鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚膠體金免疫層析試紙條的制作方法

鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚膠體金免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明涉及食品安全監測領域，具體公開了一種檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚(AME)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結合墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，膠體金結合墊上包被有膠體金?AME單抗復合物，NC膜上設置了檢測線和質控線，檢測線上固定有濃度為1mg/mL的AME?OVA偶聯抗原，質控線上固定有濃度為1mg/mL的羊抗鼠二抗。本發明為采用一步間接競爭免疫層析試紙條技術快速定性或半定量檢測果蔬樣本中鏈格孢毒素AME含量的膠體金試紙條，檢測靈敏度達到10ng/mL，并且檢測專一性強，操作簡單，經濟實用，適合于現場檢測，可廣泛應用于果蔬大批量樣本中AME的分析檢測及快速篩查。
【專利說明】
鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚膠體金免疫層析試紙條
技術領域
[0001] 本發明屬于食品安全領域中涉及免疫膠體金試紙條和真菌毒素殘留檢測的領域。 具體而言，本發明涉及一種適用于檢測果蔬中鏈格孢毒素一一鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)殘留 的膠體金免疫層析試紙條。
【背景技術】
[0002] 鏈格孢霉菌屬于絲狀真菌，是一種普遍存在于水果、蔬菜等食品中的病原體和腐 生菌，它可以在低溫潮濕的環境下生長繁殖，因此是導致冷藏或長途運輸過程中水果、蔬菜 等食品腐爛變質的主要微生物。鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)是鏈格孢霉菌的主要次生代謝產物 之一，由于它具有誘變性、基因毒性、致癌性，能夠誘導單鏈DNA和雙鏈DNA的斷裂，并且還被 鑒定為拓樸異構酶I和Π 強有力的抑制劑，攝取鏈格孢毒素侵染的食品會對人體健康造成 嚴重危害。因此，ΑΜΕ成為目前國內外科學家研究較多的主要的鏈格孢毒素之一。
[0003] 但到目前為止，國內外現行的食品中真菌毒素的限量標準尚不包括鏈格孢毒素， 然而近年來，歐盟已經就食品與飼料中鏈格孢毒素對人畜的健康風險發布了科學意見，并 且在國際貿易中，商家委托第三方檢測鏈格孢毒素的現象已經十分普遍，其檢測主要采用 實驗室中的氣相色譜(GC)、氣質聯用(GC-MS)、液相色譜(IX)、液質聯用(LC-MS)等傳統檢測 方法。然而，這些傳統的檢測方法通常需要大型、昂貴的儀器設備以及專業的技術人員，并 且檢測只能在實驗室中進行，檢測時間長，費時費力，不能滿足當前食品安全領域所追求的 實時、快速、便攜式檢測的需求。
[0004] 針對鏈格孢毒素 ΑΜΕ傳統檢測方法的不足，我們設計了一種可用于檢測水果、蔬菜 等食品中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的膠體金免疫層析試紙方法，該方法具有快速、操作簡單、高特異 性、高靈敏性、檢測成本低、不需要檢測儀器，并且特別適用于現場大量樣本的實時、快速抽 樣檢測，能夠更好地輔助我國食品企業及政府職能監管部門等開展相關的檢測工作。

【發明內容】

[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種采用一步法間接競 爭免疫層析試紙條技術快速檢測果蔬樣本中鏈格孢毒素 ΑΜΕ殘留的膠體金試紙條，鏈格孢 毒素 ΑΜΕ的檢測靈敏度可達10ng/mL。
[0006] 為了實現本發明的發明目的，本發明提供了一種檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚 (ΑΜΕ)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結合墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，所述NC膜粘 附在PVC底板上，膠體金結合墊和吸水墊分別粘附在NC膜的兩端，樣品墊粘附在膠體金結合 墊的另一端;膠體金結合墊上包被有膠體金-ΑΜΕ單抗復合物。
