同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的新方法
【專利摘要】本發明公開了同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的新方法，（1）制備鑒定芯片；（2）將待鑒定溶液注入到步驟（1）中鑒定芯片的檢測位點內，待鑒定溶液中的抗體分子與所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結合，導致芯片的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密度發生變化；然后進行沖洗；（3）采用橢偏顯微成像儀檢測步驟（2）中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否包含弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。該方法可以快速、準確同時定性和定量檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒。
【專利說明】
同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的新方法
技術領域
[0001] 本發明屬于檢測鑒定技術領域，具體涉及同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹 病毒的新方法。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲是專性細胞內寄生蟲，球蟲亞綱，真球蟲目，等孢子球蟲科、弓形體屬。該蟲 呈世界性分布，人和許多動物都能感染，可寄生在除紅細胞外的所有有核細胞中，隨血液流 動，到達全身各部位，損傷大腦、心臟、眼底，致使機體免疫力下降，患各種疾病。人體感染后 多處于隱性感染狀態，只有當機體免疫力低下時，蟲體被激活并迅速增殖，致病力增強。由 于Τ0Χ對人類健康造成了很大的威脅，對這種疾病的臨床感染診斷的時效性、精確性的要求 也越來越高。
[0003] 風疹是由風疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病。主要通過呼吸道和直接接觸傳 播。其臨床特征為上呼吸道輕度炎癥、發熱、全身紅色斑丘疹、耳后、枕后及頸部淋巴結腫 大，病情較輕，預后良好。孕婦在懷孕早期感染風疹，易導致胎兒發生先天性風疹綜合癥。風 疹病毒為RNA病毒，屬于披蓋病毒屬。風疹病毒抗原結構穩定，只有一種抗原型，只感染人 類。
[0004] 單純皰疼病毒(herpes simplex virus，HSV)是屬于皰疼病毒科a病毒亞科的線性 雙鏈DNA病毒。HSV能引起人類多種疾病，如齦口炎（gingivostomatitis)、角膜結膜炎 (keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統感染和新生兒的感染。在感 染宿主后，常在神經細胞中建立潛伏感染，激活后又會出現無癥狀的排毒，在人群中維持傳 播鏈，周而復始地循環。根據抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。1型主要由口唇病 灶獲得，2型可從生殖器病灶分離到。人群被病毒感染發生后四個月到數年被感染的人數可 達人口總數的50-90 %，是最易侵犯人的一種病毒，但在臨床僅有一部份發病。此病可分為 口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性皮膚炎、陰部皰疹和卡波西病等。
[0005] 在弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹感染的實驗室診斷中，PCR技術是目前實驗診斷這 三種病毒感染的金標準，但一般實驗室很難做到嚴格的質量控制，因而其臨床推廣受到一 定的限制。ELISA是目前最常用的方法，但是實驗的假陽性率高。
[0006] 生物芯片是20世紀90年代發展起來的一種新的技術平臺，具有集成化、高通量、高 密度的優勢。根據固相載體上固定的生物分子的不同，可以將生物芯片劃分為DAN芯片、蛋 白質芯片等。隨著研究的進一步深入，蛋白質芯片已廣泛應用于許多研究領域。蛋白質芯片 運用于醫學檢驗，則是結合了微陣列的高通量、集成化和免疫檢測的靈敏、特異的特點可以 方便、快速，并且準確地大批量、平行檢測多樣本、多項目。
