MiR?30a/HP1γ作為結直腸癌的診斷標志物的應用
【專利摘要】本發明涉及分子生物學和腫瘤藥學領域。涉及miR?30a及HP1γ蛋白在結直腸癌診斷中的用途，以及miR?30a和HP1γ作為標志物用于結直腸癌的檢測方法。本發明運用Real?timePCR、免疫組化(IHC)技術和蛋白印跡分析等方法檢測結直腸癌病人腫瘤組織及其配對的正常組織中的miR?30a和HP1γ的表達水平。結果表明miR?30a在結直腸癌組織中顯著低于其配對的正常組織；而HP1γ在結直腸癌組織中表達明顯高于其配對的正常組織,并且miR?30a能特異性調節HP1γ蛋白的表達。由于HP1γ的表達水平與結直腸癌患者的腫瘤分化程度和術后生存率之間均呈顯著負相關，本發明表明miR?30a/HP1γ能同時作為結直腸癌臨床診斷的潛在標志物。
【專利說明】M i R-30a/HP1 γ作為結直腸癌的診斷標志物的應用
[0001] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的講授內容之后，本領域技術人員可以對 本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
技術領域
[0002] 本發明涉及生物科學領域，更具體地說，涉及癌癥診斷領域。特別是，本發明涉及 利用miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和其革巴基因 ΗΡ1 γ (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185-CBX3_HUMAN)共同作為結直腸癌診斷的腫瘤標志物，即通過檢測miR-30a/ HP1 γ雙表達水平來區分癌變細胞和正常細胞。
【背景技術】
[0003] 結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率一直呈上升趨勢，在全球惡性腫 瘤發病率中已上升至第三位，其死亡率居惡性腫瘤第二位。近些年來全球每年有一百多萬 人死于結直腸癌。由于結直腸癌的發生與生活習慣，特別是飲食習慣密切相關，因此近年隨 著我國人民生活水平的逐漸提高，結直腸癌的發病率和致死率在我國飛速增長。在我國，早 期發現結直腸癌患者診斷率不足10%。目前診斷結直腸癌的"金標準"是結腸鏡，目前公認， 年齡大于50歲的人均應該接受結腸鏡篩查。美國以及歐洲等權威部門指，對于具有家族性 高發病史或由于個人習慣患病風險高的人來說腸鏡篩查尤為重要。但是我國目前還不上具 備在體檢中廣泛進行腸鏡檢測的條件，受試者的痛苦也不言而喻，所以廣泛推行結腸鏡檢 測并不現實。
[0004] 迄今為止，全球的結直腸癌篩查方案尚不成熟。人們已經確定了一些存在于結直 腸組織、糞便或血清中的生物標記物，如癌胚抗原(CEA)等，來用于結腸癌的早期診斷和預 測。目前，CEA是臨床上唯一一個推薦用于結直腸癌患者診斷及預后判斷的分子標志物，遠 遠不能滿足臨床需求，因此亟待尋找更多結直腸癌相關腫瘤標志物。最近還報道了一些組 織、糞便和血清中的結直腸癌分子標記物，但其效果也遠低于結腸鏡。例如用糞便DNA特異 地甲基化位點作為標記，當特異度達到90%時，靈敏度只有50%。每年大約報道上千種腫瘤 分子標記物，但是最后應用于臨床的分子標志物廖廖無幾。早期的篩查和診斷已經成為結 直腸癌防治急需解決的重大科學問題。腫瘤標志物的發現和合理應用是腫瘤早期發現、早 期診斷的前提。然而，目前對于有關結直腸癌的發病機制和特性的認識仍然不足。因此，開 發新的結直腸癌早期診斷和治療策略成為當務之急。
[0005] 迄今為止，尚未發現可供臨床應用的、能有效地早期篩查和診斷結直腸的檢測試 劑。本發明以miR-30a/HPl γ作為標志物用于結直腸癌的檢測試劑及方法，將為早期發現和 診斷結直腸癌，以及為腫瘤患者提供可靠的輔助治療方案具有重要的意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供miR-30a/HPl γ的新用途。本發明提供了miR-30a/HPl γ作為 結直腸癌輔助診斷標志物的用途，以及使用miR-30a/HPl γ為靶標篩選抑制結直腸癌細胞 增殖和侵襲的藥物，為結直腸癌的診斷和治療提供參考依據。本發明采用Real-time PCR， Western Blot和免疫組化技術對結直腸癌病人的腫瘤標本與正常組織中miR-30a/HPl γ的 表達水平進行分析，發現miR-30a的表達水平在結直腸癌組織中顯著低于其配對的正常組 織，而ΗΡΙγ在結直腸癌組織中顯著高于其配對的正常組織并且其蛋白質表達水平直接受 miR-30a調控，表明miR-30a/HPl γ能夠作為結直腸癌的一種輔助診斷標志物。
[0007] 本發明的技術方案主要包括如下內容：
[0008] 一種與癌細胞或腫瘤輔助診斷相關的標志物，該標志物為miR-30a和ΗΡ1 γ中的任 意一種或兩種，所述的ΗΡ1 γ為ΗΡ1 γ基因或/和ΗΡ1 γ蛋白。該標志物優選為miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的組合。
[0009] miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一種或兩種在作為癌細胞或腫瘤輔助診斷標志物中的 應用。優選為miR_30a和ΗΡ1 γ蛋白在作為癌細胞或腫瘤輔助診斷標志物中的應用。
[0010] 上述的標志物在制備癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒中的應用。
[0011] -種用于檢測miR_30a表達水平的試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片中包 括用于檢測血液或腫瘤組織中的miR-30a表達水平的特異性引物。
[0012] 一種用于檢測ΗΡΙγ蛋白表達水平的試劑盒，該試劑盒中包括用于檢測血液或腫 瘤組織中的ΗΡ1 γ蛋白表達水平的特異性抗體。
