玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條的制作方法

玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明公開了玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，屬于食品安全檢測技術領域。本發明所述試紙條的檢測墊設置在PVC板上，檢測墊的一端交疊連接吸水墊，另一端交疊連接金標墊，金標墊的遠離檢測墊的一端交疊連接樣品墊，檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，檢測墊依次設有第一檢測線、第二檢測線和控制線，第一檢測線靠近金標墊一側，第一檢測線包被有抗ZEA單克隆抗體?牛血清白蛋白偶聯物，第二檢測線包被有抗DON單克隆抗體?牛血清白蛋白偶聯物，控制線包被有二抗羊抗鼠IgG。本發明同時快速檢測兩種毒素的免疫層析試紙條，操作簡單方便，一個樣品可以同時獲得兩個檢測結果，節省藥品，節省判斷時間，特別適用于特別現場的快速檢測。
【專利說明】
玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條
技術領域
[0001] 本發明屬于食品安全檢測技術領域;具體涉及一種玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀 菌烯醇雙檢試紙條。
【背景技術】
[0002] 隨著科技進步和人民生活水平的提高，人民對食品質量安全提出了更高的要求。 尤其是近年來，中國人對乳制品的需求增長，所以對于乳制品的質量應予以格外的關注。隨 著我國農獸藥殘留、食品添加劑和生物毒素等問題日益突出，因此加快食品安全檢測技術 的研究，構建食品質量和安全保障體系具有重要的現實意義。
[0003] 真菌毒素廣泛存在于糧食作物及其制品中，對動物會造成嚴重危害，且動物食入 真菌毒素污染的谷物，真菌毒素可以殘留在動物體內，從而污染肉、蛋、奶等動物性食品，對 人體危害較大，具有致癌，致畸和致突變等作用，由于現在還未有一個較好的脫毒處理辦 法，所以除了加強糧食生產、加工等環節的規范操作，儲存時注意防霉外，目前唯一有效的 辦法是加強糧食的檢測監控，及時發現并剔除受污染糧食，確保食品安全。隨著真菌毒素所 引發的食品安全事件的頻發，目前國內外真菌毒素的研究不斷加強，限量標準也在不斷降 低，這對食品快速檢測技術也提出了新的要求:高靈敏度，高特異性、低成本、易商業化。
[0004] 脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（Deoxynivalenol，D0N)和玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEA) 都是霉菌污染谷物所產生的次級代謝產物。DON有一定的毒性作用，人類和動物誤食了被 DON污染的食品后，會發生嘔吐癥狀;ZEA有很強的類雌激素作用，會危害人和動物的生殖系 統。這兩種毒素廣泛存在于自然中，奶牛的飼料小麥、玉米、大麥等經常受到污染，再經過消 化進入牛奶中，對人類的健康和安全造成嚴重威脅。因此，研制能夠快速、方便、準確、同時 的檢測牛奶中DON和ZEA免疫層析試紙條具有重要意義。
[0005] 目前，關于同時檢測DON和ZEA免疫層析試紙條相關報道極少。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是要提供玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，其能夠 快速、方便、準確的同時檢測牛奶中DON和ZEA。
[0007] 本發明中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條包括樣品墊、金標墊、 檢測墊、吸水墊和PVC板，檢測墊設置在PVC板上，檢測墊的一端交疊連接吸水墊，另一端交 疊連接金標墊，金標墊的遠離檢測墊的一端交疊連接樣品墊，檢測墊以硝酸纖維素膜(NC 膜)為基墊，檢測墊依次設有第一檢測線、第二檢測線和控制線，第一檢測線靠近金標墊一 偵I第一檢測線包被有抗ZEA單克隆抗體(抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體)-牛血清白蛋白偶聯 物，第二檢測線包被有抗DON單克隆抗體(抗脫氧雪腐鐮刀菌單克隆抗體)-牛血清白蛋白偶 聯物，控制線包被有二抗羊抗鼠 IgG。
[0008] 所述樣品墊長為16mm~18mm;金標墊長為6mm~7mm;所述吸水墊長為19mm~20mm， 所述試紙條寬為3~4mm。
[0009] 第一檢測線和第二檢測線之間的間距為5mm，第二檢測線和控制線之間的間距為 5mm 〇
[0010] 所述檢測墊與吸水墊交疊2mm~3mm;檢測墊和金標墊交疊2mm~3mm;金標墊和樣 品墊交疊2mm~3mm。
[0011]抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0012]抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0013] 二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ml，包被量0 · 8μ1/αη。
