一種產氣莢膜梭菌病α毒素Envision免疫組化的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及動物細菌學領域，提供了一種產氣莢膜梭菌病α毒素Envision免疫組化的檢測方法，該方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎，建立了特異性高、重復性好、背景低，可直觀、簡便檢測α毒素的Envision免疫組化方法。該方法可用于除鼠以外動物組織中產氣莢膜梭菌α毒素的檢測，也為該毒素在動物機體內的分布檢測提供了有效、可靠的手段。CGMCC No.887020140114
【專利說明】
一種產氣莢膜梭菌病α毒素 Env i s i on免疫組化的檢測方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及動物細菌學領域，本發明提供了 一種產氣莢膜梭菌病α毒素 Envision 免疫組化的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 產氣莢膜梭菌可產生多種外毒素，根據其產生的主要4種致死性外毒素，產氣莢膜 梭菌分為4(€〇、8((1、0、6)、(：(€[、0)、0(€[、6)和￡(€[、0型，各型均產生€[毒素，該毒素具有卵磷 脂酶C和鞘磷脂酶兩種毒性，可同時水解細胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂成分，破壞細胞膜 結構，導致細胞溶解，從而呈現細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等，在動物壞死性腸 炎、腸毒血癥、人畜創傷性氣性壞疽等病癥中起關鍵作用，給養殖業和公共衛生造成巨大的 損失。
[0003] 目前，產氣莢膜梭菌的檢測方法主要有病原菌的分離鑒定、腸內容物的毒素檢測 (常用小鼠接種試驗及毒素中和試驗）。產氣莢膜梭菌病主要是腸源性感染，常形成腸源性 毒血癥，并不一定形成菌血癥及敗血癥，因此從內臟實質器官不一定能分離到細菌;而利用 小鼠為實驗動物做毒素接種實驗和毒素中和實驗時，需要針對毒素的標準陽性高免血清， 耗時費力，且由于動物的個體差異，還能導致結果的不準確。
[0004] 免疫組織化學方法可用于研究抗原在組織器官和細胞中的定位與分布，可直觀地 檢測到抗原物質；另外，Bacciarini指出：抗毒素抗體的免疫組化在那些細菌培養和PCR檢 測不可行的情況下，是一個可供選擇的檢測方法。α毒素是A型產氣莢膜梭菌最主要的毒力 因子，因此，如何運用Envision免疫組化方法檢測動物組織中產氣莢膜梭菌α毒素成為亟待 解決的問題之一。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的上述情況，本發明提供了提供了 一種產氣莢膜梭菌病α毒素 Envi s ion免疫組化的檢測方法，該方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎，建立了特異性 高、重復性好、背景低，可直觀、簡便檢測α毒素的Envi s ion免疫組化方法。該方法可用于除 鼠源外A型產氣莢膜梭菌的檢測，也為該毒素在動物機體內的分布檢測提供了有效、可靠的 手段。
[0006] 發明人在本發明中所采用的A型產氣莢膜梭菌采用現有菌種，特別選自菌種 NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英國國家典型培養物保藏中心， 保藏號:NCTC528 )，可通過現有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現有技術中可直接獲得 的材料，不需進行單獨的生物保藏。
[0007] 本發明的具體技術方案如下:具體步驟如下：
[0008] 1產氣莢膜梭菌α毒素的制備：
[0009] Α型產氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養基上進行復蘇，37°C厭氧培養36h，選取 單個的菌落進行液體硫乙醇厭氧增菌12小時，然后將增菌液按體積百分比5%接種于產毒 培養基Gordon湯中，45 °C培養5h產毒，將培養物離心后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除 菌后的A型產氣莢膜梭菌外毒素；
[0010]其中所述的血平板培養基成分為：100毫升蒸餾水、3.8g豆粉瓊脂、lg葡萄糖和5ml 脫纖綿羊血。
[0011]所述的產毒培養基成分為:每l〇〇mlPBS緩沖液溶解3g胰蛋白胨、1.2g糊精、2g酵母 浸膏和2.2g L-精氨酸，PBS為0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液。
[0012] 2人工感染家兔產氣莢膜梭菌病
[0013] 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機分成實驗組和對照組，3只/組，實驗組肌肉 注射上述除菌α毒素3mL，對照組注射等量的生理鹽水，72h內觀察動物發病狀況;實驗組在 其死亡時，立即進行臨床剖檢病變，并取病變組織，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續 的組織切片制備和免疫組化染色;對照組同時進行；