[0013] -種癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片用于檢測血 液或腫瘤組織中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的雙表達水平。上述的癌細胞或腫瘤輔助診斷 試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片含有用于檢測miR_30a表達水平和HP1 γ蛋白mRNA 的特異性引物和用于檢測HP1 γ蛋白表達水平的特異性抗體。
[0014] 上述的癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，該試劑盒中還包括PCR技術常 用的試劑和免疫組化技術常用的試劑。
[0015] -種在癌細胞或腫瘤中高表達的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表達量的抑制物，該 抑制物為ΗΡ1 γ基因及其蛋白產物的抑制物，優選的該抑制物為包括抗體、化學抑制物、和 miRNA抑制物以及類似物中的至少一種。所述的miRNA抑制物為miR-30a以及類似物，優選為 miR-30a〇
[0016] miR-30a在制備抑制癌細胞或腫瘤藥物中的應用。
[0017] 所述的癌細胞包括結直腸癌細胞及其他類似的上皮癌細胞;所述的腫瘤包括腸癌 及其他上皮腫瘤。所述的上皮腫瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌。
[0018] 上述技術方案中，miR-30a和HP1 γ蛋白表達水平的檢測分析過程分別包括以下步 驟：
[0019] l)miR-30a表達水平的檢測分析
[0020] a)收集結直腸癌病人的新鮮腫瘤組織標本，提取總RNA
[0021] b)Real-time PCR檢測miR-30a表達水平
[0022] c)miR-30a與HP1 γ蛋白表達相關性分析
[0023] 2)ΗΡ1 γ蛋白表達水平的檢測分析
[0024] a)收集結直腸癌病理標本，提取總蛋白
[0025] b)使用特異的HP1 γ抗體進行Western blot實驗，測定HP1 γ蛋白的表達水平
[0026] c)收集癌癥病人的石臘切片
[0027] d)免疫組織化學染色（IHC)檢測分析HP1 γ蛋白表達情況。
[0028] 采用本發明所述的標志物確定受檢細胞是癌細胞還是正常細胞的檢測方法，同時 檢測病人血液或腫瘤組織中miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和ΗΡ1 γ蛋白（Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q 13185-CBX3_HUMAN)的表達情況。如果病人樣品中ΗΡΙγ 蛋白 水平升高且miR_30a水平低于正常組織對照，則可初步判定此病人患有腫瘤。
[0029] 所述的癌細胞包括了結直腸癌細胞及其他類似的上皮癌細胞（epithelial cancer cell)。
[0030] 所述的腫瘤組織包括：腸癌及其他上皮腫瘤如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌 等。
[0031] 包括利用PCR技術、微陣列芯片、測序技術及免疫組化技術對miR-30a和HP1 γ蛋白 質的表達水平進行分析以確定病人樣品中細胞癌變信息的方法。
[0032]本發明發現一種能抑制本發明所鑒定出的在結直腸癌中高表達的ΗΡ1 γ蛋白 (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185_CBX3_HUMAN)的活性、作用、及表達 量的方法，以及由此產生的新的結直腸癌或其他上皮腫瘤的診斷和治療方案。其中包括HP1 γ基因及其蛋白產物的抑制物，包括:抗體、化學抑制物、和miRNA抑制物以及類似物。其中， 所述的miRNA抑制物包括本發明所鑒定出的與結直腸癌相關的miR-30a(Hsa-miR-30a-5p) 以及類似物。
[0033]本發明的實驗結果用獨立實驗的平均值和標準差表示，用雙側t檢驗來比較差異。 P〈0.05認為具有統計學差異，P〈0.01為顯著性差異。所有數據采用SPSS V13.0軟件或者具 備類似統計功能的軟件分析。
[0034]本發明的有益效果：
[0035]本發明提供了一種快速簡便的結直腸癌輔助診斷標記物(miR-30a/HPl γ )的檢測 方法，可以作為結直腸癌診斷的輔助指標。
【附圖說明】
[0036] 圖1 Western Blot實驗檢測結直腸癌病人腫瘤組織及配對的正常組織的ΗΡΙγ蛋 白表達水平
[0037]圖2 ΗΡΙγ在結直腸癌臨床病理標本中表達分析 [0038]圖3 miR_30a在結直腸癌組織中表達情況及相關性分析
[0039] 圖4 HP1 γ為miR-30a下游靶基因 [0040]圖5 miR-30a抑制結直腸癌細胞增殖與克隆形成能力 [0041 ] 圖6 miR_30a在體內抑制結直腸癌細胞生長
【具體實施方式】
[0042]本發明人經過廣泛的研究，發現miR-30a和HP1 γ在結直腸癌組織中存在異常表 達，并且二者呈現負相關的關系，從而提示miR-30a和ΗΡΙγ在結直腸癌發生和發展過程中 起到較為重要的作用。miR-30a/HPl γ可以同時作為結直腸癌的一種診斷標志物，有助于結 直腸癌的早期診斷、靶向治療和臨床預后。
[0043]本發明具體實施例中所涉及的試劑除特別說明外，均為本領域技術人員公知的常 規試劑。本發明中所述的室溫為25 ± 5°C。
[0044] [1]ΗΡ1 γ蛋白水平的檢測：
[0045] 采用Western blot技術檢測ΗΡΙγ蛋白在結直腸癌組織和相應的正常組織中的表 達情況。圖l(A)Western blot檢測ΗΡ1 γ蛋白在結直腸癌新鮮組織標本中的表達情況(η = 38)，每一例包括結直腸癌組織和匹配的正常組織。GAPDH作為內參。圖1(B)用Image J軟件 對Western blot圖進行灰度分析，并以HP1 γ/GATOH值作為縱坐標，比較結直腸癌(CRC)和 正常組織(NAT)中HP1 γ表達情況，Western blot實驗結果表明HP1 γ蛋白在結直腸癌組織 中顯著高于其配對的正常組織(Ρ〈〇.01)。
