一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及了一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，可以實現納他霉素的快速檢測，適用于大量樣品的現場檢測、進出口牛奶的快速檢測與應急處理，屬于免疫檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]納他霉素是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，屬于多烯大環內酯類。它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產生，可廣泛用于食品防腐保鮮以及抗真菌治療。納他霉素對細菌沒有抑制作用，因此它不影響酸奶、奶酪、生火腿、干香腸的自然成熟過程。1982年6月，美國FDA正式批準納他霉素可以用作食品防腐劑。1996年，中國食品添加劑標準化技術委員會正式批準納他霉素可作為食品防腐劑。
[0003]目前，納他霉素的測定方法主要有生物效價法、微孔板生物檢測法、紫外分光光度計法、元素分析法、比色分析法、薄層色譜法和液相色譜法等。生物效價測定法對實驗環境因素(溫度等)、材料因素(培養基等)、操作技術等條件要求高，操作過程也比較繁瑣；微孔板生物檢測法適用大批量的發酵液或樣品的檢測；紫外分光光度法一般用來做納他霉素檢測的常規對照，若將其用于定量分析，對實驗條件要求比較高；元素分析法、比色分析法和薄層色譜法主要用于納他霉素的定性分析；高效液相色譜法(HPLC)多集中于高純度納他霉素產品及食品中納他霉素殘留量的檢測分析，但是這種方法的樣品前處理繁瑣、耗時、儀器貴重、需要專業人員來操作，不能實現大量樣品的同時檢測。因此建立一種快速、簡單、高通量的納他霉素檢測方法具有重要意義。酶聯免疫吸附分析法(ELISA)是一種極為高效、靈敏的檢測方法。而膠體金試紙條具有操作簡單、穩定性高、不需要借助專門儀器、適合現場快速檢測的優點。
【發明內容】
[0004]本實用新型的目的在于提供一種檢測納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩定性好，成本低廉。
[0005]本實用新型的技術方案:一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，在PVC底板兩端分別設有樣品墊和吸水墊；在PVC底板中部設有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設有金標墊；金標墊的一端與樣品墊相疊加，另一端疊加在硝酸纖維素膜檢測層上；在硝酸纖維素膜檢測層上依次設有檢測線和質控線。
[0006]所述金標墊上包被有金標標記抗納他霉素抗體2A4。所述檢測線上包被有納他霉素抗原。所述質控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0007]所述納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備方法，步驟如下:
[0008](I)納他霉素單克隆抗體的制備
[0009]單克隆抗體是采用納他霉素免疫原經過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。納他霉素與蛋白的偶聯物做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進行首免，100 μ g/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，50 yg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，50ug/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第七周尾部采血測效價，挑選對納他霉素效價最高，抑制最好的老鼠；第九周進行沖刺免疫，30 yg/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進行融合、篩選。
[0010](2)納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
[0011]a、空白膠體金的制備:采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200HiL去離子水和2 mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4 mL 1%檸檬酸鈉，繼續加熱15-20 min，至呈亮紅色，然后室溫中冷卻，4°C冷藏保存；
[0012]b、膠體金標記抗體的制備:空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調節pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(I)制備的抗體，每mL膠體金加入30 Ug抗體2A4，繼續攪拌30 min,離心，吸取上清，用金標抗體保存液(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0013]C、金標墊的制備:調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將0.2 mg/mL標記好膠體金的抗納他霉素抗體2A4均勻的噴在玻璃纖維膜檢測層上，噴液量0.6 μ L/cm，37°C烘干過夜，封袋備用；
[0014]d、包被膜的制備:
[0015]調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將稀釋好的0.2 mg/mL納他霉素抗源均勻噴在硝酸纖維素膜檢測層上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，噴液量為0.6 μ L/cm, 370C烘干過夜，封袋備用。
[0016]將PVC底板、樣品墊、金標墊、涂有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜檢測層、和吸水墊組合，即得產品納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0017]其適用于海關、企業、檢驗檢疫單位等，可實現牛奶樣本中納他霉素的快速檢測。
[0018]本實用新型的有益效果:
[0019]1、檢測速度快，全過程只需要5 min即可，可以實施大批量樣品的快速檢測；
[0020]2、靈敏度高，樣本中納他霉素濃度達到20 ng/mL時，膠體金試紙條的T線完全不顯色；
[0021]3、操作簡便，無需經過專業培訓，易于推廣；
[0022]4、不需要儀器，適合現場檢測；
[0023]5、過程簡單，直接上樣檢測，樣品前處理簡單。
【附圖說明】
[0024]圖1是本實用新型結構示意圖。
[0025]附圖標記說明:
