是利用脂質莢膜(lipidcapsules)將寡核酸傳入細胞、脂質復合物或其它載體以延長它們在生物體內的半衰期及/或細胞吸收作用。本發明的結果，可達到一相當大的腫瘤細胞增殖抑制作用。雖然下列實施例和描述說明本發明的性質，并包括實施例加以詳加說明，而本發明的一實施例是包含所有對描述過程的一般變化、改編、修飾、刪除或增加，均視為后述的申請專利范圍的一部分以及相等。圖1為在濃度50nm的未處理細胞中，以16抗Wntl基因的siRNA序列轉染MCF-7細胞48小時后的抑制增殖的比例。細胞的生存能力是利用MTS檢驗加以圖2為利用針對Wntl的特定siRNA轉染后，MCF-7細胞中的Wntl蛋白質程度的減少量。(a)在MCF-7細胞株中經過抗Wntl的siRNA處理48小時后，Wntl和肌動蛋白的表達。(b)以W13、W15以及WP序列處理24小時和72小時后細胞中表達Wntl的比例。圖3為利用抗Wntl的siRNA處理后的細胞周期分析。(a)細胞圖顯示MCF-7細胞以W15和WP序列轉染72小時后的DNA含量以及細胞大小。(b)統計圖表示MCF-7細胞以W15和WP序列轉染72小時后的細胞周期。圖4為經過W15序列處理的細胞凋亡。(a)凋亡蛋白酶(caspases)3以及7的活性。(b)MCF-7細胞經過W15序列處理后在形態上的改變。圖5為MCF-7細胞在WntlsiRNA后利用AnnexinV以及以碘化物染色法的細胞凋亡分析。(a)細胞圖表示MCF-7細胞經過W15以及WP序列轉染72小時后的形態。(b)細胞圖顯示在利用W15和WP序列轉染72小時后細胞凋亡早期和晚期、以及壞死的細胞數量。圖6為WntlsiRNA誘發細胞凋亡，其是由MCF-7細胞中Wntl的蛋白質量減少所引起。(a)細胞圖顯示DNA含量以及Wntl的表達量。(b)統計圖表示具有Wntl的高和低表達量的細胞數量。圖7為siRNA的排序結果。8個siRNA通過抑制數值排序(粗體字)，2序列通過z數值排序(粗體紅字)。用來比較WP序列的全部因子(源自文獻的序列)均經過分析。具體實施例方式材料及方法細胞培養人類乳癌細胞株MCF-7是取自于美國菌種中心(AmericanTypeCultureCollection(Rockville,MD,美國))。細胞培養在補充10%(v/v)胎牛血清(FCS)、50jxg/ml健達霉素(gentamycin)、2.5嗎/ml抗霉素(fungizone)、50Ul/ml盤林西林(penicillin)、50pg/ml鏈霉素(streptomycin)(InvitrogenCarlsbad,USA)的培養液(DMEM)中維持，并在包含5%二氧化碳/95%濕度的空氣37°C下，同時每2或3天定期繼代培養(subculture)。細胞增殖分析為了增殖檢驗，在實驗前一天將MCF-7細胞置于細胞培養液(Opti-MEM(Invitrogen))在96孔盤(96-wellplates)的每一孔中有7x103個細胞。隔天將MCF-7細胞以針對WntlmRNA有特異性的15個siRNA序列轉染，同時依照制造商的說明書步驟利用的脂質體(Lipofectamine)RNAiMAX(Invitrogen)在濃度50nm反應48小時下擾亂siRNA序歹!j(控制組)。利用品名"siCONTROLTOX"轉染試劑(美商Dharmacon公司出品)作為轉染效率的控制組。在實驗48小時后，利用MTS檢測(Promega,Madison，USA)以測量增殖抑制。西方點墨分析法西方點墨法的試劑是購自美商伯樂公司(BioRad(Hercules,USA)，下稱BioRad)、抗Wntl的抗體則來自于ZymedInvitrogen，抗肌動蛋白(actin)、抗磷酸化乙型鈣調蛋白(phosphor-beta-catenin)、抗c-myc以及抗胞轉蛋白Dl(cyclinDl)來自于美商圣塔克魯茲生物科技公司((SantaCruz，USA)，下稱SantaCruzBiotechnology),抗斷裂PARP抗體則來自于美商細胞訊號公司(CellSignaling(Beverly,USA))。西方點墨法的偵測試劑來自于美商羅氏醫學儀器公司(RocheDiagnostics(Indianapolis,USA)，下稱RocheDiagnostics),另外高靈敏度與低背景值的冷光訊號專用底片(LightFilmBioMax)則來自于美商柯達公司(Kodak(Rochester,USA)，下稱Kodak)。在實驗前一天將250xl03個細胞在裝有細胞培養液(Opti-MEM)的無菌25cm2三角瓶中培養直到占滿60。