[0046]具體實施步驟如下：
[0047] 1)收集病人的腫瘤組織及配對的正常組織，剪成小塊用液氮研磨，加 lmL RAPI蛋 白裂解液裂解細胞，然后將裂解液移入到1.5mL離心管，冰上裂解30分鐘。
[0048] 2)14000印111，4°(：，10分鐘，收集蛋白上清，-20°(：保存。
[0049] 3)用BSA法測定蛋白質濃度。
[0050] 4)取相同質量的蛋白量(體積X蛋白質濃度），并加入5 X電泳加樣緩沖液。
[0051] 5)10(TC 煮樣 5 分鐘。
[0052] 6)上樣，電泳。90V，大約15-20分鐘，樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠后，電壓調 至120V，電流過程中保持電壓恒定。當溴酚藍指示劑迀移至距前沿l-2cm處即停止電泳，約 1-2小時。15%的分離膠和5%的濃縮膠的配方見表1。
[0053]表1 15%的分離膠和5%的濃縮膠：
[0054]
[0055] 7)電轉膜儀轉膜(24V 35分鐘）
[0056] 8)牛奶封閉。5%牛奶(5g奶粉+100mL PBST)，室溫，搖床上封閉1小時。
[0057] 9)孵育HP1 γ 蛋白一抗（l/1000;Millipore，#05-690)及GAPDH內參一抗（1/20000; MBL，#M171-3)，4°C，過夜。
[0058] 10) PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫搖床。
[0059] 11)孵育與一抗相對應種屬的二抗(1/50000; Sigma，#A2304)，室溫搖床2小時。
[0060] 12) PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫搖床。
[00611 13)加 ECA發光液反應1-2分鐘，顯影，定影，觀察結果。
[0062] [2]ΗΡ1 γ蛋白免疫組化分析
[0063]圖2(A)免疫組織化學染色（IHC)檢測ΗΡΙγ蛋白在正常組織、高分化、中分化和低 分化結腸癌組織中的表達情況，結果顯示在結直腸癌組織中ΗΡ1 γ蛋白表達水平顯著高于 正常組織(11=178，？〈0.001)。圖2(8)即1丫在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織。數 據表示為16&11±50，***?〈0.001(11=178) ;圖2(〇冊1丫蛋白在正常(11 = 178)、高分化(11 = 18)、中分化(η=122)和低分化(η = 38)結直腸癌中的表達情況，并且發現ΗΡΙγ表達與腫瘤 分化程度呈負相關（？〈0.05)。數據表示為1^311±50，沖〈0.01，*沖〈0.01 ;圖2(0)1^口1&11-Meier 法分析 ΗΡΙγ 高表達組（High ΗΡΙγ expression，n = 82)與低表達組（Low ΗΡΙγ expression，η = 91)臨床預后之間的關系(Log Rank，Ρ = 0.001)。結果顯示，ΗΡ1 γ的表達水 平與結直腸癌患者的生存率之間呈負相關，在統計學上有非常顯著的差異(Ρ = 〇.001)。 [0064] 免疫組化主要試劑：
[0065]即用型高效免疫組化試劑盒產品編號為UNIV-IHC-0001，包括試劑Α:內源性過氧 化酶阻斷劑(Endogenous peroxidase blocking solution);試劑Β:超級封閉液；試劑C:一 抗放大劑;試劑D:酶標二抗聚合物;DAB顯色劑：即用即配。枸櫞酸鈉抗原修復液(pH 6.0)、 0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.4)購自武漢博士德生物工程有限公司；蘇木精，樹脂封 片劑，硅化載玻片，蓋玻片;30 %酒精，50 %酒精，70 %和90 %酒精，無水酒精，二甲苯均等。 [0066]具體實施步驟如下：
[0067] 1)180例隨訪5~8年的人類結直腸癌組織樣本芯片來自于上海國家工程研究中心 生物樣本庫。所有病例手術時間為2006~2007年間，且術前均未經化學治療或放射治療， 180例患者中男性104例，女性76例，年齡24~90歲，平均年齡66歲；結腸癌和直腸癌各90例； 臨床病理分期:結直腸癌I期18例，Π 期122例，ΙΠ 期38例，未提供病理信息2例，詳細信息見 附表2。所有的組織標本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規脫水、石蠟包埋備用。 [0068]表2:結直腸癌標本臨床病理參數統計
[0069]
[0071] 2)石蠟切片脫蠟至水:脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60°C恒溫箱中 烘烤20分鐘。二甲苯I 10分鐘-二甲苯II 5分鐘。酒精梯度：100%，5分鐘-90%，5分鐘- 70%，5分鐘-50%，5分鐘。PBS洗5分鐘，3次。
[0072] 3)抗原修復:將切片置于10mM pH6.0檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，微波爐加熱15分 鐘。
[0073] 4)過氧化氫封閉內源性過氧化物酶:3 %H2〇2，室溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次。
[0074] 5)正常血清封閉：擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分(保持組織呈濕 潤狀態），滴加正常山羊或兔或牛血清（1 %BSA，0.05g BSA+5ml PBS)(與第二抗體同源動物 血清），室溫，1小時，PBS洗5分鐘，3次。