[0014] 所述的改良Bouin ' S液固定液成分為：750mL飽和苦味酸緩沖液（由ros緩沖液配 置），甲醛250mL，在使用前不加50mL冰乙酸；與常規Bouin'S液固定液相比，本發明所提供的 固定液在使用前不加冰醋酸，避免了組織固定時形態收縮明顯，且強酸對組織中抗原有損 害，因此改良的固定液利于固定組織的長期保存。
[0015] 3組織切片的制備
[0016]組織于固定液48h后，將組織用刀片切成lcm3的組織塊，組織塊經流水沖洗完固定 液后，再進行常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，切片于37°C溫箱烤干，放置4 °C備用后續免疫組化染色；陰性對照組組織同時進行此操作；
[0017] 4Envision免疫組化檢測
[0018] ①陰性對照與陽性對照的組織切片于4°C冰箱拿出，在室溫放置無水霧后，放置37 °C溫箱30min，使組織粘的更牢固，再脫蠟；
[0019] ②上述切片依次經二甲苯I、Π ，體積比1:1的二甲苯：100 %酒精混合物，各常規脫 蠟6min，再經100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸餾水，各水化處理 4min;
[0020] ③上述切片在0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液90°C微波修復4次，5min/次，每次間 隔4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫，
[0021] 其中所述的0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液成分為：1L去離子水、檸檬酸0.378g、檸 檬酸三鈉2.412g;
[0022] ④上述切片經roS緩沖液漂洗3次，5min/次，將H2〇2用roS緩沖液稀釋至10%，滴加 覆蓋在組織上，37 °C濕盒避光封閉lh;
[0023] ⑤上述切片經roS緩沖液漂洗3次，5min/次，小牛血清經roS緩沖液稀釋至10%，滴 加覆蓋在組織上，37°C濕盒孵育50min;
[0024] ⑥甩去組織上的血清，小鼠抗產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12經roS緩沖液按 體積比稀釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內孵育，4°C過夜轉37°C濕盒孵育30min;
[0025] ⑦上述切片于經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標二抗各 試劑，37°C濕盒孵育50min;
[0026] ⑧上述切片經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60s，切片再用去離 子水充分洗滌，終止顯色反應；
[0027]⑨上述切片經蘇木素復染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色；
[0028]⑩1 %鹽酸無水乙醇溶液進行分化3s，之后切片在去離子水中沖洗返藍15min;
[0029] 0最后組織切片經過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察；
[0030] 上述使用的PBS緩沖液成分為：1L去離子水、磷酸二氫鉀：0.27g、磷酸氫二鈉： 1 · 42g、氯化鈉:8g、氯化鉀0 · 2g;
[0031] 上述方法中其他未公開參數均可參考現有技術，如2013年發表于中國獸醫學報的 《間接免疫酶組化檢測禽波氏桿菌在感染雞體內的抗原定位》中記載的技術方案。
[0032] 其中步驟(4)中小鼠抗產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的制備方法如下：
[0033] 將產氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細胞株F12,保藏于中國微生物菌種保藏中心，保 藏編號:CGMCC No. 8870;進行復蘇、培養;選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式 不完全佐劑0.5mL/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細胞株F12，0.5-1 X 106個/只，7-10天后 收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12，腹水經正辛酸-硫酸銨方法純化，SDS-PAGE檢測純 化效果。
[0034] 5結果判定標準的確定
[0035]按照普通光學顯微鏡視野下觀察到的特定區域或細胞經染色后棕黃色顯色的有 無、數量、種類及深淺來判定，判定標準為：
[0036] (1)沒有出現棕黃色區域或細胞的判為陰性；
[0037] (2)組織中棕黃色區域或細胞零星分布且少于5%的判為弱陽性；