[0007] 目前傳統的蛋白質芯片技術在檢測上以熒光標記方法為主。但是，蛋白質分子標 記常常可能導致以下幾方面的問題。首先，蛋白質分子的化學不均一性，使得標記方法很難 用于定量分析。因為化學不均一性使得一些蛋白質分子的標記效果優于另外一些蛋白質分 子，即導致標記的不均一性，在缺少精確矯正的情況下，蛋白質芯片上熒光絕對強度是沒有 統計學意義的。其次，實驗需要嚴格控制標記條件，并且為每一種蛋白質分子建立矯正曲 線。最后，標記蛋白質分子可能影響其生物活性。目前所使用的蛋白質檢測技術，如酶聯免 疫反應、放射性核素及蛋白芯片技術等都需要分子標記，而表面增強激光解吸/離子化飛行 時間質譜（SELDI - TOF-MS)技術和光學蛋白質芯片技術不需要分子標記，可以直接分析待 測樣品，但是SELDI技術設備非常昂貴，阻礙了它的應用。
[0008] 基于現有技術，目前并沒有報道可以同時檢測或/鑒定以上三種病原體的生物蛋 白芯片，并且由于弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹三種病原體抗原之間具有較大的差異，使得 結合在同一芯片上具有較大的難度。
[0009] 橢偏光學顯微成像技術是近幾年發展起來的一項用于超薄膜檢測的技術。該技術 的特點是厚度分辨率極高，能夠達到O.lnm。研究表明，絕大部分蛋白質在固體表面上形成 的單分子飽和吸附膜層幾何厚度在2~l〇nm的范圍內，膜層是薄而透明的，在物理上，屬于 超薄相位體。由于相位體不引起探測光波的幅值變化，即使用顯微鏡也難以觀測。但是這種 技術效果的呈現前提是需要篩選合適的蛋白芯片以及合適的操作條件，否則即使應用橢偏 顯微成像技術也無法得到較好的檢測和/或鑒定效果。
[0010] 檢測和/或鑒定臨床樣本中的病原體(細菌、酵母和其它真菌、寄生蟲和病毒)的經 典方法包括培養該樣本以擴大所存在病原體的數目，直到可觀察的菌落生長，然后該菌落 生長可以通過標準的實驗室檢驗鑒定和計數。為了準確地鑒定感染種類，醫生必須依賴于 可能需要從3天(如在大多數細菌的情況下)到8周之間的任何長度的時間的培養結果。為了 準確地鑒定細菌的種類，該培養隨后進行可能需要另外數天甚至數周時間的大范圍生物化 學檢驗。大多數情況下，由于疾病的嚴重程度，使這一確定過程快速和準確完成是非常重要 的。在采用經典方法時，有可能會產生錯誤，這些錯誤有時導致對病原體的不明確的鑒定， 而因此導致對病原體錯誤的判斷。
[0011] 因此，一種快速、簡單、直接、高通量的具體方法并能同時檢測和鑒定弓形蟲、風疹 病毒和單純皰疹病毒是迫切需要的。
【發明內容】
[0012] 本發明的目的是利用橢偏顯微成像技術檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純 皰疹病毒的新方法。
[0013] 本發明采用的技術方案是：
[0014] 本發明的第一個目的是提供一種用于同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒 的方法，包括以下步驟：
[0015] (1)制備鑒定芯片：
[0016] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到鑒定芯 片；
[0017] (2)實施鑒定：
[0018] 將待鑒定溶液注入到步驟（1)中鑒定芯片的檢測位點內，所述注入速度為1.4~ 1.6μ1/π?η，待鑒定溶液中的抗體分子與所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結合，導致芯片 的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密度發生變化;然后進行沖洗；
[0019] (3)讀取芯片：
[0020] 采用橢偏顯微成像儀檢測步驟(2)中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否含 有弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。
[0021] 優選的，所述單純皰疹病毒的類型為單純皰疹病毒2型。
[0022] 步驟（1)中，羧基改性表面的硅片的制備：首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用 氨基硅烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后 采用飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0023] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~3h，優選為2h。
[0024]經過大量實驗驗證和分析，本發明優先選用硅片作為鑒定基片，硅片具有表面平 整，光滑度好，可以進行各種表面化學修飾，使得最終的檢測和/或鑒定效果更加優異。由于 硅片的表面對于檢測和/或鑒定結果非常重要，經過大量實驗，對多種改性表面進行篩選， 篩選出來蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干擾弱的羧基化學表面作為檢測表面，尤 其是與表面醛基改性的硅片相比，羧基改性的芯片表面反應表面細膩均勻，本底灰度值低， 對試驗干擾少。