[0075] 6)10%正常山羊血清室溫封閉20分鐘后加 HP1 γ蛋白一抗（1:500)，室溫孵育1小 時，PBS洗5分鐘，3次。
[0076] 7)加二抗(與一抗相對應），室溫1小時（1:200)，PBS洗5分鐘，3次。
[0077] 8 )DAB顯色，終止后自來水沖洗，蘇木素復染。
[0078] 9)梯度酒精脫水:50%乙醇1分鐘-70%乙醇1分鐘-90%乙醇1分鐘-100%乙醇 1分鐘。二甲苯透明：二甲苯I和Π 按序各5分鐘。
[0079] 10)中性樹脂封片，顯微鏡下觀察HP1 γ蛋白水平。
[0080] 11)結果判定:在光學顯微鏡下，胞漿或胞核出現棕黃顆粒為陽性細胞。免疫組化 陽性反應的分級采用兼顧陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比的判斷標準。具體方法 為每張切片隨機取5個高倍視野，盡量避開邊緣區。用微微測量網格計數所有細胞數以及陽 性細胞數，計算陽性細胞所占比例的平均值。按染色強度評分:無色為〇分，淡黃色為1分，棕 黃色為2分，棕褐色為3分;按陽性細胞所占百分比評分：陰性為0分，陽性細胞<10%為1分， 11 %~50%為2分，51 %~75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性百分比得分的乘積>3為 免疫陽性。并按乘積分數分為4個等級:一 (0，1，2); + (3,4);++(6,8);+++(9，12)。
[0081 ] [3]miR_30a在結直腸癌組織中表達情況及相關性分析
[0082] 我們利用Real-time PCR技術在38例結直腸癌組織和相應的正常組織中檢測了 miR-30a表達情況。數據顯示為Mean 土 SD，獨立實驗重復3次，采用獨立樣本t檢驗方法。結果 表明miR-30a在結直腸癌組織中表達顯著低于其配對的正常組織（圖3A和B)，*P〈0.05，**P〈 0.01;圖3(C)38對結直腸癌組織標本中miR-30a表達水平與HP1 γ蛋白表達水平相關性分析 (R = -0.5981，#Ρ〈0.01)，miR-30a表達水平與ΗΡ1 γ蛋白表達水平呈顯著負相關。
[0083]具體實施步驟如下：
[0084] 3.1收集結直腸癌病人的新鮮腫瘤組織標本，提取總RNA
[0085] 38例新鮮結直腸癌組織標本從江蘇省中醫院（南京中醫藥大學附屬醫院）收集，每 例包括腫瘤組織和相應的癌旁組織，采集前均通過江蘇省中醫院倫理委員會批準及患者知 情同意。所有標本均經病理診斷確診為結直腸癌，所有患者未接受放化療治療。收集病人的 腫瘤組織及配對的正常組織，液氮保存備用。
[0086] 采用QIAGEN公司的miRN^;asy?Minikit(cat·no·217004)可以提取純化含有 miRNA的總RNA，詳細步驟如下：
[0087] 1)加 700yLQIAzol Lysis試劑到細胞樣品中充分裂解，如果是臨床組織樣本需要 先在研缽中邊加液氮邊研磨，待組織樣本磨成粉末后加入QIAzol Lysis繼續研磨，再將研 磨液吸入到1.5mL去RNA酶EP中，室溫靜置5min;
[0088] 2)加入140yL三氯甲烷(氯仿），旋渦振蕩15s，室溫靜2~3min;
[0089] 3)4°C，12000Xg 離心 15min;
[0090] 4)小心吸取離心后上清至一個新收集管中，加入1.5倍體積的100 %乙醇，吹打混 勻；
[0091] 5)將RNeasy?Mini柱放入一個2mL收集管中，吸取700yL混合液至RNeasy?:Mini柱 中，室溫彡8000 X g離心15s，棄過濾液；
[0092] 6)重復上面步驟直至混合液全部離心完；
[0093] 7)加入700yL RWT buffer至RNeas:y?Mini柱中，室溫彡8000Xg離心 15s，棄過濾 液；
[0094] 8)加入500yL RPE buffer至RNeasy?Mini柱中，室溫彡8000Xg離心 15s，棄過濾 液；
[0095] 9)加入500yL RPE buffer至R.Ncasy?Mini柱中，室溫^8000Xg離心2min，棄過濾 液；
[0096] 10)將RNeasy?Mini柱放到一個新的1.5mL收集管中，吸取30~50yL RNA-free H2O至RNeasy?Mini柱中央膜上，室溫彡8000 X g離心lmin;
[0097] 如果希望得到更多產量的RNA，可重復步驟（10)，再吸取30~50yL RNA-free H20 至RNeasyiJMini柱中央膜上，離心得到總RNA樣品。
[0098] 3.2 miRNA逆轉錄
[0099]米用GenePharma公司的Haripin-itTM microRNA and U6snRNA Normalization Real-time PCR Quantitation Kit，以l_3yg總RNA為逆轉錄模板，使用帶有莖環結構的特 異性引物將miRNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄所得的cDNA產物用ddH20稀釋至200yL，再作為模板 用于下一步Real-time PCR(miR-30a及U6逆轉錄引物及檢測引物均由上海吉瑪制藥技術有 限公司設計并合成）。逆轉錄體系見表3。
[0100] 表3逆轉錄體系：
[0101]
[0102] 標準逆轉錄反應程序：
[0103] Step l：25〇C,30min
[0104] Step 2：42〇C,30min
[0105] Step 3：85〇C,5min
[0106] 4Γ，保存。
[0107] 3.3 Real-time定量檢測miR_30a表達水平
[0108] 反應體系見表4
[0109] 表4反應體系：
[0110]
[0111] 實時定量PCR反應程序：
[0112] Step l：95〇C,3min
[0113] Step 2:95Γ，128;62Γ，40s(40循環）
[0114] [4]ΗΡ1 γ 為miR-30a下游靶基因