[0038] (3)組織中棕黃色區域或細胞分布比例為5 %~50 %為陽性；
[0039] (4)組織中棕黃色區域或細胞在組織中分布比例大于50%為強陽性。
[0040]采用本發明上述公開的檢測方法，具有如下有益效果：
[0041 ] (1)特異性強:本方法可檢測到陽性對照臟器中α毒素的分布，而陰性對照、替代試 驗組及感染巴氏桿菌、沙門氏菌和球蟲等其他病原致死兔兔組織的免疫組化檢測為陰性； [0042] (2)敏感性高:本方法α毒素的免疫組化檢測陽性率高于常規的細菌分離技術，且 本方法第二抗體選用小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑，該二抗具有高敏感、低背景、快速 簡便的特點；
[0043] (3)重復性好:本方法對人工感染的陽性組織、兔產氣莢膜梭菌病病例、陰性對照 和其他病原感染組織的連續切片進行多次重復檢測，結果均相一致。
[0044] 綜上所述，本發明提供的免疫組化檢測方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎，建 立了特異性高、重復性好、背景低，可直觀、簡便檢測α毒素的Envision免疫組化方法。該方 法可用于除鼠源外A型產氣莢膜梭菌的檢測，也為該毒素在動物機體內的分布檢測提供了 有效、可靠的手段。
[0045] 保藏信息
[0046] 保藏時間：2014年1月14日
[0047]保藏單位名稱：中國普通微生物保藏管理中心CGMCC
[0048] 保藏編號：CGMCC No .8870
[0049] 保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所
[0050] 分類命名:抗產氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細胞株
【附圖說明】：
[0051 ]圖1為陽性對照組織免疫組化染色結果示意圖，
[0052]圖la為腎臟分布結果:棕黃色陽性著色主要分布在腎小管的上皮細胞胞質中，陽 性分布比例大于50%，染色結果為強陽性（X400);
[0053]圖lb為腎臟陰性對照結果:無陽性信號著色，檢測為陰性（X400);
[0054] 圖lc為胃分布結果：陽性顆粒主要分布在黏膜固有層的胃底腺細胞及黏膜頂端脫 落上皮細胞的胞質中，陽性分布比例大于50%，染色結果為強陽性（X400);
[0055] 圖Id為胃陰性對照結果:無陽性信號著色，檢測為陰性（X400);
[0056] 圖le為小腸分布結果：陽性信號主要分布在腸絨毛上皮細胞及固有層中，陽性分 布比例大于50%，染色結果為強陽性（X400);
[0057]圖If為小腸陰性對照結果:無陽性信號著色，檢測為陰性（X400);
[0058]圖lg為脾臟分布結果：白髓紅髓中都有彌散性棕黃色陽性顆粒分布，陽性分布比 例大于50%，染色結果為強陽性（X400);
[0059]圖lh為脾臟陰性對照結果:無陽性信號著色，檢測為陰性（X400);
[0060] 圖2為圖1的彩色示意圖。
【具體實施方式】
[0061] 以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限 定。在實施例中涉及的所有培養基和分子生物學等技術手段為本領域技術人員所熟知。 [0062]實施例中所用的試劑及其來源:液體硫乙醇酸鹽培養基購自青島海博生物;L-多 聚賴氨酸黏片劑購自索萊寶公司;抗產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的雜交瘤細胞株保 藏于中國微生物菌種保藏中心(保藏號:CGMCCNo. 8870);小牛血清購自浙江天杭生物公司； 小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑(PV-9002)購自北京中杉金橋;增強型HRP-DAB底物顯色 試劑購自天根生化科技有限公司；其他試劑所用化學試劑均為分析純。
[0063] 實施例1
[0064]產氣莢膜梭菌α毒素的制備：
[0065] Α型產氣莢膜梭菌菌種(英國國家典型培養物保藏中心保藏保藏號:NCTC528)接種 于血平板培養基上進行復蘇，37°C厭氧培養36h，挑取單個的菌落到硫乙醇酸鹽增菌培養基 中，在氣體濃度為88%N2、7%H 2、5%C02的厭氧環境條件下38°C培養12h。將5mL A型產氣莢 膜梭菌增菌液接種到l〇〇ml pH7.5的產毒培養基中（每100mL PBS緩沖液溶解3g蛋白胨、 1.2g糊精、2g酵母浸膏和2.2gL-精氨酸）中，在厭氧環境下振蕩培養，43 °C培養5h高效產毒， 然后在4°C3800g離心15min，再用孔徑0.22μπι的蔡氏濾器中過濾除菌，即得到除菌后以α毒 素為主的外毒素。利用卵磷脂酶活性和LD 5Q實驗測定所產α毒素的活性，應用聚丙烯酰胺凝 膠電泳（SDS-PAGE)驗證Α型產氣莢膜梭菌產毒除菌后的純度，用于后續動物的人工攻毒陽 性對照實驗。
[0066] 實施例2
[0067] 人工感染家兔產氣莢膜梭菌病