[0025] 在裝配抗原(探針)之前，需要將表面羧基改性的硅片置于微流控檢測膜片上，采 用微流控芯片加樣系統進行點加探針。加樣流速對檢測和/鑒定效果具有一定的影響，不合 適的加樣流速會導致檢測和/或鑒定結果不準確。本發明優選的探針微流控加樣流速為1.4 ~1.6μ1/η?η(更優選為 1.5μ1/η?η)。
[0026] 本發明優選三種被鑒定物質的抗原作為探針，該探針與硅片表面結合力較高。 [0027] 本發明優選探針濃度為0.08~0.12mg/mL。本發明的探針濃度0.08~0.12mg/ml的 時候，檢測和/鑒定效果較好，并且增加探針濃度，敏感性沒有明顯提高，經過反復實驗確 定，0. lmg/ml為最佳探針濃度。
[0028]為了盡可能排除非特異性吸附，需要選擇好的封閉試劑。本發明試驗了多種封閉 試劑，選擇芯片表面非特異性吸附越少封閉效果越好，優選BSA為封閉試劑，其濃度優選為6 ~8mg/mL(更優選為7mg/mL)。
[0029] 采用40~60μ1 (優選為50yl)PBS進行沖洗，沖洗速度為8~12μ1/η?η，優選為10μ1/ min〇
[0030] 步驟(2)中，步驟(2)中，所述待鑒定溶液為體液、血液、細胞培養上清液等。
[0031] 待鑒定溶液的注入速度為1.4~1.6μ1/π?η，用量為10~12μ1。實驗發現，待鑒定溶 液的點加速度在1.5μ1/π?η時，反應效果較好，探針和被鑒定物能夠充分特異性結合，并且 被鑒定物1〇μ1即可以被鑒定到。
[0032] 采用40~60μ1 (優選為50yl)PBS進行沖洗，沖洗速度為8~12μ1/η?η，優選為10μ1/ min〇
[0033] 步驟(3)中，在采用橢偏顯微成像儀鑒定之前，對鑒定芯片進行處理，處理方法為： 采用去離子水沖洗后氮氣吹干。
[0034] 上述檢測和/或鑒定方法屬于非診斷目的檢測和/或鑒定方法。
[0035]本發明的第二個目的是提供一種橢偏顯微成像蛋白芯片，該芯片是由以下方法制 備得到：
[0036] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到 橢偏顯微成像蛋白芯片。
[0037] 其中，羧基改性表面的硅片的制備:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅 烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽 和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0038] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~3h，優選為2h。
[0039] 弓形蟲亦稱速殖體或滋養體，是細胞內寄生蟲，呈新月形，大小為5~13μπι;風疹病 毒是單正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科(togavirus)是限于人類的病毒，電鏡下多呈不規則 球形，直徑50~70nm的核心；單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科a病毒亞科，病毒大小約為180nm 左右；由于三種病原體在結構上和大小上具有非常大的差異，在設計芯片的最困難的部分 是設計成弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒三種病毒的抗原同時固定在同一芯片上，從而 使的在同一芯片上檢測或/和鑒定這三種病毒的抗體成為可能。
[0040] 本發明優先選用上述羧基改性制備方法制備得到羧基改性表面的硅片，使得三種 抗原可以同時結合在該羧基改性表面的硅片上。這在現有技術中是不存在或不存在相應的 技術啟示得到使用該羧基改性方法得到硅片可以同時結合這三種抗原。
[0041] 該橢偏顯微成像蛋白芯片與上述的一種同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病 毒的方法中的鑒定芯片相同，不再贅述。
[0042]本發明的第三個目的是提供一種橢偏顯微成像蛋白芯片的制備方法，包括以下步 驟:將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針:在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風疹病毒和單純 皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到光學蛋 白質鑒定芯片。