[0115] TargetScan(http://www. targetscan. org/),PicTar(http://pictar.mdc- berlin · de/)和miRDB(http: //www .mirbase · org/)是目前使用率最高，并且公認的miRNA革巴 基因預測信息較完善，相對比較準確的預測軟件。生物信息學預測軟件顯示在HP1 γ的3'-UTR 區域存在 miR-30 家族(包括 111丨1?-3(^、111丨1?-3013、111丨1?-30(3、111丨1?-30(1和111丨1?-3〇6)的結合位點 (圖4A)，并且該結合位點區域具有特種保守性。此外miR-30家族所有成員具有相同的種子 區域(Seed sequence)，均結合在HP1 y3'_UTR區域上。熒光素酶報告基因實驗檢測了miR-30家族是否可以通過結合在HP1 γ 3'-UTR區域從而負調控HP1 γ的表達。結果顯示，miR-30a/b/c/d/e分別與克隆了HP1 γ 3'-UTR的pMIR-REPORT? Luciferase質粒和共轉染HCT116 細胞之后，與陰性對照相比，熒光強度均受到不同程度的抑制（圖4B)，但miR-30a的抑制效 果最強(？〈0.01)。然而，將11^1?-30 &結合位點堿基突變以后，這種抑制效果幾乎消失（圖4〇 (P>0.05)。在Western blot實驗中，miR-30a轉染細胞后，HP1 γ蛋白水平明顯受到抑制，表 明ΗΡ1 γ是miR-30a直接作用的下游靶基因（圖4D&E)。
[0116]具體實施步驟如下：
[0117] 4.1熒光素酶報告基因載體構建
[0118] 4.1.1引物設計
[0119] 根據生物信息預測（表5)，找到HPly3'UTR上與miR-30家族結合片段的序列。HP1 Y3'UTR片段序列如下：
[0121] 表5 TargetScan軟件預測miR-30家族與HP1 γ的結合位點
[0122]
[0123] 根據上述序列，在Primer 5.0中設計PCR擴增引物：
[0124] Sense:5 '-TCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0125] Antisense:5 '-TTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0126] 分別加上(Spe I和Hind III)酶切位點和保護堿基：
[0127] Sense:5 '-CGGACTAGTTCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0128] Antisense:5 '-CCCAAGCTTTTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0129]引物設計完成后，經過http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/在線比對確認，由南京 金斯瑞生物公司合成。
[0130] 4.1.2 PCR擴增
[0131] 表6標準PCR反應體系：
[0132]
[0133] 標準PCR反應程序：
[0134] Step 1:95 °C，5min
[0135] Step 2:98Γ，1〇8;55Γ 30s;72°C 20s(35個循環）
[0136] Step 3：72〇Ca〇min
[0137] 4°C，保存。
[0138] 4.1.3瓊脂糖凝膠電泳
[0139 ] 1)洗凈瓊脂糖凝膠電泳槽、梳子，配制1 X TAE電泳緩沖液；
[0140] 2)將配置好的2%瓊脂糖凝膠插上梳子，室溫下放置30~45min，直至凝膠完全凝 結；
[0141 ] 3)小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中；
[0142] 4)向電泳槽中加入1 X TAE電泳緩沖液，剛好沒過凝膠；
[0143] 5)將 10XLoading buffer與PCR產物混合均勻；
[0144] 6)將上述混合液加至上樣孔中；
[0145] 7)關上電泳槽蓋，接好電源，電壓90V，使DNA從負極(黑）向正極(紅)方向移動；
[0146] 8)當溴酚藍向前移動至膠的2/3時，關閉電源，拔出電極插頭，打開電泳槽蓋。
[0147] 4.1.4 DNA產物膠回收
[0148] 1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計算凝膠重量；
[0149] 2)加3個凝膠體積的Buffer DE-A，75°C加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化(約6 ~8min);
[0150] 3)加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勾。當分離的DNA片段小于 400bp時，加入1個凝膠體積的異丙醇；
[0151] 4)吸取上一步中的混合液，轉移到DNA制備管（置于2mL離心管）中，13000rpm， lmin，棄濾液；
[0152] 5)將制備管置回2mL離心管，加500yL Buffer ￥1，13000印111，3〇8，棄濾液；
[0153] 6)將制備管置回2mL離心管，加700yL Buffer 12，13000印111，3〇8，棄濾液，重復一 次；
[0154] 7)將制備管置于2mL離心管中，13000rpm，離心2min;
[0155] 8)將制備管置于新的1.5mL離心管中，加25~60yL去離子水，室溫靜置5min;
[0156] 9) 13000rpm，lmin，洗脫 DNA，-20 °C 保存備用。
[0157] 4.1.5目的片段和報告基因載體雙酶切
[0158] 表7雙酶切反應體系：
[0159]
[0160] 37°C水浴3h，瓊脂糖凝膠電泳對DNA片段和pMIR-REPORTTM Luciferase載體雙酶 切產物進行回收純化。
[0161] 4.1.6 DNA片段與載體連接
[0162] 表8 DNA片段與載體連接反應體系
[0163]