[0068] 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機分成實驗組和對照組，3只/組，實驗組肌肉 注射上述除菌測小鼠 LD50為24·25的α毒素3mL，且對照組注射等量的生理鹽水，72h內觀察動 物發病狀況。在其死亡時，立即進行臨床剖檢病變，并取病變組織心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎 臟、胃、小腸和盲腸，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續陽性對照的組織切片制備及免 疫組化染色，陰性對照組同時進行；
[0069]其中所述的改良Bouin ' S液固定液成分為:750mL飽和苦味酸緩沖液（由roS緩沖液 配置），甲醛250mL，在使用前加入50mL冰乙酸。
[0070] 實施例3 [0071] 組織切片的制備
[0072] 組織于固定液48h后，將組織用刀片切成lcm3的組織塊，組織塊經流水沖洗至無黃 色固定液時，再經70%酒精(過夜）、80%酒精（lh)、85%酒精（lh)、90%酒精（lh)、95%酒精 (lh)、100 %酒精(45min)、二甲苯:酒精（1 Omin)梯度脫水、二甲苯透明組織10s、60 °C浸蠟 1.5h、石蠟包埋，經切片機切成4um厚的切片，切片于37 °C溫箱烤干，放置4 °C備用后續免疫 組化染色，陰性對照組組織同時進行此操作。
[0073] 實施例4
[0074] 小鼠抗產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的制備方法如下：
[0075] 將產氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細胞株F12,保藏于中國微生物菌種保藏中心保 藏，保藏編號：CGMCC No. 8870;進行復蘇、培養;選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注 射弗式不完全佐劑〇. 5mL/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細胞株F12，0.5-1 X 106個/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12,腹水經正辛酸-硫酸銨方法純化，SDS-PAGE 檢測純化效果。
[0076] 實施例5
[0077] Envision免疫組化檢測參數優化
[0078]通過對易出現問題的抗原修復、封閉液、單抗稀釋度、酶標二抗和DAB顯色等多個 工作條件進行3次重復摸索和優化，摸索過程如下：
[0079] (1)抗原修復時間的選擇
[0080]將0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液微波加熱煮沸，調至低火進行微波修復，修復時 間分別為:連續修復5min，15min，間斷修復4次，5min/次，間隔4min。
[0081 ]實驗發現間斷修復20min優于連續修復的5min和15min，此修復時間利于增強陽性 信號，且不易脫片。
[0082] (2)過氧化物酶封閉時間的選擇
[0083] 將商品化H202溶液用roS緩沖液稀釋至10%，滴加覆蓋于組織上，在37°C濕盒中分 別孵育1 〇min、30min和lh，選擇最佳的作用時間。
[0084]實驗結果顯示封閉lh可有效封閉組織中血管及其他部位過氧化物酶的活性，非特 異性背景著色低。
[0085] (3)封閉液及其時間的選擇
[0086] 封閉液選5%834、10%小牛血清，分別在37°(：濕盒孵育1〇111丨11、3〇111丨11、5〇111丨11和 90min，選擇最佳封閉時間。
[0087] 實驗結果顯示10%小牛血清與5%BSA封閉效果相似，最佳封閉時間為50min，因此 選用價格適宜的小牛血清。
[0088] (4) 一抗最佳稀釋度和反應時間的確定
[0089] 應用抗α毒素單克隆抗體Al 1為一抗，用pH 7 · 0PBS緩沖液按1/50，1/100，1/200，1/ 400，1/800，1/1000稀釋抗體，每個稀釋度分別在37°(：濕盒孵育111和4°(：過夜轉37°(：孵育 30min，以確定一抗的最佳工作濃度和時間。
[0090] 實驗結果顯示一抗稀釋1/400進行4°C過夜轉37 °C孵育30min為最佳工作條件。
[0091] (5)二抗孵育條件的選擇
[0092]根據試劑說明書，即用型超敏免疫組化試劑中各個成分在37°C分別孵育lOmin、 30min和50min，比較出二抗最佳孵育時間。
[0093]多次實驗結果顯示二抗孵育條件為37°C作用50min。
[0094] (6)顯色底物作用時間的選擇
[0095] 按試劑說明書，在顯微鏡下觀察DAB顯色，顯色時間分別為30s、lmin、2min和5min 后終止，篩選出最佳顯色時間。
[0096] 多次重復實驗顯示最佳顯色時間為50-60s。
[0097] (7)蘇木素復染時間的選擇
[0098] 蘇木素分別對組織復染0.5min、lmin、1.5min和3min，在顯微鏡下觀察細胞核著色 程度，確定最佳復染時間。
[0099]多次重復實驗顯示最佳復染時間為1.5min。
[0100] 實施例6
[0101] Envision免疫組化檢測方法
[0102]除特殊說明外，本步驟所涉及的百分比均為體積百分比：