[0007] 進一步地，所述膠體金-ΑΜΕ單抗復合物的制備方法如下：用還原劑將氯金酸還原 成膠體金納米顆粒;將膠體金與ΑΜΕ單克隆抗體混合孵育30min，加入10 %的BSA溶液使其終 濃度為1 %，反應20min后，加入10 %的PEG20000并使其終濃度為0.2 %，繼續反應20min;離 心純化、濃縮產生膠體金-ΑΜΕ單抗復合物。所述還原劑優選檸檬酸三鈉。
[0008]更進一步地，所述ΑΜΕ單克隆抗體的制備方法如下：
[0009] (1 )ΑΜΕ羧基化衍生物半抗原制備:將10mg的ΑΜΕ，14 · 5mg溴丁酸甲酯和30 · 2mg的碳 酸鉀溶于lmL的甲酰胺(DMF)溶液，50 °C磁力攪拌反應2h;待反應混合物冷卻后，加入2mL水 稀釋，隨后用酒精進行萃取得到沉淀中間產物（15mg);將沉淀溶于0.5mL甲醇和0.5mL四氫 呋喃（THF)混合液，隨后加入到含有1.8mg氫氧化鋰的水溶液(0 . lmL)中，室溫條件下反應 5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原(40mg);
[0010] (2)AME-BSA抗原制備:將15.8mg ΑΜΕ半抗原溶于1.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 中；加入13.7mg二環己基碳二亞胺(DCC)，攪拌30min;加入7.6mg N-羥基琥泊酰亞胺(NHS)， 室溫避光磁力攪拌3.5h;離心，除去沉淀物N，f -二環已基脲;將上清液逐滴加到由磷酸緩 沖液(0.謂，？!17.4)配制的854溶液中，室溫避光攪拌211;用0.1111 〇1/1的1^5溶液透析3(1，每 天換液3次，即得AME-BSA抗原;分裝后，保存于-20°C冰箱中備用；
[0011] (3)抗體篩選與純化：
[0012] (a)動物免疫:利用AME-BSA抗原對8-10周齡的Balb/c小鼠進行四次間隔免疫，在 第四次免疫之后進行一次加強免疫，以激活體內的淋巴細胞，產生ΑΜΕ高親和性單克隆抗 體；（b)細胞融合及克隆:將產生ΑΜΕ高親和性單克隆抗體的Balb/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤 細胞SP2/0按照8:1的比例進行細胞融合，并利用間接競爭ELI SA方法測定細胞上清液，篩選 陽性孔;利用有限稀釋法將得到的陽性細胞在檢測后的2天內進行亞克隆，得到能夠穩定分 泌ΑΜΕ單克隆抗體的雜交瘤細胞；（c)單克隆抗體的腹水制備及純化：利用液體石蠟致敏 Balb/c小鼠，并將步驟（2)得到的雜交瘤細胞株用1640培養基進行清洗，并注射于小鼠腹 腔;將采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化。
[0013]作為優選，所述膠體金的納米顆粒大小為13~40nm，更優選為18nm。
[0014] 作為優選，所述ΑΜΕ單克隆抗體與膠體金的最佳結合量為7.2yg/mL。
[0015] 作為優選，所述ΑΜΕ單克隆抗體與膠體金的最佳結合pH值為8.0。
[0016] 進一步地，所述NC膜上設置了檢測線和質控線;檢測線和質控線的間距為5mm。其 中所述NC膜優選Mi 11 ipore 135膜。
[0017]其中，所述檢測線上固定有AME-0VA偶聯抗原，濃度為lmg/mL。所述質控線上固定 有羊抗鼠二抗，濃度為lmg/mL。
[0018] 所述AME-0VA偶聯抗原的偶聯方法可采用本領域常規偶聯方法。
[0019] 作為優選，本發明提供一個較佳的包被原合成方法，具體過程如下：
[0020] (a)稱取前述ΑΜΕ半抗原9.2mg，EDC 7.4mg，加入到2mL DMF溶液中，使之充分溶解， 室溫磁力攪拌反應20min，稱為A液；
[0021] (b)稱取卵清白蛋白（0VA)60mg溶解于7mL PBS緩沖液中，稱為B液。
[0022] (c)將A液逐滴滴加到B液中，密封避光4°C條件下，磁力攪拌過夜。
[0023] (d)將上述反應液轉移至預處理后的透析袋中，4°C層析柜中，用0.05mol/L PBS緩 沖液透析3d，其中，前24h每8h換液1次。透析完成后即得0VA-AME包被原。將透析后的產物進 行分裝，放置于_20°C冰箱中保存備用。
[0024]需要說明的是，本領域技術人員在上述合成方法的基礎上，對各物質用量進行等 比例增大或縮小，均在本發明的保護范圍之內。
[0025]所述膠體金結合墊為玻璃纖維素膜，所述膠體金的納米顆粒大小為13~40nm，優 選18nm〇
[0026]所述樣品墊優選為玻璃纖維素膜。
[0027]所述吸水墊優選為濾紙纖維。
[0028]進一步地，所述試紙條的寬度為4~5mm。
[0029] 作為優選，所述吸水墊壓住NC膜的一端2mm，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗 體復合物的膠體金結合墊壓住2mm，樣品墊壓住膠體金結合墊2_。