[0164] DNA片段與載體分子數目比為1:10~1: 3。16°(：連接過夜。
[0165] 4.1.7細菌轉化
[0166] 1)取出感受態細菌DH5a，冰上融化；
[0167] 2)加入5~20yL連接產物至感受態細菌DH5a中，輕輕混勻，冰上放置30min;
[0168] 3)42°(：熱激9〇8，然后迅速冰浴21^11;
[0169] 4)加 lmL的LB培養液，37°C搖床中培養45min;
[0170] 5)將菌液均勻涂布于含有抗生素的LB平板上；
[0171] 6)37°C培養箱中培養12~16h，直至長出肉眼可見菌落時挑取單克隆擴大培養并 鑒定。
[0172] 4.1.8質粒提取
[ΟΙ73 ] 1)收集5~15mL過夜培養的菌液，8000rpm，離心lmin，棄上清；
[0174] 2)加入500yL Buffer P1(含RNase A)，渦旋振蕩懸浮細菌沉淀；
[0175] 3)加入500yL Buffer P2,溫和混勻，室溫放置3~5min;
[0176] 4)加入500yL Buffer E3,立即混勻，室溫放置5min;
[0177] 5)13000rpm，離心 lOmin;
[0178] 6)將上清加入Endo-Remover Column中（已裝入收集管），13000rpm，離心lmin;
[0179] 7)將收集管中的濾液轉移到新的離心管中，加入450yL異丙醇，上下顛倒混勻；
[0180] 8)柱平衡：向已裝入收集管的Spin Column DL中加入200yL Buffer PS， 13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將Spin Column DL重新放回收集管中；
[0181] 9)將步驟7)中濾液與異丙醇的混合溶液轉移到平衡好的吸附柱（已裝入收集管） 中；
[0182 ] 10) 13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
[0183] 11)加入750yL Buffer PW，13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液；
[0184] 12)將吸附柱重新放回收集管中，13000rpm，離心2min，倒掉廢液，將吸附柱置于室 溫干燥5min;
[0185] 13)將吸附柱置于一個新的離心管中，加入100~200yL去離子水，室溫放置5min， 13000rpm，離心2min，-20 °C 保存備用。
[0186] 4.1.9目的片段鑒定
[0187] 將上述質粒應用相應的限制性雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切結果，初步查 看條帶是否與目的片段大小一致，并將樣本送至上海英駿生物技術有限公司進行測序分 析，進一步確定克隆進載體的片段是否為目的片段以及是否有堿基突變。
[0188] 4.2 miRNA結合位點堿基突變
[0189] 我們使用Muta-direct?定點突變試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司）可以在 質粒DNA序列的特定位點誘導堿基突變。
[0190] 4.2.1設計點突變引物
[0191] 1)設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置；
[0192] 2)計算引物的Tm值，看是否達到78°C，如果Tm值低于78°C，則適當改變引物的長度 以使其Tm值達到78°C(GC含量應大于40%);
[0193] 3)使用經過純化的引物；
[0194] !'111值計算公式：1'111 = 0.41\(%(^6〇-675/1+81.5
[0195] 其中：L:引物堿基數；％of GC:引物GC含量。
[0196] 4.2.2樣品PCR反應體系
[0197] 表9樣品PCR反應體系：
[0199] 4.2.3 PCR反應條件
[0200] Step 1:95 °C，3s
[0201] Step 2:95°C，lmin; 72°C，lmin per plasmid KB(突變 1-2個喊基 15循環，突變3個 堿基18個循環）
[0202] PCR擴增反應完成后冰上孵育5min，然后置于室溫。
[0203] 4.2.4突變質粒選擇
[0204] PCR反應結束后使用Mutazyme?酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。
[0205] 1)準備PCR反應產物；
[0206] 2)加入 lyL(10UAiL)Mutazyme? 酶 37°C 溫育 1 小時；
[0207] 當質粒DNA用量過多時Mutazyme?酶可能發生與樣品反應不完全的現象。為了保證 突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加 Mutazyme?酶用量。
[0208] 4.2.5 轉化
[0209] 反應完畢后在質粒DNA上會產生缺口，當把這個質粒DNA轉入E.coli中時選擇dam+ 型菌株，例如DH5a。
[0210] 1)將l〇yL樣品加到50yL感受態細胞里，然后放置在冰上30min;
[0211] 2)接下來可以參照一般的轉化步驟進行。
[0212] 4.3熒光素酶報告基因實驗
[0213] 1)轉染前一天，將生長良好的細胞接種于12孔板中，經16~18h后細胞融合度為 60%~70%左右；
[0214] 2)轉染前吸干培養基，換成新鮮培養基(不含血清和抗生素）。每孔0.8yg單熒光素 酶報告質料，〇. 2yg0-gal內參質粒，miR-30mimics或者NC對照lyL(母液為20μΜ)。質粒(yg) 與轉染試劑(yL)之比為1:3。將上述質粒用100yL的無血清培養基混勻，室溫放置15min后， 再依次加入到六孔板細胞中。37 °C細胞培養箱中培養。其中，每個樣品設三個復孔；
[0215] 3)轉染4~6小時后換成全培養基后繼續培養；