/。的生長平面空間(confluence)。為了抑制(knock-down)Wntl基因，將培養液移除并以含有siRNA的轉染培養液代替，其通過該抑制數值順序。48小時后以胰蛋白酶沖洗(trypsinization)并在4°C下以2000g離心5分鐘，而沉淀細胞(cellspellet)會漂浮于冰冷的磷酸緩沖溶液(PBS)中，即可得到該培養細胞。在第二次離心后移除上清液，同時該沉淀細胞會在0.5ml完全裂解緩沖液RIPA(美商圣塔克魯茲生物科技公司，SantaCruz,CA，USA)中漂浮，同時在4°C下培養30分鐘。該緩沖液中的漂浮細胞在4°C下以9000g離心10分鐘，再將該上清液(包含全部的蛋白質碎片)小心地移除并經過一20規度注射針導引器(20-gaugesyringeneedle)6次。將該溶解物以1:2(v/v)比例與含有2.5%的2-硫氫乙醇(2-mercaptoethanol)的Laemmli樣本緩沖液(BioRad)混合并煮沸3分鐘。包含相同量蛋白質的樣本是由聚丙烯酰胺膠體電泳(SDS-PAGE)(12%gel)以及一多變標記(BioRad)。此電泳(electrophoresis)是使用BioRad的小型電泳槽(MiniProteanIIIcell)以110V進行1小時。將電泳后分離的蛋白質在一PVDF膜(BioRad)上利用該MiniProteanIII小型電泳槽以110V電轉漬(electroblot)70分鐘。將該膜在含有5%w/v脫脂牛奶的TBST(pH7.5)溶液浸泡整夜以停止反應。隔天將該膜以TBST沖洗3次10分鐘，并在室溫下與經1:200比例稀釋的第一抗體(primaryantibodies)培養1小時。再將該膜以TBST沖洗4次10分鐘，同時與經1:2000比例稀釋、和辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)(美商西格瑪奧瑞奇公司(SigmaAldrich,St.Louis,USA)提供，下稱SigmaAldrich)雜合的第二抗體再培養1小時。最后，將該膜以TBST沖洗3次10分鐘，同時利用一高效能化學發光的品名"BioMAX"的感光底片(Kodak)，上面的西方點墨法的偵測試劑LumiLight(Roche)標記的蛋白質(labelledproteins)即可顯現。再將該感光底片上的影像利用一KodakEdas系統分析，可測得積分光密度值(integrated叩ticaldensity,IOD)。實時聚合酶連鎖反應(RealTime-PCR)在實驗前一天將25(^103個細胞在裝有細胞培養液的無菌25cn^三角瓶中培養直到占滿60。/o的生長平面空間(confluence)。為了抑制(knock-down)Wntl基因，將培養液移除并以含有siRNA的轉染培養液代替，其通過該抑制數值順序。48小時后以胰蛋白酶沖洗(trypsinization)并在4°C下以2000g離心5分鐘，而沉淀細胞會漂浮于冰冷的磷酸緩沖溶液(PBS)中，即可得到該培養細胞。接著加入1mlTRIZOL試劑(Invi加gen)以及經過移液管數次，細胞會溶解。之后將溶解產物在室溫下培養5分鐘。接著在每1mlTRIZOL加入0.2ml氯仿，同時在室溫下將樣本培養10分鐘。接著樣本在4。C下以大于12,000g離心15分鐘。然后將此液體轉移至一全新管子中并與異丙醇混合、在室溫下培養10分鐘以及在4°C下以大于12,000g離心10分鐘，RNA即自該液體中沈淀出來。RNA以lml75%冰冷的乙醇即可被沖洗掉。樣本以震蕩方式(vortexing)加以混合并在4。C下以大于12,000g離心5分鐘。在步驟的最后，將RNA沉淀物干燥(風干510分鐘)。最后將RNA溶解在適量的無RNase(RNase-free)的水中。依照制造商的說明書步驟利用ImProm-II反轉錄酶套組(Promega)將所分離出來的RNA轉錄為cDNA。目標基因的mRNA的表達差異是利用Rotor-GeneTM3000(柯伯特研究公司(CORBETTRESEARCH)提供)來測量以及利用RelativeExpressionSoftwareToolforRotor-Gene(REST-RGO)加以預測相關表達。H3F3A(histonH3A)為管家基因(House-keeping)。校正樣本(Calibratorsample)來自于Stratagene公司，而針對管家基因的弓I子(primers)來自于Eurogenetec公司以及對于目標基因有特異性的引子(德商Qiagen公司)。