[0026]1、樣品墊；2、金標墊；3、檢測線(T線)；4、質控線(C線)；5、吸水墊；6、硝酸纖維素膜檢測層；7、PVC底板。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]如圖1所示，一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，包括PVC底板7，在PVC底板7兩端分別設有樣品墊I和吸水墊5 ;在PVC底板7中部設有硝酸纖維素膜檢測層6，在硝酸纖維素膜檢測層6與樣品墊I之間設有金標墊2 ;金標墊2 —端與樣品墊I相疊加，另一端疊加在硝酸纖維素膜檢測層6上；在硝酸纖維素膜檢測層6上按先后順序設有檢測線(T線)3和質控線(C線)4。
[0029]所述金標墊2上包被有金標標記抗納他霉素抗體2A4 ;所述檢測線(T線)3上包被有納他霉素抗原；所述質控線(C線)4上包被有羊抗鼠IgG。
[0030]實施例2
[0031]所述納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備方法，其步驟是:
[0032](I)納他霉素單克隆抗體的制備:
[0033]單克隆抗體是采用納他霉素免疫原經過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。納他霉素與蛋白的偶聯物做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進行首免，100 μ g/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，50 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，50 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第七周尾部采血測效價，挑選對納他霉素效價最高，抑制最好的老鼠；第九周進行沖刺免疫，30 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進行融合、篩選。
[0034](2)納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
[0035]a、空白膠體金的制備:采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2 mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4 mL 1%檸檬酸鈉，繼續加熱15-20 min，至呈亮紅色，然后室溫中冷卻，4°C冷藏保存；
[0036]b、膠體金標記抗體的制備:空白膠體金溶液用0.1 M K2CO3調節pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(I)制備的抗體，每mL膠體金加入30 Ug抗體2A4，繼續攪拌30 min,離心，吸取上清，用金標抗體保存液(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0037]C、金標墊的制備:調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將0.2 mg/mL標記好膠體金的抗納他霉素抗體2A4均勻的噴在玻璃纖維膜檢測層上，噴液量0.6 μ L/cm, 37°C烘干過夜，封袋備用；
[0038]d、包被膜的制備:
[0039]調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將稀釋好的0.2 mg/mL納他霉素抗源均勻噴在硝酸纖維素膜檢測層上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，噴液量為0.6 μ L/cm, 370C烘干過夜，封袋備用。
[0040]將PVC底板、樣品墊、金標墊、涂有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜檢測層、和吸水墊組合，即得產品納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0041]本實用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術，利用間接競爭法原理檢測樣品中是否含有納他霉素。當待檢樣品中含有納他霉素時，抗原先和膠體金標記的抗納他霉素抗體2A4結合，由于層析作用復合物沿包被膜向前移動，當遇到檢測線上的納他霉素抗原時，形成抗體-抗原-金標抗體復合物，在檢測線上富集，形成紅色沉淀線。
[0042]檢測時按如下步驟處理檢測樣品:牛奶直接稀釋10倍即可進行樣品檢測。
[0043]檢測時如樣品為陰性，則試紙條質控線C線，檢測線T線均顯色；如果樣品為陽性，納他霉素濃度大于20 ng/mL，則試紙條只有質控線C線顯色。如果試紙條C線不顯色，則說明試紙條質量出現問題。
【主權項】
1.一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特征在于:在PVC底板(7)兩端分別設有樣品墊(I)和吸水墊(5);在PVC底板(7)中部設有硝酸纖維素膜檢測層(6)，在硝酸纖維素膜檢測層(6)與樣品墊(I)之間設有金標墊(2);金標墊(2)的一端與樣品墊(I)相疊加，另一端疊加在硝酸纖維素膜檢測層(6)上；在硝酸纖維素膜檢測層(6)上依次設有檢測線(3)和質控線(4)。
2.根據權利要求1所述納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特征在于:所述金標墊(2)上包被有金標標記抗納他霉素抗體2A4。
3.根據權利要求1所述納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特征在于:所述檢測線(3)上包被有納他霉素抗原。
4.根據權利要求1所述納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特征在于:所述質控線(4)上包被有羊抗鼠IgG。
【專利摘要】一種納他霉素的免疫膠體金快速檢測試紙條，屬于免疫檢測技術領域。該試紙條由PVC底板、樣品墊、涂覆金標標記抗納他霉素抗體（2A4）的金標墊，在檢測線包被有納他霉素抗原和在質控線包被有羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜檢測層、及吸水墊構成，依次按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜檢測層、吸水墊順序粘附在PVC底板上。該試紙條操作簡便、快速、準確，全過程只需5min，不受環境條件的干擾，特異性好，檢測靈敏度高，檢測限為20ng/mL。本實用新型適用于海關、企業、檢驗檢疫單位等，可實現牛奶中納他霉素的快速檢測。
【IPC分類】G01N33-557, G01N33-532
【公開號】CN204556636
【申請號】CN201520068182
【發明人】劉麗強, 陳燕妮, 胥傳來, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 宋珊珊, 吳曉玲
【申請人】江南大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年1月29日