[0103]通過實施例5以上對Envision免疫組化各重要影響條件的優化，最終確定反應體 系如下：
[0104] ①待檢切片制備好后，依次經二甲苯I、Π ，二甲苯：100%酒精（1:1)，各脫蠟6min， 再經100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸餾水，各水化處理4min;同時 設置陰陽性對照，陽性對照為肌肉注射α毒素感染家兔的病變組織，陰性對照為注射等量生 理鹽水家兔的組織器官以及實驗室確診保存的巴氏桿菌、沙門氏菌和球蟲感染致死的兔組 織器官；
[0105] ②切片在0.01Μ pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液90 °C微波修復4次，5min/次，每次間隔 4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫；
[0106] ③切片經ros緩沖液漂洗3次，5min/次，H2〇2經ros緩沖液稀釋至10%，滴加覆蓋在 組織上，37 °C濕盒避光封閉lh;
[0107] ④切片經ros緩沖液漂洗3次，5min/次，10%小牛血清經PBS緩沖液稀釋至10%，滴 加覆蓋在組織上，37°C濕盒孵育50min;
[0108] ⑤甩去組織上的血清，小鼠抗產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體All經roS緩沖液稀 釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內孵育，4°C過夜轉37°C濕盒孵育30min;同時設置替代 實驗，以非免疫小鼠血清和PBS代替一抗，其余步驟不變；
[0109] ⑥切片于經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標二抗各試 劑，37°C濕盒孵育50min;
[0110] ⑦切片經ros緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60S，切片再用去離子水 充分洗滌，終止顯色反應；
[0111] ⑧切片經蘇木素復染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色；
[0112] ⑨1 %鹽酸酒精進行分化3s，切片在去離子水中沖洗返藍15min;
[0113] ⑩最后組織切片經過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。
[0114] 結果判定：
[0115] 按照普通光學顯微鏡視野下觀察到的特定區域或細胞經染色后棕黃色顯色的有 無、數量、種類及深淺來判定，判定標準為：
[0116] (1)沒有出現棕黃色區域或細胞的判為陰性；
[0117] (2)組織中棕黃色區域或細胞零星分布且少于5%的判為弱陽性；
[0118] (3)組織中棕黃色區域或細胞分布比例為5 %~50 %為陽性；
[0119] (4)組織中棕黃色區域或細胞在組織中分布比例大于50%為強陽性。
[0120] 根據上述方法和標準，發明人對對人工肌肉感染病兔組織器官中α毒素的分布檢 測運用建立好的Envision免疫組化方法，檢測人工肌肉感染病兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎 臟、胃、小腸和盲腸中的α毒素，其檢測結果為：腎臟：陽性著色主要分布在腎小管的上皮細 胞胞質中，染色結果為強陽性(圖la);胃：陽性顆粒主要分布在黏膜固有層的胃底腺細胞及 黏膜頂端脫落上皮細胞的胞質中，染色結果為強陽性(圖lc);小腸：陽性信號主要分布在腸 絨毛上皮細胞及固有層中，染色結果為強陽性（圖le);盲腸：陽性顆粒主要分布在粘膜上皮 細胞和腺體細胞的胞漿中，染色結果為陽性;脾臟：白髓紅髓中都有彌散性棕黃色陽性顆粒 分布，染色結果為強陽性（圖lg);肝臟:肝竇中及變性、壞死肝細胞胞質中有陽性顆粒著色， 染色結果為陽性;肺臟:肺間質、肺泡壁及支氣管受損的柱狀上皮細胞胞質有陽性顆粒分 布，染色結果為陽性;心臟：陽性顆粒主要分布在顆粒變性的心肌細胞胞質，染色結果為陽 性。因此，本發明所提供的方法可以用于產氣莢膜梭菌病α毒素的檢測。
【主權項】
1. 一種產氣芙膜梭菌病α毒素化Vi Sion免疫組化的檢測方法，其特征在于:具體步驟如 下： (1) 產氣芙膜梭菌α毒素的制備： A型產氣芙膜梭菌菌種接種于血平板培養基上進行復蘇，37°C厭氧培養36h，選取單個 的菌落進行液體硫乙醇厭氧增菌12小時，然后將增菌液按體積百分比5%接種于產毒培養 基中，45°C培養化產毒，將培養物離屯、后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除菌后的A型產 氣芙膜梭菌外毒素； (2) 人工感染家兔產氣芙膜梭菌病 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機分成實驗組和對照組，3只/組，實驗組肌肉注射 上述除菌α毒素3mL，對照組注射等量的生理鹽水，7化內觀察動物發病狀況;實驗組在其死 亡時，立即進行臨床剖檢病變，并取病變組織，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續的組 