[0014] 包被液為?!1值為7.5、濃度為1〇111111111〇1/1?85緩沖液，含有3%甲醇。
[0015] 樣品墊是將玻璃纖維浸于50mmol/l硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于42°C干燥lh;所 述硼酸緩沖液包含1 % BSA、1.0 % Tween 20和3 %海藻糖，pH值為7.5。
[0016] 所述金標墊的制備方法如下:一、抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶 液，加入2μ10. lmol/L K2C03，再加入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混 勻，靜置15min，加入100μΙ濃度為10% (w/v)BSA溶液，振蕩混勻，靜置15min;在4°C、10000r/ min條件下離心15min，將棄去上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液(粒徑為25nm左右的膠體金），于4°C保存備用；二、將硝酸纖維素膜(NC 膜)剪裁后浸泡于含〇. 5%Tween 20且pH為8.0的PBS溶液中，均勻浸濕后45°C烘干2h;三、將 步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體金標記物溶 液的稀釋液，然后將經步驟二預處理無紡布浸于l〇〇yL抗體-膠體金標記物溶液的稀釋液 中，置于60°C烘干lh，用噴條機將抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和二抗羊抗鼠 IgG分 別劃線固定在相應位置，60°C干燥lh，得到金標墊，置于干燥環境備用。
[0017] 本發明所述試紙條的制備方法:本發明將樣品墊、金標墊、檢測墊、吸水墊和PVC板 按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊與檢測墊之間、檢測墊和金標墊之間、金標墊和樣品 墊之間都有交疊，用切條機將大卡切成一定寬度的試紙條，和干燥劑一起密封保存。
[0018] 使用方法:待檢樣品中按等體積比加入甲醇和PBS溶液(體積比1:4)中，在5000r/ min下離心5min，吸取上清液獲得樣品提取液；用移液槍取100μ1待測樣品吸附到樣品墊上， 10min后觀察結果。當第一檢測線和第二檢測線同時出現紅色條帶，結果為陰性(ZEA〈30ng/ ml且D0N〈25ng/ml);當第一檢測線出現紅色條帶，第二檢測線不顯色，結果為陽性（ZEA〈 30ng/ml，D0N彡25ng/ml);當第二檢測線出現紅色條帶，第一檢測線不顯色，結果為陽性 (ZEA彡30ng/ml，D0N〈25ng/ml) ;當第一檢測線和第二檢測線均不顯色，結果為陽性(ZEA彡 30ng/ml且DON彡25ng/ml)。當控制線不顯色，表明試紙條失效。
[0019] 保存方法:和干燥劑一起密封保存。
[0020] 本發明同時快速檢測兩種毒素的免疫層析試紙條，操作簡單方便，一個樣品可以 同時獲得兩個檢測結果，節省藥品，節省判斷時間，特別適用于特別現場的快速檢測。
[0021] 本發明的試紙條室內密封可保存三個月以上。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發明試紙條結構示意圖；圖1中1一一樣品墊，2-一金標墊，3-一檢測墊， 4--吸水墊，5--PVC板，31--第一檢測線，32--第二檢測線，33--控制線；
[0023]圖2是膠體金溶液的電鏡掃描圖；
[0024] 圖3是不同pH值的檢測線結果；
[0025] 圖4是不同抗原包被濃度的檢測線結果；
[0026] 圖5是不同膜處理條件的的檢測線結果；
[0027] 圖6是金標ZEA抗體稀釋倍數的檢測線結果；
[0028]圖7是金標DON抗體稀釋倍數的檢測線結果；
[0029] 圖8是試紙條的特異性測定；
[0030] 圖9是ZEA快速檢測試紙條的靈敏度；
[0031] 圖10是DON快速檢測試紙條的靈敏度。
【具體實施方式】
[0032]
【具體實施方式】一:結合圖1進行說明，本實施方式中將樣品墊1、金標墊2、檢測墊3、 吸水墊4和PVC板按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊4與檢測墊3之間、檢測墊3和金標墊2 之間、金標墊2和樣品墊1之間都有交疊，切成3_寬的試紙條，和干燥劑一起密封保存。 [0033]本發明中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條包括樣品墊1、金標墊 2、檢測墊3、吸水墊4和PVC板5,檢測墊3設置在PVC板5上，檢測墊3的一端交疊連接吸水墊4， 另一端交疊連接金標墊2,金標墊2的遠離檢測墊3的一端交疊連接樣品墊2,檢測墊3以硝酸 纖維素膜(NC膜)為基墊，檢測墊3依次設有第一檢測線31、第二檢測線32和控制線33,第一 檢測線31靠近金標墊2-側，第一檢測線31包被有抗ZEA單克隆抗體(抗玉米赤霉烯酮單克 隆抗體)-牛血清白蛋白偶聯物，第二檢測線32包被有抗DON單克隆抗體(抗脫氧雪腐鐮刀菌 單克隆抗體)_牛血清白蛋白偶聯物，控制線33包被有二抗羊抗鼠 IgG。