將cDNA樣本和適當引子與FastStartDNAMasterSYBRGreenI套組(Roche)混合。關于流式細胞儀的免疫熒光染色(Iimmunofluorescencestainingforflowcytometry)在實驗前一天將250xl()S個細胞在裝有Opti-MEM的無菌25cn^三角瓶中培養直到占滿60。/。的生長平面空間(confluence)。為了抑制(knock-down)Wntl基因，將培養液移除并以含有siRNA的轉染培養液代替，其通過該抑制數值順序。48小時后以胰蛋白酶沖洗(trypsinization)并在4°C下以2000g離心5分鐘，而沉淀細胞會漂浮于冰冷的磷酸緩沖溶液(PBS)中，即可得到該培養細胞。然后將細胞固定在1%甲醛中15分鐘，以磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2次，使其漂浮在冰冷的70y。乙醇中并儲存于-2()Gc下24小時。經過這次再將細胞以磷酸緩沖溶液(PBS)-1。/。BSA沖洗2次，同時與任一經(PBS)-1。/。BSA以1:250比例稀釋的抗Wntl的第一抗體(Zymed-Invitrogen)培養1小時。在主要培養后將細胞以(PBS)-P/。BSA沖洗2次、并與一含有10jxg/mlRNaseA的熒光染劑(propidiumiodide)溶液一起培養15分鐘用以將DNA對比染色(counterstain)。接著利用BDFACSCalibur流式細胞儀(美商貝克騰迪克伊森公司(BectonDickinson,FranklinLake,USA)提供，下稱BectonDickinson)進行測量。細胞凋亡分析為了凋亡蛋白酶(caspases)3和7的活性，在實驗前一天將MCF-7細胞置于96孔盤中，在每一孔中放置7xl(^個細胞以及細胞培養液(Invitrogen)。隔天將MCF-7細胞依照制造商的說明書步驟，以通過抑制數值排序的siRNA序列在濃度50nm下、利用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)進行轉染48小時。在12小時的siRNA表現后，凋亡蛋白酶3和7的活性是依照制造商的說明書步驟、利用GloMax96微量盤冷光儀(MicroplateLuminometer)(Promega)所制造的Caspase-Glo3/7測定(Promega)加以測量。分析以通過最后篩選測試的siRNA轉染的凋亡細胞，是依照制造商的說明書步驟，通過胰蛋白酶沖洗(trypsinization)獲得并利用一AnnexinVFLUOS染色套組(美商羅氏醫學儀器公司，Indianapolis)加以染色。接著將染色細胞立刻以流式細胞儀(FACScan，美商貝克騰迪克伊森公司，FranklinLake,N丄)進行分析。早期凋亡細胞與暴露磷脂絲胺酸(phosphatidylserine)但完整細胞膜與AnnexinV-FITC結合然而排除熒光染劑(propidiumiodide)。在壞死或細胞凋亡后期的細胞均以AnnexinV-FITC和熒光染劑加以標記。siRNA序列的設計許多可利用的算法之一可用于設計有效的siRNA序列。此類的算法在文獻中普遍可取得，例如l.ElbashirSMetal.(2001)Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.411:494-498。2.ElbahirSMetal.(2001).FunctionalanatomyofsiRNAsformediatingefficientRNAiinDrosophilamelanogasterembryolysate.EMBOJ.20:6877-6888。3.ElbashirSMetal.(2002).AnalysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs.Methods.26:199-213。4.ReynoldsA,LeakeD,BoeseQ，ScaringeS,MarshallWS,KhvorovaA.RationalsiRNAdesignforRNAinterference.NatBiotechnol.2004Mar;22(3):326-30。