織切片制備和免疫組化染色;對照組同時進行； (3) 組織切片的制備 組織于固定液4她后，將組織用刀片切成1cm3的組織塊，組織塊經流水沖洗完固定液后， 再進行常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，切片于37°C溫箱烤干，放置4°C備 用后續免疫組化染色；陰性對照組組織同時進行此方法操作； (4化nvision免疫組化檢測 ① 陰性對照與陽性對照的組織切片于4 °C冰箱拿出，在室溫放置無水霧后，放置37°C溫 箱30min，使組織粘的更牢固，再脫蠟； ② 上述切片依次經二甲苯Ι、Π ，體積比1:1的二甲苯：100%酒精混合物，各常規脫蠟 6min，再經100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸饋水，各水化處理4min; ③ 上述切片在0.01M pH 6.0巧樣酸鹽緩沖液90°C微波修復4次，5min/次，每次間隔 4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫， 其中所述的0.01M pH 6.0巧樣酸鹽緩沖液成分為：1L去離子水、巧樣酸0.378g、巧樣酸 Ξ鋼2.412g; ④ 上述切片經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，將此化用PBS緩沖液稀釋至10 %，滴加覆蓋 在組織上，37 °C濕盒避光封閉化； ⑤ 上述切片經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，小牛血清經PBS緩沖液稀釋至10%，滴加覆 蓋在組織上，37°C濕盒解育50min; ⑥ 甩去組織上的血清，小鼠抗產氣芙膜梭菌α毒素單克隆抗體F12經PBS緩沖液按體積 比稀釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內解育，4 °C過夜轉37 °C濕盒解育30min; ⑦ 上述切片于經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標二抗各試 劑，37°C濕盒解育50min; ⑧ 上述切片經PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60S，切片再用去離子水 充分洗涂，終止顯色反應； ⑨ 上述切片經蘇木素復染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色； ⑩ 1%鹽酸無水乙醇溶液進行分化3s，之后切片在去離子水中沖洗返藍15min; 0最后組織切片經過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察； 上述使用的PBS緩沖液成分為：1L去離子水、憐酸二氨鐘:0.27g、憐酸氨二鋼：1.42g、氯 化鋼:8g、氯化鐘0.2g; 結果判定標準的確定： 按照普通光學顯微鏡視野下觀察到的特定區域或細胞經染色后棟黃色顯色的有無、數 量、種類及深淺來判定，判定標準為： ① 沒有出現棟黃色區域或細胞的判為陰性； ② 組織中棟黃色區域或細胞零星分布且少于5%的判為弱陽性； ③ 組織中棟黃色區域或細胞分布比例為5 %~50 %為陽性； ④ 組織中棟黃色區域或細胞在組織中分布比例大于50%為強陽性。2. 根據權利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟（1)中所述的血平板培養基成分為： 100毫升蒸饋水、3.始豆粉瓊脂、Ig葡萄糖和5ml脫纖綿羊血； 所述的產毒培養基成分為:每lOOmlPBS緩沖液溶解3g膜蛋白腺、1.?糊精、地酵母浸膏 和2.2g心精氨酸。3. 根據權利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中的改良Bouin'S液固定液成分 為:750mL飽和苦味酸緩沖液，甲醒250mL，且在使用前不加50mL冰乙酸。4. 根據權利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟(4)中小鼠抗產氣芙膜梭菌α毒素單 克隆抗體F12的制備方法如下： 將產氣芙膜梭菌α毒素的雜交瘤細胞株F12,保藏于中國微生物菌種保藏中屯、保藏，保 藏編號:CGMCC No. 8870;進行復蘇、培養;選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式 不完全佐劑0.5血/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細胞株F12,0.5-1 X106個/只，7-10天后 收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12，腹水經正辛酸-硫酸錠方法純化，SDS-PAGE檢測純 化效果。
【文檔編號】G01N33/577GK106093404SQ201610357015
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】王海榮, 秦貴平, 柴同杰, 陳長俊
【申請人】山東農業大學