[0043] 其中，羧基改性表面的硅片的制備:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅 烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽 和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0044] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~2.5h，優選為2h。
[0045] 本發明的蛋白芯片的制備方法，直接在羧基改性表面的硅片上進行裝配抗原，無 需將羧基改性表面的硅片進行激活等步驟之后再進行裝配，同時也說明了本發明的蛋白芯 片的羧基改性的表面能同時較好的固定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒抗原。
[0046] 本發明的第四個目的是提供上述橢偏顯微成像蛋白芯片在檢測和/或鑒定弓形 蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒中的應用，以及提供在制備用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、 風疹病毒和單純皰疹病毒的試劑盒的應用。應用方法如下：
[0047]將待鑒定溶液注入到所述橢偏顯微成像蛋白芯片的檢測位點內，待鑒定溶液中的 抗體分子與所述芯片上的抗原分子特異性結合;然后采用橢偏顯微成像儀檢測所述芯片上 各檢測位點分子膜層的厚度變化，由此判定待鑒定溶液中是否包含弓形蟲、風疹病毒和單 純皰疹病毒以及獲得它們的含量。
[0048] 本發明的第五個目的是提供一種用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單 純皰疹病毒的試劑盒，該試劑盒包含所述蛋白芯片;進一步，該試劑盒還包括PBS緩沖液、去 離子水、陰性對照品：人免疫球蛋白G等。
[0049] 光學蛋白質芯片是利用橢偏光生物顯微成像技術發展起來的蛋白質芯片，通過對 蛋白質芯片上分子膜層的表面密度分布及厚度變化對入射光波進行調制，使得反射光或透 射光的橢偏狀態發生改變，通過CCD攝像導入計算機，在相應的物理模型和圖像處理下可以 顯示樣品分子膜層的密度分布與厚度，以此推導出蛋白質的信息。
[0050] 基于橢偏顯微成像技術的蛋白質芯片是利用抗原-抗體特異性結合的原理，將具 有生物活性的蛋白質分子，裝配于固相光學拋光的硅片表面上，形成單分子膜層，即感應表 面。感應表面接觸待鑒定的溶液，如果溶液中的蛋白質分子與芯片上的蛋白質分子之間存 在特異性結合，就會在芯片表面形成復合分子，此復合膜層的厚度就會顯著增加。通過橢偏 光學顯微成像技術可以高分辨率地觀察到基片上膜層厚度的變化，從而可以判斷溶液中是 否含有能夠與感應表面上的蛋白質分子發生特異性結合的生物分子。
[0051] 橢偏光學顯微成像技術是用偏振光波為探測光照射樣品，樣品會對入射光波進行 調制，使得反射光中載有樣品的信息。在基底消光條件下，基片表面的生物分子膜層的厚度 (或表面密度）同反射光強的平方根成正比。光強用灰度值表示，膜層的厚度(或表面密度） 愈大，灰度值愈高。
[0052] 本發明的有益效果是：
[0053] (1)橢偏顯微成像蛋白芯片具體以下優點：1)無需任何標記:直接測量抗原-抗體 特異性結合的復合物，不需要像酶聯免疫反應和普通蛋白芯片等對生物分子作標記，不會 對生物活性產生影響等。2)直接檢測和/鑒定樣品:在臨床檢測和/或鑒定時，可以直接鑒定 待鑒定樣品，不需對樣品預處理，這樣更符合大規模臨床檢測和/或鑒定需要等。現代化臨 床醫學檢驗既需要結果準確、操作方便快捷、標準統一，又需要可以批量生產、成本低廉。3) 鑒定速度快:電子圖像采樣具有快速攝取圖像的能力，為生物分子動力學研究提供了可能。 4)在橢偏顯微成像蛋白芯片的陣列中，每一個位點只需要加入μL量級的試劑和樣本即可以 進行檢驗，相對于傳統的酶聯免疫等檢查方法的ml量級的試劑和樣本量，節約了數百倍的 試劑和樣本需求，大大節省了檢驗成本。5)檢測靈敏度高，可以達到0.005IU/mL，與現在應 用的傳統化學發光的靈敏度無差異。
[0054] (3)進一步的，通過反復實驗，篩選優化得到了檢測和/或鑒定方法的工藝參數，使 得采用橢偏顯微成像技術檢測弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒具有較好的檢測和/或鑒 定效果。本發明篩選出了蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干擾弱的羧基化學表面為 檢測表面，并篩選出了合適的PBS沖洗液和流速，以盡可能沖洗掉非特異性吸附而又保留了 特異性吸附；篩選出了合適的封閉試劑BSA及其濃度、用量和流速，以及待鑒定樣品的用量、 流速;并且經過進一步的優化篩選，建立了套標準化檢測和/或鑒定程序。一旦條件被標準 化，病原體的檢測和/或鑒定是十分簡單可靠的，且能夠由半熟練人員（非專業檢驗人員)完 成。