5.Tuschl,T.,Elbashir,S.,HarborthJ"andWeber,K."ThesiKNAUserGuide",http:〃www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sima.html(revisedMay6,2004)。或以立刻可用(ready-to-use)計算機軟件的類型1.http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA一finder.html，2.https:〃www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai，3.http:〃wwwl.qiagen.com/PiOducts/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.aspx，4.http:〃sfold.wadsworth.org/sirna.pl。這些算法的基礎為引進我們希望沉默化(silence)的蛋白質的mRNA或cDNA。編碼該WNT-1蛋白質或cDNA的mRNA容易得到且公開(即在GENMED數據庫中-www.ncbi.nlm.nih.gov)oNCBI參考序列(RefSeq)NM—005430。(http:〃www.ncbi.nlm.nih.ROv/entrez/viewer.fcgidb=Nucleotide&dopt=GenBank&val-16936523)。本發明的發明人已設計許多對于WNT1mRNA有效的siRNA序列，請參閱下列表格(表格1)。表格l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>合成siRNARNA合成是利用固相產生技術，利用合成核酸(nucleicacids)的典型步驟，利用(3-cyanoethylphosphamideesters的衍生物和核醣(ribose)的2'-OH基的tert-butyldimethyl-silane保護。Phsosphamide單體依附上核醣的自由5'-OH基接著為5-benzylmercapto-lH-tetrazole所活化。此反應立即繼續進行、有效率地產生寡聚物。同時將該形成的寡聚物以色析法(HPLC)或電泳(PAGE)技術加以純化。此合成是以一實用Biosystems公司的962RNA合成器進行。siRNA是在-20。C下利用相同摩爾數的互補RNA股在2M溶于乙醇的醋酸鹽(acetate)緩沖液中輕輕的搖動1小時所產生。此溶液離心15分鐘并以70%乙醇干燥。利用一脂質載體來制備單獨siRNA稀釋利用Hiperfect脂質載體稀釋siRNA(WNT1—16)。Hiperfect是購自Qiagen及供應。每一siRNA稀釋以是列稀釋制備，再接著加入一適量Hiperfect。25nm3plsiRNA+1197pl無血清的培養液10x0.75piHiPerFect=7.5pl5nm200pl25nm溶液+800|il無血清的培養液8x0.75piHiPerFect=61nm200|il5nm溶液+800pi無血清的培養液10x0.75plHiPerFect=7.5pisiRNA的轉染在實施例3中所制備的稀釋是用于轉染中si認A的轉染是以3種濃度進行1、5禾H25nm，Hiperfect:固定0.75microL/孔。實驗對照組包括(a)腫瘤細胞，(b)a+HiPerfect試劑。步驟1.將來自體外(invitro)培養的腫瘤細胞接種至一96孔盤，在lxl(^個細胞/孔，在100pl。該細胞在一有5%二氧化碳的潮濕環境下，以37^培養24小時。2.經過24小時的培養后，將該細胞在濃度為1、5或25nm(最后體積為100pl)以一適當siRNA處理，與一包括單獨100pl培養液或僅有HiPerFect培養液的細胞的對照組。轉染是根據制造商在HiPerFect轉染試劑手冊(www.qiagen.com)上的操作指南實施。3.該細胞在上述條件下再培養24小時或72小時。解讀結果利用SRB方法記錄測試數據1.在培養結束之后，在每一孔中加入50^1冰冷的50%TCA(trichloroaceticacid)。2.在40C下培養60分鐘后，以流動的水沖洗該細胞5次。3.干燥后，在每一孔中補充溶在1%醋酸中的50|il0,4%SRB(sulforodamineB)溶液，為了將沉淀蛋白質染色。4.在室溫下培養30分鐘后，以1°/。醋酸沖洗該孔盤5次。5.干燥后，在每一孔中補充150pl10nmTRIS緩沖液(tris(hydroksymethyl)aminomethane)溶解染齊!j。6.