[0034] 所述樣品墊1長為16mm;金標墊2長為6mm;所述吸水墊4長為20mm，所述試紙條寬為 3mm 〇
[0035] 第一檢測線31、第二檢測線32之間的間距為5mm，第二檢測線32和控制線33之間的 間距為5mm。
[0036] 所述檢測墊3與吸水墊4交疊3mm;檢測墊3和金標墊2交疊3mm;金標墊2和樣品墊1 交疊3mm。
[0037]抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0038]抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμL/cm。 [0039] 二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ml，包被量0.8μ1/αη。
[0040] 包被液為?!1值為7.5、濃度為1〇111111111〇1/1?85緩沖液，含有3%甲醇。
[0041] 樣品墊1是將玻璃纖維浸于50mmol/l硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于42°C干燥lh;所 述硼酸緩沖液包含1 % BSA、1.0 % Tween 20和3 %海藻糖，pH值為7.5 (采用此種硼酸緩沖液 檢測線顯色最亮）。
[0042]所述金標墊2的制備方法如下：
[0043] 一、抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶液，加入2μ10. lmol/L K2C03， 再加入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混勻，靜置15min，加入100μΙ濃 度為10%(w/v)BSA溶液，振蕩混勻，靜置15min;在4°C、10000r/min條件下離心15min，將棄 去上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液，于4°C 保存備用；
[0044] 步驟一制備的膠體金顆粒大小基本均一，沒有三角形、水滴形等特殊形狀，沒有聚 集現象，見圖2。隨機選取100個顆粒，對直徑做平均數計算得到膠體金顆粒約為25.17nm。
[0045] 二、將硝酸纖維素膜(NC膜)剪裁后浸泡于含0.5%TWeen 20且pH為8.0的PBS溶液 中，均勻浸濕后45°C烘干2h;
[0046] 三、將步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體金標記物溶液的稀釋液，然后將經步驟二預處理無紡布浸于i〇〇yL抗體-膠體金標記物 溶液的稀釋液中，置于60°C烘干lh，得到金標墊2,置于干燥環境備用。
[0047] 本實施方式所述試紙條的制備方法:本發明將樣品墊1、金標墊2、檢測墊3、吸水墊 4和PVC板按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊4與檢測墊3之間、檢測墊3和金標墊2之間、 金標墊2和樣品墊1之間都有交疊，用切條機將大卡切成一定寬度的試紙條，和干燥劑一起 密封保存。
[0048] 膠體金粒徑逐漸增大，顏色由橙色到紫灰，越來越深(表1)。直徑小的顆粒空間位 阻大，不易標記;直徑大的顆粒雖然顯色深，但是標記量小，且穩定性差。因此，選擇25nm的 膠體金用于制備金標抗，即檸檬酸三鈉添加量為lml制得的膠體金溶液。
[0049] 表1膠體金溶液的性質
[00511采用下述試驗驗證發明效果 [0052]實驗所用的主要試劑如表2所示。
[0053]表2實驗主要試劑

[0056]試驗使用的儲備液如表3所示 [0057]表3實驗使用的儲備液

[0060] 實驗中使用的主要儀器如表4所示。
[0061] 表4主要儀器設備
[0064]實驗中使用的試紙條如表5所示。
[0065]表5試紙條所用材料
[0067] 一、檢測線上抗原包被條件試驗 [0068] (1)包被液pH的確定
[0069] 由于抗原抗體反應形成的復合物是不牢固的，不合適的pH值會破壞抗原抗體間的 非共價鍵結合，使復合物發生解離。用不同pH的10mMPBS緩沖液(含3%甲醇)稀釋ZEA-BSA/ D0N-BSA至最適標記濃度，羊抗鼠 IgG分別吸附于NC膜上作為檢測線和質控線，制備試紙條 并用于檢測陰性樣品，根據檢測線的顯色情況判定。
[0070] 蛋白與NC膜的結合主要分為結合和長時間結合兩個階段，這兩個階段都主要都是 靠疏水作用力和靜電作用保證結合。同時，由于蛋白質具有兩性電離的性質，抗原抗體的反 應必須在合適的pH環境中進行，一般抗原抗體的反應pH都在6~9的范圍內。本實驗對 口!16.5、7.0、7.5、8.0、8.5的1011^?83緩沖液(含3%甲醇)進行優化。結果如圖3所示，？!17.5 組的檢測線最亮。因此選擇PH7.5的1 OmM PBS緩沖液(含3 %甲醇）作為檢測線抗原的包被 液。