[0055] (4)進一步的，在弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒鑒定中，看到兩個對照點與芯 片本底灰度幾乎相同，說明選取的封閉試劑能夠后極好的封閉芯片表面，極好的減少了非 特異吸附。在陽性檢測位點上，灰度均明顯的高于隱性位點，SPSS統計學分析表明有顯著差 異，說明利用此蛋白芯片可以鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒。在進一步所做的鑒定 單純皰疹病毒反應蛋白的研究中，研究發現，不同濃度梯度的樣品通過檢測位點后，所顯示 的灰度（即分子膜層的厚度)也呈現不同灰度梯度，SPSS軟件統計學分析表明被鑒定樣品濃 度與對應的檢測位點的灰度威爾遜相關系數達9.53,并且呈明顯的線性關系，這說明采用 本發明篩選得到的橢偏顯微成像技術的微流控蛋白芯片可以定量檢測。
[0056] (5)本發明中提供的試劑盒能夠同時檢測和/或鑒定待檢測溶液中的弓形蟲、風疹 病毒和單純皰疹病毒，具有簡便、快速、檢測結果可靠等優點。
【附圖說明】
[0057] 圖1是分別檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒標準品的所得圖像。
[0058] 圖2是聯合檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒標準品的所得圖像。
[0059] 圖3是聯合檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒陽性血清的所得圖 像。
[0060] 圖4是檢測和/或鑒定不同濃度梯度風疹病毒抗體標準品所得圖像。
[0061 ]圖5檢測和/或鑒定風疹病毒IgG抗體標準品校準曲線。
[0062]圖6檢測和/或鑒定風疹病毒抗體陽性血清芯片圖。
[0063]圖7應用橢偏光學芯片檢測結果與酶聯免疫檢測結果對比柱狀圖。
【具體實施方式】
[0064]本發明中所用的實驗材料如下：
[0065]橢偏顯微成像儀（中科院力學研究所研制），微流控芯片加樣系統（中科院力學所 制造），單晶娃片(洛陽單晶娃片廠）；人免疫球蛋白G(Human IgG)(Sigma)、多克隆羊抗人免 疫球蛋白G抗體（Sigma)、人類血清白蛋白（HSA) (Sigma)、氨基硅烷（Sigma)、戊二醛 (Sigma)、單純皰疹病毒2型抗原(北京高達生物科技有限公司），風疹病毒抗原、弓形蟲抗原 (北京弘博康生物科技有限公司），單純皰疹病毒2型抗體、風疹病毒抗體、弓形蟲抗體 (ABcam公司），PBS緩沖液(PH7.4)溶解配制各種實驗用溶液及北京化學試劑廠生產的濃硫 酸等。
[0066] 實施例1
[0067] -種同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的方法，包括以下步 驟：
[0068] 1、硅片表面改性方式優化：
[0069] 本實施例采用了多種改性方法，現篩選兩種改性方式方法進行優化，步驟如下：
[0070] 1.1硅片去離子水沖洗3遍，氨基硅烷lmL、濃硫酸3mL浸泡硅片半小時，PBS沖洗硅 片3遍，戊二醛lmL、PBS 3mL浸泡硅片1小時，獲得表面呈醛基化學性狀的芯片。
[0071] 1.2硅片去離子水沖洗3遍，氨基硅烷lmL、濃硫酸3mL浸泡硅片半小時，無水酒精沖 洗硅片3遍，加入飽和琥珀酸鈉無水酒精溶液浸泡硅片2小時，獲得表面具有羧基性狀的芯 片。
[0072] 1.3分別檢測兩種不同性質的硅片表面的均勻程度和本底灰度的大小以及吸附蛋 白的強弱，選擇出合適的化學表面。
[0073] 2、芯片探針篩選
[0074] 2.1探針種類的選擇對三種目標檢測物的探針，分別選取2類公司產品，點加到檢 測位點上，然后粗測與標準品目標檢測物的結合強弱，選出結合好的用作探針。
[0075] 單純皰疹病毒2型抗原優選為北京高達生物科技有限公司的產品，風疹病毒抗原、 弓形蟲抗原優選為北京弘博康生物科技有限公司的產品。
[0076] 2 · 2探針濃度優化把選擇好的探針分別按濃度0 · 05mg/mL、0 · lmg/mL、0 · 2mg/mL等 濃度點加到檢測位點上，檢測各不同濃度的探針與被檢測樣品的結合程度，選擇結合好的 濃度作為探針濃度。
[0077] 3、封閉方法優化