該方法是用來測定通過TCA的蛋白質沉淀量。每一樣本的光學密度(opticaldensity)是以光電分光儀(spectrophotometrically)以540nm測量。"空白"(Blank)控制組是由一孔中僅含培養液的溶液所構成。陽性對照樣本是由漂浮于培養液中的細胞所構成。由該光電分光儀(spectrophotometrically)所測定的OD是與一樣本中存活細胞的數量成比例。測量經siRNA處理過的個別腫瘤株細胞的增殖速率所得到的結果是收集于表格(表格2和表格3)中。表格2.將siRNA與人類LNCap前列腺癌細胞(humanLNCapprostatecancercdls)—起培養72小時后的增殖抑制性<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表格3.siRNA與人類ASPC-1胰臟癌(humanASPC-lpancreaticcancer)—起培養72小時后的增殖抑制性<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>由抑制腫瘤細胞增殖的實驗結果中，可證明應用抗Wntl基因的siRNA對于腫瘤細胞增殖具有一顯著抑制性。增殖抑制性的數值是與控制細胞單獨在培養液中培養有關。另夕卜，利用抗Wntl的siRNA，與單獨以Hiperfect脂質載體或其它基因的siRNA處理的腫瘤細胞相比、對于增殖會有一強烈許多的抑制效果，即前述的抗癌性質。實施例l.抗WntlmRNA抑制細胞生長的經過設計的siRNAMCF-7細胞的細胞增殖在經過一以對于Wntl基因有特異性的50nmsiRNA序列處理48小時后測量，利用MTS分析來測定細胞生長率。將經siRNA處理的細胞生長與未經處理的細胞(CTRL)、以擾亂無編碼(non-coding)的siRNA(SCsiRNA)處理的細胞以及以siControlTOX(siTOX)和Docetaxel(DOC)處理的細胞。SCsiRNA以及siTOX是用來測定分別由核酸化學性質或轉染劑所引起的非特異性的細胞生長抑制，同時確認轉染的效率。圖1所顯示的數值指出未轉染的控制組細胞(non-transfectedcontrolcells)的增殖比率。在這些實驗中大約88%的未編碼siRNA(Non-codingsiRNA)對于細胞增殖和轉染效率幾乎都不具效果。很少數的測試siRNA序列顯示出強大的減少細胞增殖能力，在一些實例中超過50%，代表高過于抑制細胞藥物(Docetaxel)。而在增殖效率上達到最佳效果為W15序列，其抑制增殖與相關的未處理細胞相差75%，同時由文獻中可得知遠較于docetaxel以及WPsiRNA有效果(He等人.2004)。實施例2.經設計的siRNA在遞減的WntlmRNA量中具有特異性且有效接著，我們在將MCF-7以通過抑制數值排序的siRNA處理后測量其中mRNA量。mRNA減少量為siRNA作用的最直接結果。然后我們測定以抗WntlmRNA的siRNA轉染MCF-7細胞，是否會造成mRNA量的減少。分析是在轉染48小時后進行。所有的mRNA分離、轉錄為cDNA以及實時聚合酶連鎖反應(real-timePCR)如上述材料及方法中均已完成。在以W15序列處理MCF-7細胞后，我們觀察到與未處理的控制組比較，mRNA減少了6iy。。此實驗也受到我們序列的特異性控制。另外，我們以A549細胞進行類似實驗，以確定是否有任何反應。已知在A549細胞中Wntl不表達(He等人2004)。我們觀察到A549細胞以W15序列處理48小時后，在增殖和mRNA量都沒有變化。此數據代表W15序列在遞減的WntlmRNA量中具特異性且有效，其為siRNA的基礎作用。實施例3.對Wntl有特異性的siRNA會引發蛋白質量的減少以抗Wntl的siRNA轉染后，完成MCF-7細胞中Wntl量的西方點墨分析(Westernblottinganalysis)(圖2a)。以W15序列處理48小時后，細胞中Wntl量不但會減少以及較少程度，而且根據控制組減少細胞處理以W13序列的重要性，MCF-7在WP序列處理后Wntl量有微量減少。西方點墨分析顯示，MCF-7細胞在抗Wntl的siRNA處理后，其中的磷酸化乙型鈣調蛋白(phophorylatedbeta-catenin)量有增加。在Wntl量的衰退與經W15或W13序列處理的MCF-7細胞中的c-myc和cyclinDl衰退量的間，我們觀察到一關聯性。我們在WP序列處理后并未發現如此變化。