[0071] (2)檢測線抗原包被濃度的確定
[0072] T線抗原的包被濃度直接影響著檢測靈敏度。用含3% (w/w)甲醇的PBS緩沖液 (1 OmM pH7 · 5)將ZEN-BSA/DON-BSA和羊抗鼠 IgG稀釋至6/8、3/4、2/2、1 /1、0 · 5/0 · 5 mg/ml 和 lmg/ml，用移液槍按照ΙμL/cm分別滴于試紙條上的檢測線和質控線的位置，每兩條線的間 距均為5mm，6(TC烘干lh。制備試紙條，檢測陰性樣品，根據結果確定檢測線抗原的最適包被 濃度。
[0073] 若檢測線包被的抗原濃度過高，會造成試劑的浪費。若檢測線包被的抗原濃度過 低，則會影響檢測的靈敏度。對檢測線檢測抗原包被量的優化結果如圖4所示，隨著檢測抗 原包被濃度的降低，捕獲的金標抗含量降低，檢測線顯色減弱。當ZEA/D0N抗原濃度低于3/ 2mg/ml時，檢測線顯色較淺，尤其是0.5mg/ml時，顯色微弱；當ZEA/D0N抗原濃度高于3/2mg/ ml時，檢測線顯色較深，尤其是6/8mg/ml時，顯色極深。能滿足肉眼觀察的最低濃度即為檢 測抗原包被的最優濃度。因此，檢測線包被ZEA-BSA的最優濃度為3mg/ml，檢測線包被D0N-BSA的最優濃度為2mg/ml。
[0074] (3)NC膜處理條件的確定
[0075] 將劃膜處理的NC膜分別置于室溫（25Γ )、lh，37 Γ、lh，60 Γ、lh，室溫（25Γ )、Id， 37°C、Id，60°C、2h，60°C、3h，60°C、4h烘干處理，其他條件不變，組裝成試紙條檢測陰性樣 品，通過顯色情況進行判定。
[0076] 為了提高抗原在NC膜上的包被效率，使抗體經過抗原的時候有更高的結合率，所 以要對NC膜進行處理。對干燥溫度和干燥時間兩種處理條件的優化結果如圖5。同樣處理 lh，檢測線的顯色隨著溫度升高加深。當溫度高達60°C，檢測線的顯色隨著時間延長減弱， 說明此溫度下過長時間的處理使抗原變的不穩定。說明升高溫度和延長干燥時間都有利于 抗原的包被。在包被效果較號好的60 °C、lh和37 °C、1 d兩組中，為提高實驗效率、縮短處理的 時間，60°C干燥lh是NC膜處理的最佳條件。
[0077]二、膠體金標記抗體稀釋倍數試驗
[0078] 將經過離心處理的金標抗體用復溶液按照1:1、1:5、1:10、1:20、1:50、1:80進行稀 釋，其他條件不變，吸附于處理過的金標墊上并置于電熱干燥箱中干燥，與固定濃度的檢測 抗原組裝成試紙條，根據顯色情況進行判定。
[0079]對膠體金標記抗體稀釋倍數的優化結果如圖6和7。當ZEA金標抗體/DON金標抗體 的稀釋比例小于1:50/1:20時，檢測線顯色非常微弱，肉眼不能清除分辨，造成錯誤的判定 為陽性結果。1:50/1:20作為ZEA金標抗體/DON金標抗體，肉眼可清晰觀察到的結果。
[0080] 四、特異性實驗
[0081 ] 取4?11^?81^?82小81、(^\.的標準溶液10(^1用移液槍滴到樣品墊，1〇1^11后觀 察結果確定試紙條的特異性。
[0082]用含甲醇的PBS緩沖液(pH7.5)將AFM1、AFB1、AFB2、FB1、OTA、ZEA、DON的標準溶液 稀釋至100ng/ml，分別利用ZEA和DON試紙條進行檢測判定其特異性。特異性驗證結果如圖 8，AFM1、AFB1、AFB2、FB1、0TA.的檢測線顯色，結果為陰性，ZEA/D0N的檢測不顯色，結果為陽 性，表明抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和其他毒素無交叉反應，試紙條特異性良好。 [0083]五、靈敏度實驗
[0084] 將ZEA/D0N標準品配置為1. Omg/ml的濃儲液，再用含甲醇的roS緩沖液(pH7.5)配 制成0/0、10/10、30/25、50/50、100/100、200/200ng/ml的標準溶液。用試紙條進行檢測，每 個濃度設兩個重復試驗，l〇min觀察結果，T線顯色為陰性(_)，T線不顯色為陽性(+ )。
[0085] ΖΕΑ和DON試紙條的靈敏度檢測結果分別如圖9和圖10,隨著濃度減小，檢測線顏色 逐漸變淺。當ZEA濃度低于30ng/ml時，檢測線顯色，結果為陰性；同樣當DON濃度低于25ng/ ml時，檢測線顯色，結果為陰性。因此確定檢測ZEA試紙條的靈敏度為30ng/ml，檢測DON試紙 條的靈敏度為25ng/ml。
[0086] 隨著濃度減小，檢測線顏色逐漸變淺，見圖9和10。當ZEA濃度低于30ng/ml時，檢測 線顯色，結果為陰性；同樣當DON濃度低于25ng/ml時，檢測線顯色，結果為陰性。檢測ZEA試 紙條的靈敏度為30ng/ml，檢測DON試紙條的靈敏度為25ng/ml效果最佳。
[0087] 六、穩定性實驗
[0088] 將【具體實施方式】一所述的試紙條密封保存于4°C、25°C和37°C。保存于37°C的試紙 條每天取出，分別檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液 ;保存于25°C的試紙條 每3d取出，分別檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液;保存于4°C的試紙條每 周取出，分別檢測檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液，通過結果判定試紙條 的穩定性。