[0078] 3.1封閉試劑的選擇為了盡可能排除非特異性吸附，需要選擇好的封閉試劑。分別 試驗了 BSA和HAS等多種試劑，封閉裝配有探針的芯片后，從檢測位點上加樣lmg/mL的人免 疫球蛋白溶液，然后PBS沖洗，芯片表面非特異性吸附越少封閉效果越好，篩選為封閉劑。 [0079] 3.2封閉試劑濃度的選擇把選擇好的封閉試劑按濃度2mg/ml、5mg/ml、7mg/ml等分 別封閉芯片，選擇非特異吸附最少得濃度作為封閉試劑的濃度。
[0080] 4、微流控加樣速度的優化
[0081 ] 4.1目標物檢測用量、微流控加樣速度和PBS沖洗速度優化
[0082] 選擇點加樣品的速度為1以1/11^11、1.5以1/1^11、2以1//1^11，以及？83沖洗速度541/ min、10yl/min、15yl/min等，選擇效果最好的速度為微流控加樣速度。
[0083] 5、標準化程序建立
[0084] 5.1通過以上摸索，本發明選擇了合適的硅片化學表面、篩選到了合適的探針、合 適的表面封閉劑、加樣速度和沖洗速度等參數。
[0085] 6、制備鑒定芯片
[0086] 6.1將表面羧基化處理后的硅片放置于微流控檢測膜片上。
[0087] 6.2裝配鑒定探針:在檢測位點上分別裝配選擇好的風疹病毒、單純皰疹病毒2型、 弓形蟲抗原，濃度0.1mg/mL，每個檢測位點10μ1，流速lmg/min，PBS緩沖液50μ1沖洗，流速10 μΙ/min。
[0088] 6.3封閉：711^/1111834封閉檢測位點，流速1.5以1/1^11，？83緩沖液5(^1沖洗，流速10 μΙ/min。
[0089] 7、實施檢測和/或鑒定：
[0090] 7.1標準品的檢測和/或鑒定：
[0091] 7.1.1單個標準品的檢測和/或鑒定:采用2X2點芯片檢測標準樣品，在第1行中選 擇2點作為對照點，對照點1為空白對照，對照點2為陰性對照（檢測注入10mg/ml的IgG 20μ 1，操作方法同下，以排除非特異性吸附），同一濃度標準品同時檢測2點。結果如圖1所示。
[0092] 7.1.2 3種標準品在同一芯片上檢測和/或鑒定:采用2 X 4點芯片檢測標準樣品， 在第1行中選擇2點作為對照點，對照點1為空白對照，對照點2為陰性對照(檢測注入10mg/ ml的IgG 20μ1，操作方法同下，以排除非特異性吸附），同一濃度標準品同時檢測2點。
[0093] 將被檢測和/或鑒定標準品分別注入檢測列位點，流速1.5yl/min，PBS液50μ1沖 洗，沖洗流速1 〇μ 1 /m i η。結果如圖2所示。
[0094] 7.2血樣檢測和/或鑒定:分別選取了3種抗體陽性和陰性的血清，按照標準品檢測 和/或鑒定方法檢測，取2點為對照，對照點與陽性血清檢測點對比，除了點加的為陰性血清 外，其余操作與陽性檢測點相同，其余4點為陽性血清檢測點。結果如圖3所示。
[0095] 8、讀取芯片：取下芯片，去離子水沖洗后氮氣吹干，置于橢偏光成像系統樣品板 上，鑒定芯片上各檢測位點分子膜層的厚度變化將呈現在計算機顯示器上，并且膜層厚度 和在顯示器上的灰度呈一致性變化，觀測和讀取實驗圖像和圖像的灰度值。
[0096] 9、陰性陽性檢測點電腦灰度值用SPSS統計學軟件做統計學分析。
[0097] 10、檢測結果：
[0098] 10.1表面改性方式優化
[0099] 本發明發現在光學顯像中，醛基化學表面的芯片相對對蛋白質吸附和羧基表面類 似，但羧基化學表面比醛基表面反應平面細膩均勻，本底灰度值低，對試驗干擾少，基于以 上試驗，優先選擇羧基化學表面的芯片。
[0100] 10.2探針篩選
[0101] 分別從2種探針中選擇和特異性抗體結合好的作為鑒定探針，并且發現探針濃度 0.1mg/ml的時候，檢測和/或鑒定效果最好，并且增加探針濃度，敏感性沒有明顯提高， 0. lmg/ml為最佳探針濃度。
[0102] 10.3封閉試劑篩選
[0103] 經過對多種封閉試劑的篩選，選擇BSA作為封閉試劑，濃度為7mg/ml。
[0104] 10.4目標檢測和/或鑒定用量、微流控加樣速度優化
[0105] 實驗發現樣品點加速度1.5μ1/π?η時，反應條件最好，探針和被檢測和/或鑒定物 能夠充分特異性結合，并且被檢測和/或鑒定物1〇μ1即可以被檢測和/或鑒定到。
[0106] 10.5標準化程序的建立
[0107]通過實驗，本發明建立了標準化檢測和/或鑒定程序：
[0108] (1)芯片表面應用羧基化學表面。
[0109] (2)封閉試劑選用BSA 7mg/mL。
[0110] (3)被檢測和/或鑒定樣品用量10μ1。
[0111] (4)試劑點加速度1.5yl/min，PBS沖洗速度ΙΟμΙ/min，沖洗50μ1。
[0112] 10.6檢測三類抗體的結果：