[0030] 進一步地，所述膠體金免疫層析試紙條的具體制備步驟為：
[0031] (1)樣品墊預處理:將樣品墊放置于預處理緩沖液(0.5g BSA，50yL Tween-20溶于 50mL的磷酸鹽緩沖液）中，并于37°C恒溫水浴箱中孵育30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液 徹底清洗，37 °C烘箱中干燥2h，最后4 °C干燥條件下保存備用。
[0032] (2)膠體金墊預處理:將膠體金結合墊浸泡在預處理緩沖液（lg BSA，1.5g蔗糖和 O.Olg疊氮鈉溶于50mL 10mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）中，并放置于37°(：恒溫水浴箱中孵育 30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液進行徹底清洗，37°C烘箱干燥2h，最后4°C干燥條件下保 存備用；
[0033] (3)將前述ΑΜΕ單克隆抗體與18nm的膠體金納米顆粒孵育形成膠體金-抗體復合 物，并將其噴涂于預處理后的膠體金結合墊，其中每lcm膠體金結合墊噴涂0.0 lmL膠體金-ΑΜΕ抗體偶聯復合物溶液；
[0034] (4)檢測線Τ線制備:將AME-0VA包被原（lmg/mL)按照l.OyL/cm的包被量固定于NC 膜T線預設區域，形成T線；
[0035] (5)質控線C線制備：同樣將羊抗鼠二抗（lmg/mL)按照1.0yL/cm的包被量固定于NC 膜C線預設區域，形成C線；
[0036] (6)試紙條組裝:首先，將固定有抗體的NC膜粘貼在PVC底板上;其次，用吸水墊壓 住NC膜的一端2mm左右，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗體復合物的膠體金結合墊壓 住約2mm左右;最后，樣品墊壓住膠體金結合墊2mm左右。
[0037] 本發明提供了一種利用上述膠體金試紙條檢測鏈格孢毒素 ΑΜΕ的方法，其檢測是 使用一次性吸管吸取70yL左右的待檢樣本溶液滴加于樣品吸收墊上，觀察檢測線和質控線 的顯色結果。
[0038]本發明的有益效果在于：
[0039] 本發明從設計ΑΜΕ半抗原結構出發，制備免疫原和包被原，進而篩選高專一性、高 親和性的ΑΜΕ單克隆抗體，并進一步將其應用于膠體金免疫層析試紙條的制備中。
[0040] 本發明的檢測果蔬中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的膠體金免疫層析試紙條，能夠一步實現檢 測，結果準確，無需洗滌和標準參照，能夠對單個或批量樣本實時快速定性或半定量檢測， 檢測靈敏度高，檢測限達到10ng/mL。所述試紙條對分子結構類似物鏈格孢酚Α0Η無交叉響 應。
[0041] 本發明的檢測果蔬中鏈格孢毒素 ΑΜΕ膠體金免疫層析試紙條，具有制備簡單，價格 便宜，能夠降低因操作繁冗造成的檢測誤差;另外，試劑保存時間長，現場操作簡單方便，可 在現場大批量樣本中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的快速檢測及篩查中發揮重要作用。能夠更好地輔助 我國食品企業及政府職能監管部門等開展相關的檢測工作。
【附圖說明】
[0042] 圖1為本發明所述ΑΜΕ半抗原合成路線圖。
[0043] 圖2為本發明所述ΑΜΕ半抗原核磁共振氫譜圖。
[0044] 圖3為本發明所述ΑΜΕ半抗原LC-MS譜圖。
[0045] 圖4為本發明所述ΑΜΕ膠體金免疫層析試紙條結構示意圖。
[0046] 圖5為本發明所述ΑΜΕ膠體金試紙條檢測結果判定圖。
[0047] 圖6為本發明所述膠體金免疫層析試紙條對ΑΜΕ的檢測結果圖。
[0048] 圖7為本發明所述膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0049] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0050] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0051] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0052] 實施例1ΑΜΕ單克隆抗體的制備
[0053] 1、ΑΜΕ半抗原合成