[0216] 4)轉染48小時后，吸去培養基，用roS洗兩遍。先用胰酶消化幾分鐘后，用roS重懸 細胞后移入1.5mL的EP管中，lOOOrpm離心5min收集細胞，在細胞沉淀中加入100yL的RIPA細 胞裂解液，冰上裂解細胞30min;
[0217] 5)4°C，12000rpm離心 10min;
[0218] 6)取10yL上清用于熒光素酶的活性測量，加入40yL的Luciferase底物，迅速吸打 均勻后，測量熒光值；
[0219] 7)準備β-半乳糖甘酶的測活緩沖體系：
[0220] 表10 β-半乳糖甘酶的測活緩沖體系
[0221]
[0222] 37°C水浴反應37min，此時反應液為黃色，取150yL反應液通過酶標儀讀取420nm的 光吸收值。然后用熒光素酶活性除以β-gal活性即可得到相對熒光素酶活性，進而分析 miRNA對靶基因的調控作用。
[0223] [5]miR_30a抑制結直腸癌細胞增殖和克隆形成能力
[0224] 為檢測miR-30a對結直腸癌細胞增殖能力的影響，我們對轉染了 miR-30a的HCT116 和SW620細胞用CCK-8和EdU法檢測miR-30a對結直腸癌細胞增殖能力的影響，結果表明， miR-30a對HCT116和SW620細胞增殖能力有很明顯的抑制效果，具有顯著性差異(#P〈0.01 和*P〈0.05)(圖5A和B)。說明miR-30a能夠抑制HCT116和SW620細胞增殖。我們還研究了miR-30a過表達對結直腸癌細胞克隆形成能力影響的實驗，實驗結果顯示miR-30a過表達后顯著 降低了 HCT116細胞的克隆形成能力（圖5C)。
[0225] 具體實施步驟如下：
[0226] 5.1 CCK-8法檢測細胞增殖
[0227] 1)按miRNA轉染步驟進行細胞轉染，轉染時間24~48h;
[0228] 2)棄培養基，PBS洗兩次，胰酶消化細胞，加入含10%FBS的培養基終止消化；
[0229] 3)計數細胞，調整細胞密度至2X104個/mL，96孔培養板內每孔加入100yL細胞懸 液，即每孔接種2000個細胞，每組設3~5個平行孔，2個空白對照孔，共接種4塊96孔培養板， 37 °C培養箱培養；
[0230] 4)每天同一時間取1塊96孔板進行測量。每孔培養基中加入10yL CCK-8,混勻，37 °C培養lh;
[0231] 5)用酶標儀測定450nm吸光值；
[0232] 6)以不同處理組細胞的0D450值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制細胞的生長曲 線。
[0233] 5.2 EdU法檢測細胞增殖
[0234] 1)按miRNA轉染步驟進行細胞轉染，轉染時間24~48h。消化細胞，計數，以每孔4 X 103~1 X 105細胞接種于96孔板中，培養至正常生長階段；
[0235] 2)用細胞培養基按1000:1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50μΜ EdU培養 基；
[0236] 3)每孔加入100yL 50μΜ EdU培養基孵育2h，棄培養基；
[0237] 4)PBS清洗細胞1~2次，每次5min;
[0238] 5)每孔加入50yL細胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30min，棄固定液；
[0239] 6)每孔加入50yL 2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；
[0240] 7)每孔加入100yL PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS;
[0241] 8)(加強)每孔加入100yL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)脫色搖床孵育lOmin; PBS 清洗1 次，5min;
[0242] 9)每孔加入100yL的IX Apollo染色反應液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄 染色反應液；
[0243] 10)加入100yL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2~3次，每次 10min，棄滲透劑；
[0244] 11)(加強）每孔每次加入lOOyL甲醇清洗1~2次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次 5min；
[0245] 12)用去離子水按100:1的比例稀釋試劑F，制備適量lXHoechst33342反應液，避 光保存；
[0246] 13)每孔加入100yL lXHoechst 33342反應液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min 后，棄染色反應液；
[0247] 14)每孔每次加入100yL PBS清洗1~3次；
[0248] 15)在熒光顯微鏡下截取圖像，拍照。
[0249] 5.3平板克隆實驗
[0250] 1)按miRNA轉染步驟進行細胞轉染，轉染時間24~48h。胰酶消化細胞；
[0251] 2)收集細胞計數，六孔板每孔接種200個細胞，37°C培養14天左右；
[0252] 3)棄培養基，PBS洗1次，甲醇固定20min，棄去固定液，待稍干燥后加入0.1 %結晶 紫染色20min，用水洗去殘余染液，計數細胞數在50個細胞以上的克隆。
[0253] [6]miR_30a在體內抑制結直腸癌細胞生長