[0113]從圖3中可以看出，檢測單元中，3類病毒陽性血清灰度明顯高于陰性血清，說明檢 測單元中各致病微生物抗原捕獲到相應的致病微生物抗體并由光學芯片顯示出來灰度信 號的增加，說明基于橢偏成像的蛋白芯片可以檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹 病毒，并可進一步根據檢測單元灰度的高低定量被檢測和/或鑒定分子。經過大量實驗驗證 和分析，檢測靈敏度可以達到〇. 〇〇5IU/mL，靈敏度較高。
[0114]表1檢測標準品時對照點與標準品檢測點灰度值比較
[0116]表2檢測陽性血清各抗體檢測單元灰度值比較
[0118] 從表1和2中可以看出，檢測單元中灰度值結果：陽性血清灰度值顯著高于陰性血 清，應用SPSS統計學分析，3種被檢測和/或鑒定物對應灰度值陽性結果與陰性結果比較具 有顯著差異，p〈〇〇〇5。
[0119] 在本發明中，通過反復實驗，篩選出了蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干 擾弱的羧基化學表面為檢測表面，并篩選出了合適的PBS沖洗液和流速，以盡可能沖洗掉非 特異性吸附而又保留了特異性吸附；篩選出了合適的封閉試劑BSA及其濃度、用量和流速， 以及檢測樣品的用量、流速，建立了一套標準化檢測程序。在3種被檢測物的檢測中，看到兩 個對照點與芯片本底灰度幾乎相同，說明選擇的封閉試劑能夠后極好的封閉芯片表面，極 好的減少了非特異吸附。在陽性檢測位點上，灰度均明顯的高于隱性位點，SPSS統計學分析 表明有顯著差異，說明利用此蛋白芯片可以檢測弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒。在進一 步所做的檢測C反應蛋白的研究中，我們發現，不同濃度梯度的樣品通過檢測位點后，所顯 示的灰度（即分子膜層的厚度)也呈現不同灰度梯度，SPSS軟件統計學分析表明被檢測樣品 濃度與對應的檢測位點的灰度威爾遜相關系數達9.53,并且呈明顯的線性關系，這說明用 橢偏顯微成像技術的微流控蛋白芯片可以定量檢測。通過該芯片系統來檢測弓形蟲、風疹 病毒和單純皰疹病毒，更好的指導優生優育。
[0120] 綜上所述，我們通過研究，得出結論，用基于橢偏顯微成像技術的蛋白芯片可以檢 測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒。
[0121] 實施例2
[0122] -種種橢偏顯微成像蛋白芯片，該芯片是由以下方法制備得到：
[0123] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到 橢偏顯微成像蛋白芯片;制備參數參考實施例1中的標準化檢測和/或鑒定程序中的參數。
[0124] 風疹病毒抗體的定量檢測
[0125] 1、臨床血清樣品的fe正曲線和定量檢測
[0126] 建立校準曲線，血清樣品（942號，218國際單位/毫升)進行系列稀釋，稀釋濃度為 0011，0043,0170,0681，272511]/11^5個濃度梯度的風疹病毒抗體，用?831'稀釋。風疹病毒抗 原作為檢測探針固定在芯片上，BSA封閉，分別檢測5種濃度的標準血樣，水平軸上為對應5 種不同濃度的灰度值的變化，Y軸上產生的校準曲線。
[0127] 在獲得校準曲線后，可以根據其灰度值確定未知濃度的樣品中的抗體濃度。傳統 的酶聯免疫吸附抗體試劑盒檢測結果作為對照組，采用單因素分析法分析了兩者之間的相 互關系。
[0128] 通過檢測不同濃度梯度的風疹病毒抗體標準品取得了定量檢測校準曲線，用48點 芯片檢測病人血樣，檢測位點中，我們還留取不同檢測點作為空白對照、陰性血清對照、以 及鼠 IgG抗體檢測anti-IgG抗體，這些檢測點給我們提供對比。
[0129] 2、統計分析
[0130]用Microsoft Office Excel，采用單因素方差分析計算相應P值。在定性和定量檢 測方面，用檢測區域的灰度值與空白對照區域進行比較，PS005表示兩者差異有統計學意 義。與ELISA和BIE比較，P多005表示兩種方法檢測結果一致，無差異。
[0131] 3、結果
[0132] 3.1檢測不同濃度梯度風疹病毒抗體標準品所得圖像如圖4所示。
[0133] 3.2檢測不同濃度梯度風疹病毒抗體標準品所得濃度灰度值，如表3所示：
[0134] 表3
[0136] 3.3檢測風疹病毒IgG抗體標準品校準曲線，如圖5所示。
[0137] 3.4本實施例檢測風疹病毒抗體陽性血清芯片圖，如圖6所示。
[0138] 3.5檢測15例風疹病毒抗體陽性血清芯片檢測點對照表，如表4所示。
[0139] 表4
[0142] 3.6應用橢偏光學芯片檢測結果與酶聯免疫檢測結果對比柱狀圖，如圖7所示。
[0143] 從兩種方法檢測結果可以看出，橢偏顯微成像光學蛋白芯片檢測結果與酶聯免疫 檢測方法具有相同的高低趨勢。
【主權項】