[0089] 試紙條在4°C和25°C下可以密封保存3個月，保持靈敏度不變;37°C密封保存的試 紙條15d內靈敏度保持不變，表明本試紙條穩定性較好。
【主權項】
1. 玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，包括樣品墊（1)、金標墊(2)、檢測 墊(3)、吸水墊(4)和PVC板(5)，其特征在于檢測墊(3)設置在PVC板(5)上，檢測墊(3)的一端 交疊連接吸水墊(4 )，另一端交疊連接金標墊(2 )，金標墊(2)的遠離檢測墊(3)的一端交疊 連接樣品墊(2)，檢測墊(3)以硝酸纖維素膜為基墊，檢測墊(3)依次設有第一檢測線(31)、 第二檢測線(32)和控制線(33)，第一檢測線(31)靠近金標墊(2)-側，第一檢測線(31)包被 有抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯物，第二檢測線(32)包被有抗DON單克隆抗體-牛血 清白蛋白偶聯物，控制線(33)包被有二抗羊抗鼠 IgG。2. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述樣品墊（1)長為16mm~18mm;金 標墊(2)長為6mm~7mm;所述吸水墊(4)長為19mm~20mm，所述試紙條寬為3~4mm。3. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于第一檢測線（31)和第二檢測線（32) 之間的間距為5mm，第二檢測線(32)和控制線(33)之間的間距為5mm。4. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述檢測墊(3)與吸水墊(4)交疊2mm ~3mm;檢測墊(3)和金標墊(2)交疊2mm~3mm;金標墊(2)和樣品墊（1)交疊2mm~3mm。5. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶 聯物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμΙ/cm。6. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶 聯物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμΙ/cm。7. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ ml，包被量 0.8yl/cm〇8. 根據權利要求5、6或7所述的雙檢試紙條，其特征在于包被液為pH值為7.5、濃度為 10mmmol/l PBS緩沖液，含有3%甲醇。9. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于樣品墊（1)是將玻璃纖維浸于 5 0 mm ο 1 /1硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于4 2 °C干燥1 h;所述硼酸緩沖液包含1 % B S A、1.0 % Tween 20和3%海藻糖，pH值為7.5〇10. 根據權利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述金標墊(2)的制備方法如下： 一、 抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶液，加入2μ10. lmol/L K2C03，再加 入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混勻，靜置15min，加入100μΙ濃度 為10% (w/v)BSA溶液，振蕩混勾，靜置15min;在4°C、10000r/min條件下離心15min，將棄去 上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液，于4°C保 存備用； 二、 將硝酸纖維素膜剪裁后浸泡于含〇.5%Tween 20且pH為8.0的PBS溶液中，均勻浸濕 后45°C烘干2h; 三、 將步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體 金標記物溶液的稀釋液，然后將經步驟二預處理無紡布浸于l〇〇yL抗體-膠體金標記物溶液 的稀釋液中，置于60°C烘干lh，用噴條機將抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和二抗羊抗 鼠 IgG分別劃線固定在相應位置，60°C干燥lh，得到金標墊(2)，置于干燥環境備用。
【文檔編號】G01N33/577GK106093406SQ201610374027
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】滿朝新, 姜毓君, 丁木, 周文琦, 姜霞
【申請人】東北農業大學