一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復合免疫親和柱的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復合免疫親和柱。
【背景技術】
[0002]脫氧雪腐鐮刀烯醇(嘔吐毒素，DON)和玉米赤霉烯酮同屬鐮刀霉毒素，主要是由鐮刀菌屬真菌產生，常見于小麥，玉米等谷物中。可對人、畜產生廣泛的毒性效應，如食欲降低、體重減輕、代謝紊亂等。脫氧雪腐鐮刀烯醇污染谷物的狀況非常普遍，是檢出率和檢出量最高的真菌毒素之一，人畜攝入了被脫氧雪腐鐮刀烯醇污染的食物后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩和反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統造成死亡，但不同的動物對脫氧雪腐鐮刀烯醇的敏感程度不一，豬最敏感。另外脫氧雪腐鐮刀烯醇對免疫系統有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。
[0003]玉米赤霉烯酮是一種酚的二羥基苯酸的內酯結構，主要由禾谷鐮刀菌產生，粉紅鐮刀菌、竄珠鐮刀菌、三線鐮刀菌等多種鐮刀菌也能產生，首先由赤霉病玉米中分離得出。玉米赤霉烯酮具有雌激素樣作用，具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發生雌激素亢進癥，導致動物流產、死胎、返情等生殖異常現象，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業帶來很大的經濟損失。2003年止，據世界糧農組織公布已有19個國家制定了食物中玉米赤霉烯酮的限量標準。
[0004]目前，真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法，免疫分析法及精密儀器分析法。其中，免疫分析方法主要有酶聯免疫法和膠體金免疫層析法，可以對樣品中的真菌毒素進行快速的定量、定性檢測；精密儀器分析法主要有高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液質聯用法，可以對樣品中的真菌毒素進行精確定性、定量分析，是真菌毒素檢測的確認方法。但是，由于需要檢測樣品種類繁多，影響因素各種各樣，要想使這些檢測方法能夠達到理想的檢測效果，則需要將樣品進行不同程度的前處理。
[0005]免疫親和柱是利用抗原抗體反應的高特異性和高親和力，用適當的方法將特異性的抗體結合到固相載體上，以便有效的分離、純化目標物質，具有選擇性高、富集能力強等優點，用于真菌毒素檢測的樣本前處理，可以更好的消除影響因素，減小基質效應，減少假陽性和假陰性的出現。
【實用新型內容】
[0006]本實用新型的目的在于提供一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復合免疫親和柱，用于樣品中脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮檢測的樣品前處理方法。
[0007]本實用新型所述的免疫親和柱由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。其所用瓊脂糖凝膠為CNBr-Sepharose 4B，每根親和柱含量為0.3ml_0.5ml ;每根親和柱所含抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體和抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體分別為0.8 mg -2.5mg和0.5 mg -2mg ;柱管為3ml或Iml的柱管。
[0008]本實用新型所述的免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進行:
[0009](I)抗體預處理:將純化好的抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體及抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體置于PH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03緩沖液中透析12h ；
[0010](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03緩沖液快速抽洗3次；
[0011](3)偶聯:將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHC03緩沖液抽洗；
[0012](4)封閉:將凝膠轉入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應2h ；
[0013](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0014](6)裝柱:將偶聯好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0015]本實用新型親和柱具有如下有益效果:
[0016](I)特異性好。本實用新型親和柱使用的是分別針對脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，只特異性純化、富集脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮。
[0017](2)減少了樣品前處理過程中有機化合物的使用。
[0018](3)可以對樣品中的脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮同時進行純化、富集。
【附圖說明】
[0019]圖1:親和柱結構示意圖。I為上帽，2為柱管，3、5為篩板，4為凝膠，6為下帽。
[0020]圖2:親和柱樣本純化流程圖。
【具體實施方式】
[0021]1、脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復合免疫親和柱的制備
[0022](I)抗體預處理:將純化好的抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體及抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體置于PH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03緩沖液中透析12h ；
[0023](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03緩沖液快速抽洗3次；
[0024](3)偶聯:將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHC03緩沖液抽洗；
[0025](4)封閉:將凝膠轉入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應2h ；
[0026](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0027](6)裝柱:將偶聯好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0028]2、脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復合免疫親和柱的使用方法
[0029](I)取25g粉碎的樣品與10ml甲醇-水(7:3)溶液混合；
[0030](2)加入5.0g氯化鈉以均質器高速攪拌，提取2分鐘；
[0031](3) 4000r/min離心5min或用定性濾紙過濾；
[0032](4)取1ml濾液并加入40ml水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾；
[0033](5)取20ml (4)步濾液，以約6ml/min流速緩慢通過免疫親和柱；
[0034](6)以10.0ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2ml~3ml空氣通過柱體；
[0035](7)準確加入1.0ml色譜級甲醇洗脫，流速為I ml/min ~2ml/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
【主權項】
1.一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮的復合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。
2.根據權利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠為CNBr-Sepharose4B。
3.根據權利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體分別為0.8 mg -2.5mg和0.5 mg -2mg。
4.根據權利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含瓊脂糖凝膠為0.3ml_0.5ml。
5.根據權利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的柱管為3ml或Iml的柱管。
【專利摘要】本實用新型涉及一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮的復合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成，瓊脂糖凝膠上偶聯了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部，柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。本實用新型能夠與脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮特異結合，可用于飼料、食品等樣本中脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮污染檢測的樣本前處理，起到凈化、富集作用。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號】CN204556644
【申請號】CN201520250082
【發明人】張波, 王松雪, 謝剛
【申請人】北京康源泰博生物科技有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月23日