這數據代表抗Wntl的W15序列在MCF-7細胞中提供Wntl的減少量，同時與c-myc、胞轉蛋白Dl(cyclinDl)以及磷酸化乙型鈣調蛋白量的增加量有關聯。接著，利用流式細胞儀技術測量MCF-7細胞經過siRNA處理的Wntl表達的改變(圖2b)。有87%和92%的控制組細胞在24h和72h后依次表達Wntl，在以W15序列處理的細胞中僅有35%和29%分別表達Wntl，而在以W13序列轉染24小時和72小時后分別有80%和33%的細胞表達Wntl，同時在以WP序列處理的細胞中分別有90%和70%的細胞表達Wntl。此分析顯示抗Wntl的siRNA會誘發蛋白質量減少。實施例4.抗Wntl的siRNA誘發細胞凋亡而非壞死(necrosis)利用流式細胞儀技術分析經抗Wntl的siRNA處理的MCF-7細胞的細胞周期(圖3)，72小時后我們觀察到41%的死亡細胞與控制組(4%)以及經WP序列處理的細胞(14%)相比。此數據顯示以抗Wntl的siRNA轉染MCF-7細胞會增加細胞死亡。為了證實哪種細胞死亡是由siRNA處理所觸發，我們利用凋亡蛋白酶活性分析(caspasesactivationassay)。在此分析中所得到的結果顯示與控制組比較的抑制增殖性。我們觀察到以W15序列處理后的MCF-7細胞至少有增加5倍的凋亡蛋白酶3和7的活性，同時在以W13序列處理后大約增加4倍，而以細胞毒性docetaxel處理后只增加大約2倍(圖4a)，此結果藉由以W15序列處理后的MCF-7細胞的形態改變加以確認(圖4b)。那些結果顯示W15序列會誘發MCF-7細胞的細胞凋亡。接著我們測定細胞凋亡、壞死細胞以及存活細胞(viablecells)的數量。細胞凋亡的分析是利用AnnexinV(AV)以及熒光染劑(propidiumiodide,PI)雙重染色進行。雙重陰性(negative)即為存活細胞。AV陽性以及PI陰性為細胞凋亡早期的細胞，而AV陽性以及PI陽性為細胞凋亡后期的細胞。壞死細胞則為AV陰性以及PI陽性(圖5)。實施例5.由對Wntl有特異性的siRNA所誘發的蛋白質量減少會引發細胞凋亡流式細胞儀技術是用來確認細胞凋亡是否為以抗Wntl的siRNA所轉染的MCF-7細胞、其中Wntl的量減少而觸發的(圖6)。在控制組細胞中有87%存活細胞表達Wntl、有9%的細胞存活并偵測不到Wntl的表達，以及有4%的細胞生長24小時后無Wntl表達。而在細胞生長72小時后可觀察到，有90%存活細胞表達Wntl、4%存活細胞無表達Wntl以及3%細胞死亡無表達Wntl。而在以針對Wntl有特異性的siRNA處理的細胞中，在24小時后，有34%存活細胞表達Wntl，同時有24%細胞存活無Wntl表達以及41。/。細胞死亡無Wntl表達。在72小時后有25%存活細胞表達Wntl，同時有3%細胞存活無Wntl表達以及68%細胞死亡無Wntl表達。我們在WP序列處理后并未觀察到這樣的變化。此數據代表細胞凋亡是由具特異性的siRNA所誘發的Wntl量減少所觸發。序列表<110>塞隆藥商公司<120>以雙螺旋寡核酸干擾mRNA作為有效的抗癌劑<160><170>Patentlnversion3.2<210>1<211>2369<212>RNA<213>人工序列<400>11gcggtgccgcccgccgtggccgcctcagcccaccagccgggaccgcgagccatgctgtcc61gccgcccgcccccagggttgttaaagccagactgcgaact'ctcgccactgccgccaccgc121cgcgtcccgtcccaccgtcgcgggcaac肌ccaaagtcgccgcaactgcagcacagagcg181ggcaaagccaggcaggccatggggctctgggcgctgttgcctggctgggtttctgctacg241ctgctgctggcgctggccgctctgcccgcagccctggctgccaacagcagtggccgatgg301tggggtattgtgaacgtagcctcctccacgaacctgcttacagactccaagagtctgcaa361ctggtactcgagcccagtctgcagctgttgagccgcaaacagcggcgtctgatacgccaa421aatccggggatcctgcacagcgtgagtggggggctgcagagtgccgtgcgcgagtgcaag481tggcagttccggaatcgccgctggaactgtcccactgctccagggccccacctcttcggc541