[0054] 將10mg的ΑΜΕ，14.5mg溴丁酸甲酯和30.2mg的碳酸鉀溶于lmL的甲酰胺(DMF)溶液， 50°C磁力攪拌反應2h;待反應混合物冷卻后，加入2mL水稀釋，隨后用酒精進行萃取得到沉 淀中間產物（15mg);將沉淀溶于0.5mL甲醇和0.5mL四氫呋喃(THF)混合液，隨后加入到含有 1.8mg氫氧化鋰的水溶液（0. lmL)中，室溫條件下反應5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原 HOmghAME羧基化修飾過程以及核磁共振、LC-MS表征譜圖分別見圖1、2、3。
[0055] 2、免疫原的合成
[0056] 本發明所述免疫原為ΑΜΕ半抗原與BSA偶聯得到。具體制備方法:將15.8mg ΑΜΕ半 抗原溶于1.5mL Ν，Ν-二甲基甲酰胺(DMF)中；加入13.7mg二環己基碳二亞胺(DCC)，攪拌 30min;加入7.6mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫避光磁力攪拌3.5h;離心，除去沉淀物N， 二環已基脲;將上清液逐滴加到由磷酸緩沖液(0.1M，pH 7.4)配制的85六溶液中，室溫避 光攪拌2h;透析。用0. lmol/L的roS溶液透析3d，每天換液3次，即得AME-BSA免疫原，分裝后， 保存于_20°C冰箱中備用。
[0057] 3、ΑΜΕ單克隆抗體的制備
[0058] (1)動物免疫
[0059]將合成的AME-BSA免疫原溶于PBS緩沖液(pH 7.0)，然后將免疫原與弗氏佐劑按照 1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。第一次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗，對8-10周齡 Balb/c小鼠進行免疫，在頸背部皮下進行多點注射，免疫注射劑量為200yg次/只。15天后進 行第二次免疫，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上;30天后進行第三次免疫，采用弗氏不 完全佐劑，免疫劑量同上;44天后進行第四次免疫，同樣采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同 上;58天后進行加強免疫，不加佐劑，直接采用AME-BSA進行免疫。免疫Balb/c小鼠的時間見 表1。
[0060] 表1免疫Balb/c小鼠時間表 [0062] (2)細胞融合和克隆
[0063]將能夠穩定產生ΑΜΕ單克隆抗體的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按照 8:1的比例進行混合，隨后離心，棄掉上清，將沉淀的細胞制成糊狀，放置于37°C水浴箱，并 在lmin內加入融合劑聚乙二醇(PEG4000)，輕輕攪拌細胞反應2min，并在隨后的4min內加入 20mL無血清的PEG營養液，lOOOrpm離心10min后棄掉上清。用20mL-50mL完全培養液重懸細 胞，并將其接種于含飼養細胞的96孔細胞培養板，每孔100yL，并將其置于37°C恒溫培養箱 中；待細胞長至96孔細胞培養板底部的1/2~1/3時，利用間接競爭ELISA方法測定細胞上清 液，篩選陽性孔;利用有限稀釋法，將陽性細胞在檢測后的2d內進行亞克隆，直到得到能夠 穩定分泌ΑΜΕ單克隆抗體的雜交瘤細胞株;將此雜交瘤細胞株進行擴大培養和傳代，無限量 的產生ΑΜΕ特異性單克隆抗體。
[0064] (3)單克隆抗體腹水制備及純化
[0065] (1)小鼠致敏:利用液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6-8周后，注射免疫原500μ!7只，10 天后即可制備腹水。
[0066] (2)注射細胞:收集雜交瘤細胞并用1640培養基清洗細胞兩次，取100-150萬細胞 注射于小鼠腹腔，一周后可見小鼠狀態不活躍并且小鼠的腹腔腫大。
[0067] (3)腹水采集:注射細胞一周后，用無菌注射器對腹腔腫大的小鼠采集腹水，每隔 1 d- 2d采集一次，多次反復采集直到小鼠自然死亡。
[0068] (4)腹水純化:用辛酸-飽和硫酸銨法對采集到的腹水進行純化，純化后放入-20°C 冰箱中保存。使用前，需在4°C條件下利用0.01m〇l/L NaCl透析48h，每隔6h-8h換液一次。 [0069] 4、抗體效價的測定
[0070]在酶標板的每個孔中分別包被100yL稀釋到一定濃度的包被原，37 °C孵育2h;清洗 液洗板3次后，每孔加入封閉液100yL，37°C孵育2h;清洗液洗板3次后，每孔分別加入用常規 酶標二抗稀釋液稀釋2000倍的酶標二抗；再加入梯度稀釋的抗體100yL，25 °C避光反應 30min;洗板4-5次后，加入50yL底物液A液，50yL底物液財夜；顯色30min后加入50yL終止液終 止反應；用酶標儀測定吸光度，吸收波長為450/630nm。本發明得到的單克隆抗體的效價可 達到 1:270000。
