一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，包括采用有機溶劑對純鈦金屬或低模量雙相鈦金屬進行陽極氧化；采用顯微手段表征所述陽極氧化的產物顯微結構；制備納米孔和納米管形貌的鈦金屬件；分離骨髓間充質干細胞，取三代細胞黏附在經表面修飾的金屬件上孵育；通過MTT、DYPI細胞核染色、SEM觀察細胞的黏附效果；將孵育細胞的金屬測試件放于無菌彈性板的培養孔中，恒溫狀態下置于萬能試驗系統給予不同周期、頻率和載荷壓應力；在SEM電鏡或光學顯微鏡觀察、測試細胞形變，并檢測細胞增殖、分化表現。本發明所述方法能夠使得修飾后的鈦基底表面的彈性形變信號被放大，從而影響附著其上的成骨細胞獲得更大刺激，引起更大的細胞骨架改變。
【專利說明】
一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫用生物材料領域，尤其涉及一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架 改變的方法。
【背景技術】
[0002] 鈦金屬在適當應力刺激下會發生非線彈性形變，這種形變受彈性模量、形態、直 徑、立體構架等物理要素的影響，在負重行走或彈跳等過程中，循環往復的應力會導致鈦金 屬支架產生極其細微的彈性形變;而成骨細胞及干細胞是力學信號敏感或響應細胞，研究 證明在細胞與基底間的各種力學信號可通過干細胞表面受體激活特定的力轉導途徑進而 調節干細胞的分化。即使在缺乏生物化學刺激的情況下力學因素也能調控干細胞自我更新 和譜系分化。但單純的鈦金屬支架彈性形變非常細微，對細胞骨架的改變也非常細微，這就 造成了成骨細胞或干細胞分化速度減小和比例減少，不利于各類骨的修復和替換。
[0003] 因此，本領域的技術人員致力于開發一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變 的方法，能夠使得改性后的鈦基底表面的彈性形變信號被放大，從而影響附著其上的成骨 細胞獲得更大刺激，引起更大的細胞骨架改變。
【發明內容】
[0004] 有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是如何放大鈦金屬彈性 形變的信號，使之引起更大的細胞骨架改變。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供了一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方 法，包括以下步驟：
[0006] 步驟1、采用有機溶劑對純鈦金屬或低模量雙相鈦金屬進行陽極氧化；
[0007] 步驟2、采用顯微手段表征所述陽極氧化的產物顯微結構；
[0008] 步驟3、制備納米孔和納米管形貌的鈦金屬表面納米化修飾測試件；
[0009] 步驟4、分離骨髓間充質干細胞hMSCs，取三代細胞黏附在經表面納米化修飾的金 屬測試件上孵育；
[0010] 步驟5、通過MTT法、DYPI細胞核染色法、SEM觀察細胞的黏附效果；
[0011] 步驟6、將孵育細胞的金屬測試件放于無菌彈性板的培養孔中，恒溫狀態下置于萬 能試驗系統給予不同周期、頻率和載荷壓應力；
[0012] 步驟7、在SEM電鏡或光學顯微鏡觀察、測試細胞形變，并檢測細胞增殖、分化表現。
[0013] 進一步地，步驟1中，所述有機溶劑為醇基氧化介質。
[0014] 進一步地，所述醇基氧化介質為含有鈣和磷元素的乙醇溶液。
[0015] 進一步地，步驟2中，所述顯微手段包括場發射掃描電鏡、原子力顯微鏡、X射線衍 射儀、俄歇能譜儀、X射線光電子能譜儀。
[0016] 進一步地，步驟2中，所述顯微結構包括相組成、晶體結構、微觀形貌和元素分布。
[0017] 進一步地，步驟3中，所述納米管的高度為100nm~lOOOnm。
[0018] 進一步地，步驟4中，所述三代細胞的取用量為l*104/ml。
[0019] 進一步地，步驟4中，所述孵育的時間為4~12小時。
[0020] 進一步地，步驟7中，所述載荷壓應力為100~500N。
[0021 ] 進一步地，所述納米管的高度為lOOOnm。
[0022] 為了提高鈦合金的抗腐蝕性和生物學性能，包括生物相容性和生物活性，常常需 要對鈦合金進行表面改性。通過調整陽極氧化工藝參數，可以在鈦金屬表面制作納米坑、納 米管等不同形貌。當細胞接種在不同納米管長度的材料表面時，相同的基底變形即可導致 不同的細胞形變量。目前已可以在鈦金屬表面制備大面積均勻生長的具有良好生物學特性 的納米坑及納米管陣列，并且實現了對納米管高度、直徑等的可控制備。本發明所述的技術 方案就是利用在鈦金屬表面制備不同高度的納米管來控制附著在金屬上的細胞的形變量。 在納米坑表面，細胞形變量最小，隨著納米管高度的增加，同樣的鈦金屬基底形變就會造成 附著在其表面細胞的骨架發生更大的變化，也即通過納米管高度可以放大鈦金屬形變產生 的力學信號。