aagatcgtcaaccgaggctgtcgagaaacggcgtttatcttcgctatcacctccgccggg601gtcacccattcggtggcgcgctcctgctcagaaggttccatcgaatcctgcacgtgtgac661taccggcggcgcggccccgggggccccgactggcactgggggggctgcagcgacaacatt721gacttcggccgcctcttcggccgggagttcgtggactccggggagaaggggcgggacctg781cgcttcctcatgaaccttcaca^caacgaggcaggccgtacgaccgtattctccgagatg841cgccaggagtgcaagtgccacgggatgtccggctcatgcacggtgcgcacgtgctggatg901cggctgcccacgctgcgcgccgtgggcgatgtgctgcgcgaccgcttcgacggcgcctcg961cgcgtcctgtacggcaaccgcggcagcaaccgcgcttcgcgagcggagctgctgcgcctg1021gagccggaagacccggcccacaaaccgccctccccccacgscctcgtctacttcg3gaaa1081tcgcccaacttctgcacgtacagcggacgcctgggcacagcaggcacggcagggcgcgcc1141tgtaacagctcgtcgcccgcgctggacggctgcgagctgctctgctgcggcaggggccac1201cgcacgcgcacgcagcgcgt.caccgagcgctgcaactgcaccttccactggtgctgccac1261gtcagctgccgcaactgcacgcacacgcgcgtactgcacgagtgtctgtgaggcgctgcg1321cggactcgcccccaggaaacgctetcctcgagccctcccccaaacagactcgctagcact1381caagacccggttattcgcccacccgagtacctccagtcacactccccgcggttcatacgc1441atcccatctctcccacttcctcctacctggggactcctcaaaccacttgcctggggcggc1501atgaaccctcttgccatcctgatggacctgccccggacctacctccctccctctccgcgg1561gagaccccttgttgcactgccccctgcttggccaggaggtgagagaaggatgggtcccct1621ccgccatggggtcggctcctgatggtgtcattctgcctgctccatcgcgccagcgacctc1681tctgcctctcttcttcccctttgtcctgcgttttctccgggtcctcctaagtcccttcct1741attctcctgccatgggtgcagaccctgaacccacacctgggcatcagggcctttctcctc1801cccacctgtagetgaagcaggaggttacagggcaaaagggcagctgtgatgatgtggaaa1861tgaggttgggggaaccagcagaaatgcccccattctcccagtctctgtcgtggagccatt1921gaacagctgtgagccatgcctccctgggccacctcctaccccttcctgtcctgcctcctc1981atcagtgtgtaaataatttgcactgaaacgtggatacagagccacgagtttggatgttgt2041aaataaaactatttattgtgctgggtcccagcctggtttgcaaagaccacctccaaccca2101acccaatccctctccactcttctctcctttctccctgcagccttttctggtccctcttct2161ctcctcagtttctcaaagatgcgtttgcctcctggaatcagtatttccttccac.tgtagc2221tattagcggctcctcgcccccaccagtgtagcatcttcctctgcagaataaaatetctat2281ttttatcgatgacttggtggcttttccttgaatccagaacacaaccttgtttgtggtgtc2341ccctatcctccccttttaccactcccag權利要求1、一種獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為(a)從數據庫中取得一與癌化有關基因所編碼的mRNA的已知序列，抗所挑選的mRNA序列是利用以塔斯爾規則為基礎的已知算法，經由計算機仿真所產生，將設計的序列依據所有過濾數值加以排序，所挑選的寡核酸是由不到30bp、最好為21～23bp所合成。