1. 一種用于同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的方法，其特征是，包括以下步 驟： (1) 制備鑒定芯片： 在具有羧基表面改性的硅片的檢測位點上分別裝配弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒 的抗原，然后進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到鑒定芯片； (2) 實施鑒定： 將待鑒定溶液注入到步驟（1)中鑒定芯片的檢測位點內，待鑒定溶液中的抗體分子與 所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結合，導致芯片的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密 度發生變化;然后進行沖洗； (3) 讀取芯片： 采用橢偏顯微成像儀檢測步驟(2)中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否含有弓 形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。2. 如權利要求1所述的方法，其特征是，步驟（1)中，羧基改性表面的硅片的制備方法如 下:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片， 再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅 片，獲得羧基改性表面的硅片。3. 如權利要求1所述的方法，其特征是：所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~~ 4)，采用氨基硅烷和濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇 溶液的浸泡時間為1.5~3h。4. 如權利要求1所述的檢測方法，其特征是，步驟（1)中，在裝配探針之前，需要將表面 羧基改性的硅片置于微流控檢測膜片上，采用微流控芯片加樣系統進行點加探針，微流控 加樣流速為1.4~1.6μ1/π?η，用量為10~12μ1。5. 如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟（1)中，采用40~60μ1 PBS進行沖洗，沖洗 速度為8~12μ1/η?η。6. 如權利要求1所述的方法，其特征是:步驟(2)中，待鑒定溶液的注入速度為1.4~1.6 μL/min，用量為 10 ~12μ1。7. -種橢偏顯微成像蛋白芯片的制備方法，其特征是，包括以下步驟:在具有羧基改性 表面的硅片的檢測位點上分別點加弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS 進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到橢偏顯微成像蛋白芯片；其中，羧基改 性表面的硅片的制備方法包括:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅烷和濃硫酸 的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽和琥珀酸鈉 無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。8. 采用權利要求7所述的方法得到的橢偏顯微成像蛋白芯片。9. 一種用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒的試劑盒，該試劑盒 包含權利要求8所述的蛋白芯片。10. 下述應用，包括： 權利要求8所述的蛋白芯片在同時鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒中的應用； 權利要求8所述的蛋白芯片在是制備用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純 皰疹病毒的試劑盒的應用； 權利要求9所述的試劑盒在同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風疹病毒和單純皰疹病毒中的 應用。
【文檔編號】G01N33/68GK106093427SQ201610387434
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610387434.0, CN 106093427 A, CN 106093427A, CN 201610387434, CN-A-106093427, CN106093427 A, CN106093427A, CN201610387434, CN201610387434.0
【發明人】孫紅柳, 王巧云
【申請人】濱州醫學院