[0023] 以下將結合附圖對本發明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以 充分地了解本發明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0024] 圖1是純鈦金屬表面附著成骨細胞或干細胞的示意圖；
[0025] 圖2是純鈦金屬經過表面改性后附著成骨細胞或干細胞的示意圖；
[0026] 圖3是本發明的一個較佳實施例的較長納米管附著成骨細胞或干細胞的示意圖；
[0027] 其中，1-骨髓間充質干細胞，2-鈦金屬基底，3-氧化鈦納米管。
【具體實施方式】
[0028] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0029] 本發明提供了一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，如圖1、圖2和 圖3所示，包括以下步驟：
[0030] 采用有機溶液（以醇基氧化介質為電解液，如含鈣和磷元素的乙醇溶液)對純鈦及 低模量雙相鈦金屬測試件進行陽極氧化，用場發射掃描電鏡、原子力顯微鏡、X射線衍射儀、 俄歇能譜儀、X射線光電子能譜儀等手段系統表征陽極氧化產物的顯微結構，包括相組成和 晶體結構、微觀形貌、元素分布等。制備納米孔和1〇〇11111，20〇11111，50〇11111，100〇111]1不同高度的納 米管形貌的鈦金屬表面納米化修飾測試件。
[0031] 分離骨髓間充質干細胞hMSCs，取l*104/ml的三代細胞與未處理及表面納米化修 飾的金屬測試件孵育4h、8h及12h。通過MTT法、DYPI細胞核染色法、SEM等技術觀察細胞的黏 附效果。將孵育細胞的金屬測試件放于無菌彈性板的培養孔中，恒溫狀態下置于萬能試驗 系統給予不同周期、頻率和載荷壓應力。未加力試件作為對照組。
[0032] SEM電鏡、光學顯微鏡等觀察、測試細胞形變，并檢測細胞增殖、分化表現。實驗顯 示，給予鈦金屬基底相同的形變，細胞形變量隨納米管高度增加而增加。給予200μπι*2.25cm 鈦金屬基底100~500N壓應力，在相同基底形變情況下，鈦金屬試件中心位置，非納米化表 面細胞形變量為〇. 5%，100nm高度納米管表面細胞出現1 %的形變，隨著納米管高度增加， 細胞形變量逐漸增加至l〇〇〇nm時3%的細胞形變。
[0034]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，包括以下步驟：。 步驟1、采用有機溶劑對純鈦金屬或低模量雙相鈦金屬進行陽極氧化； 步驟2、采用顯微手段表征所述陽極氧化的產物顯微結構； 步驟3、制備納米孔和納米管形貌的鈦金屬表面納米化修飾測試件； 步驟4、分離骨髓間充質干細胞hMSCs，取三代細胞黏附在經表面納米化修飾的金屬測 試件上孵育； 步驟5、通過MTT法、DYPI細胞核染色法、SEM觀察細胞的黏附效果； 步驟6、將孵育細胞的金屬測試件放于無菌彈性板的培養孔中，恒溫狀態下置于萬能試 驗系統給予不同周期、頻率和載荷壓應力； 步驟7、在SEM電鏡或光學顯微鏡觀察、測試細胞形變，并檢測細胞增殖、分化表現。2. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟1中，所述有機溶劑為醇基氧化介質。3. 如權利要求2所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，所 述醇基氧化介質為含有鈣和磷元素的乙醇溶液。4. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟2中，所述顯微手段包括場發射掃描電鏡、原子力顯微鏡、X射線衍射儀、俄歇能譜儀、X射 線光電子能譜儀。5. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟2中，所述顯微結構包括相組成、晶體結構、微觀形貌和元素分布。6. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟3中，所述納米管的高度為lOOnm~lOOOnm。7. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟4中，所述三代細胞的取用量為1*104/ml。8. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟4中，所述孵育的時間為4~12小時。9. 如權利要求1所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于，步 驟7中，所述載荷壓應力為100~500N。10. 如權利要求6所述的利用納米管高度輔助控制細胞骨架改變的方法，其特征在于， 所述納米管的高度為lOOOnm。
【文檔編號】G01Q30/02GK106093475SQ201610362375
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】李慧武, 朱振安, 常永云, 戴尅戎, 曲新華
【申請人】上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院