(b)在關于寡核酸的合成方面(a)執行增殖抑制的篩選，(c)在關于寡核酸的合成方面(a)執行mRNA量減少的篩選，(d)在關于寡核酸的合成方面(a)執行蛋白質量減少的篩選，(e)該所有的篩選寡核酸其特征為最后篩選因子z其中a-依照抑制數值加以排序，b-依照mRNA量數值的減少量加以排序，c-依照蛋白質量數值的減少量加以排序，(f)該細胞死亡機制是以有大于或等于50％最佳序列的z因子的寡核酸分析，而且該提供癌癥細胞凋亡至少50％量的寡核酸，是選作為一有效抗癌劑的寡核酸。2、根據權利要求l所述的獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為(a)所有過濾數值是以下列變量為基礎求出算法中的頻率、單股區域機率、與其它mRNA序列互補、不轉錄股的5'端的自由能、不轉錄股的3'端的自由能、在不轉錄股位置10的自由能、GC比例。3、根據權利要求1所述的獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為(b)每一寡核酸的抑制數值是利用因子s求出其中:ic-《Rs-以一具有siRNA的探針的測量結果，Rm-以一空白探針的測量結果，Rc-以一控制的探針的測量結果，其中抑制數值為i.0當s值小于0.50ii.1當s值介于0.51-0.60iii.2當s值介于0.61-0.70iv.3當s值介于0.71-0.80v.4當s值介于0.81-0.90vi.5當s值介于0.91-1.00而該寡核酸根據該得到的數值加以排序。4、根據權利要求1所述的獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為(c)mRNA量數值的減少是利用因子r求出其中Es-以具有siRNA的探針偵測的目標基因相對應表達量，Ec-以具有控制的探針偵測的目標基因相對應表達量，其中mRNA量的數值減少為i.0當r值小于50ii.l當r值介于51-60iii.2當r值介于61-70iv.3當r值介于71-80v.4當r值介于81-90vi.5當r值介于91-100而該寡核酸根據該得到的數值加以排序。5、根據權利要求1所述的獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為t=100-其中:、尸ci,0當t值小于50ii.1當t值介于51-60iii.2當t值介于61-70iv.3當t值介于71-80v.4當t值介于81-90vi.5當t值介于91-100而該寡核酸根據該得到的數值加以排序。6、根據權利要求l所述的獲得寡核酸以作為一有效抗癌劑的方法，其特征為與癌化有關的基因是選自Wntl、Her3及Wnt2其中之一。7、該寡核酸提供根據上述申請專利范圍之一的方法所得到的癌癥細胞凋亡至少50%的量。8、根據權利要求7所述的該寡核酸，其特征為選自表格l中的寡核酸。9、一用以抑制腫瘤細胞增殖的siRNA分子，包括圖1中一來自Wntl基因的mRNA序列的一1530連續核酸的序列。10、根據權利要求9所述的siRNA分子，其特征為用以抑制前列腺癌細胞及/或胰臟癌細胞的增殖。11、根據權利要求7或9所述的siRNA分子，其特征為包括一已知化學修飾。12、根據權利要求7到11任一項所述的一抗癌藥劑制造中的一siRNA分子。13、根據權利要求12所述的siRNA分子，其特征為所制造的該抗癌藥劑是用以抑制細胞凋亡的增殖及/或誘導。全文摘要本發明是應用雙螺旋寡核酸(siRNA)干擾與癌化有關的基因的mRNA，特別是Wnt1、Wnt2或Her3基因。這樣的寡核酸可進行化學修飾，使用在與病毒性和非病毒性載體相接合，例如脂質復合物。這樣的寡核酸顯示出不凡的抗腫瘤細胞的抗增殖特性，因此可應用在抗癌治療。文檔編號G06F19/18GK101421398SQ200780011863公開日2009年4月29日申請日期2007年1月31日優先權日2006年1月31日發明者喬安娜·威奇克,凱塔琪娜·琪克薩史卡,安娜·內索威茲,帕特·珍·古珊達,梅西耶·維喬雷克,莫妮卡·蓮帕斯卡·帕奇拜茲申請人:塞隆藥商公司