[0254] 為了進一步研究miR_30a對腫瘤增殖的作用。我們在免疫缺陷的裸鼠中進行研究， 為了實驗背景的一致性，我們采用同一只小鼠的兩個后肢皮下分別接種miRNA-30a過表達 和NC對照細胞的方法。進而分析miR-30a能否在體內抑制腫瘤的生長。圖6 (A)裸鼠左右側分 別接種5 X 106個HCT116miR-NC與miR-30a過表達的穩定細胞株，20天后處死裸鼠并拍照，從 外觀來看，在接種20天后，轉染miR-30a的腸癌細胞成瘤體積比NC明顯要小；圖6(B)將移植 瘤取出拍照，mi R-30a過表達組(η = 8)與NC組(η = 8)相比體積明顯變小。圖6 (C)繪制mi R-30a過表達組與NC對照組腫瘤生長曲線，每4天測量一次腫瘤尺寸，共測量20天，**P〈0.01; 圖6(D)將miR-30a過表達組(n = 8)與NC對照組(n = 8)腫瘤取出稱重，比較兩組腫瘤質量*** P<0.001；
[0255] 具體實施步驟如下：
[0256] 6.1 miR_30a過表達穩定細胞系構建
[0257] 1 )miRNA-30a 前體序列：
[0258] 鏈A:
[0259] (保護堿基)GCC(HpaI 保護堿基與酶切位點)GTTAACGCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAA GCTGTGAAGCCAC AGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGCTTTTTTG (終止子）
[0260] 鏈B:
[0261] (保護堿基)^(XhoI 保護堿基與酶切位點)GAGCTCCAAAAAAGCAGCTGCAAACATCCGAC TGAAAGCCCATCTGTGGCTTCACAGCTTCCAGTCGAGGATGTTTACAGTGC
[0262] 2)將鏈A和鏈B分別稀釋成60μΜ的母液；
[0263] 3)將鏈Α和Β各取lyL，加入48yL退火buffer(100mM K-acetate，20mM HEPES-K0H pH 7 · 4，2mM Mg-acette)，95°C，4min; 70°C，lOmin，室溫緩慢冷卻20min，4Γ放置20min;
[0264] 4)如前步驟將miR_30a前體連接到pLL3.7載體上，轉化、挑選陽性克隆，測序鑒定；
[0265] 5)若序列正確則可進行下一步的慢病毒制作。三種質粒按照以下比例轉染293T細 胞：8.4yg pLL3.7-miR-30a，14yg pCMV-AR8.9,5.6yg pCMV-VSV-G，36~48小時后收集細 胞上清，用0.22μπι的濾器過濾，即得到用于干擾表達的慢病毒。用與逆轉錄病毒同樣的方法 感染目標細胞，然后以GFP為標記進行流式篩選，所得細胞擴大培養，即可得到miR-30a過表 達穩走細胞系。
[0266] 6.2裸鼠皮下成瘤實驗具體步驟：
[0267] 1)HCT116細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，無血清的培養基洗3遍后，細胞計數后 調整為2.5X107個/mL;
[0268] 2)用lmL注射器吸取細胞液以皮下注射接種，每只裸鼠用200yL細胞液，即5 X106 個細胞/只，每組8只；
[0269] 3)隔兩天用游標卡尺測量腫瘤體積，計算體積公式:V= 1/2 X L X W2(V，Volume;L， Length；ff,Width)；
[0270] 4)處死裸鼠分離腫瘤組織后，稱重。
【主權項】
1. 一種與癌細胞或腫瘤輔助診斷相關的標志物，其特征在于該標志物為miR-30a和HP1 γ中的任意一種或兩種，所述的HP1 γ為HP1 γ基因或/和HP1 γ蛋白；優選的該標志物為 miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的組合。 2. miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一種或兩種作為癌細胞或腫瘤輔助診斷標志物中的應用。3. 權利要求1所述的標志物在制備癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒中的應用。4. 一種用于檢測miR-30a表達水平的試劑盒或生物芯片，其特征在于該試劑盒或生物 芯片中包括用于檢測血液或腫瘤組織中的miR_30a表達水平的特異性引物。5. -種用于檢測ΗΡΙγ蛋白表達水平的試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括用于檢測 血液或腫瘤組織中的ΗΡ1 γ蛋白表達水平的特異性抗體。6. -種癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，其特征在于該試劑盒或生物芯片用 于檢測血液或腫瘤組織中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的雙表達水平。7. 根據權利要求6所述的癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，其特征在于該試 劑盒或生物芯片含有用于檢測miR_30a表達水平和HP1 γ蛋白mRNA的特異性引物和用于檢 測HP1 γ蛋白表達水平的特異性抗體;優選的，該試劑盒中還包括PCR技術常用的試劑和免 疫組化技術常用的試劑。8. -種在癌細胞或腫瘤中高表達的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表達量的抑制物，其特 征在于該抑制物為ΗΡΙγ基因及其蛋白產物的抑制物，優選的該抑制物為包括抗體、化學抑 制物和miRNA抑制物以及類似物中的至少一種;優選的，所述的miRNA抑制物為miR-30a以及 類似物，進一步優選為miR-30a。 9 .miR-30a在制備抑制癌細胞或腫瘤藥物中的應用。10.權利要求1~3、6~9任意一項中所述的癌細胞包括結直腸癌細胞及其他類似的上 皮癌細胞;所述的腫瘤包括腸癌及其他上皮腫瘤;優選的，所述的上皮腫瘤包括肺癌、肝癌、 胃癌、卵巢癌、宮頸癌。
【文檔編號】G01N33/574GK106093400SQ201610463963
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】趙 權, 劉明, 陳玉根, 鞠君毅, 王亞東, 王瑩, 聶敏, 黃菲菲, 李祝臣
【申請人】成都山權江生物科技有限公司