[0071 ]實施例2AME膠體金免疫層析試紙條的制備 [0072] 2.1膠體金的制備
[0073]取99mL超純水和lmL 1 %的三氯金酸水溶液，混勻后，磁力攪拌加熱煮沸，加入 1.8mL 1 %檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱煮沸。當溶液的顏色由淺黃色變為藍黑色，最后變為 酒紅色后，繼續加熱煮沸lOmin。當制備好的膠體金溶液的溫度降至室溫時，將制備好的膠 體金溶液定容到lOOmL。最后，將制備好的膠體金溶液放于洗凈的玻璃瓶中，并于4°C環境條 件下存放備用。
[0074] 2.2膠體金-ΑΜΕ抗體復合物的制備
[0075] 取制備好的粒徑大小為18nm的膠體金溶液2mL，用0.1Μ K2C03調節其pH到8.0;隨后 逐滴加入200yL濃度為O.1μg/μL的ΑΜΕ單克隆抗體(實施例1所得），室溫條件下磁力攪拌反 應2h;逐滴加入10 %的HSA溶液，使其終濃度為0.5 %，室溫條件下磁力攪拌反應30min;加入 10 %的PEG20000溶液，并使其終濃度為0.2 %，室溫條件下磁力攪拌30min; 12000rpm離心 30min，棄掉上清，留下膠體金沉淀；向沉淀中加入1 %的HSA溶液重懸膠體金，然后12000rpm 離心，重復進行三次后，用膠體金重懸液（0 . 〇25g PEG20000，2.5g蔗糖，0.5g HSA和50yL Tween-20溶于50mL 10mM pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中）重懸沉淀至原體積的1/10。
[0076] 2.3膠體金-ΑΜΕ抗體復合物在膠體金結合墊上的包被
[0077]將膠體金結合墊浸泡在預處理緩沖液（lg BSA，1.5g蔗糖和O.Olg疊氮鈉溶于 50mL10mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）中，并放置于37°(：恒溫水浴箱中孵育3〇1^11;隨后用大量 的磷酸鹽緩沖液進行徹底清洗，37°C烘箱干燥2h，最后4°C干燥條件下保存備用；取上述制 備好的10yL膠體金-ΑΜΕ抗體復合物鋪于膠體金結合墊（lcm長X 0.5cm寬），37 °C烘箱lh后，4 °(：干燥條件下保存備用。
[0078] 2.4樣品墊的制備
[0079] 將樣品墊放置于預處理緩沖液(0.5g BSA，50yL Tween-20溶于50mL的磷酸鹽緩沖 液）中，并于37°C恒溫水浴箱中孵育30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液徹底清洗，37°C烘箱 中干燥2h，最后4°C干燥條件下保存備用。
[0080] 2.5硝酸纖維素膜(NC膜)上檢測線和質控線的制備
[00811 檢測線T線：將AME-0VA包被原（lmg/mL)按照1. OyL/cm的包被量固定于NC膜T線預 設區域，形成T線；
[0082]質控線C線：同樣將羊抗鼠二抗（lmg/mL)按照l.OyL/cm的包被量固定于NC膜C線預 設區域，形成C線；
[0083]質控線與檢測線之間的距離約為5mm，37°C放置2h進行干燥固定。為了防止NC膜的 非特異性吸附，我們對干燥后的固定有包被原和二抗的NC膜進行封閉：將固定有包被原和 二抗的NC膜浸入到NC膜封閉液（1.2g HSA，0.2g脫脂奶粉和120yL Tween-20溶于40mL Tris-HCl緩沖液）中，并放于37°C恒溫箱中維持30min。隨后用大量的1?緩沖液對其進行徹 底清洗后，室溫條件下干燥，最后4°C干燥條件下存放備用。
[0084] 2.6試紙條的組裝
[0085]首先，將固定有抗體的NC膜粘貼在PVC底板上;其次，用吸水墊壓住NC膜的一端2mm 左右，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗體復合物的膠體金結合墊壓住約2mm左右；最 后，樣品墊壓住膠體金結合墊2_左右。膠體金免疫層析試紙條剖面結構示意圖見圖4。
[0086]實施例3AME膠體金免疫層析試紙條檢測原理
[0087] 1、檢測方法:用一次性吸管吸取待檢樣本，滴加到3-4滴(約70yL)于樣品墊上。
[0088] 2、結果判斷：
[0089] 膠體金試紙條檢測結果判定見圖5。
[0090] 陽性:Τ線不顯色，C線顯色，表示樣本中ΑΜΕ的濃度高于檢測限，檢測結果為陽性；
[0091] 陰性:Τ線和C線都顯色，表示樣本中ΑΜΕ的濃度低于檢測限，檢測結果為陰性；
[0092] 無效:C線不顯色，表示該試紙條已經變質失效，檢測結果無效。
[0093]實施例4本發明膠體金免疫層析試紙條對ΑΜΕ的檢測
[0094]以ΑΜΕ標準品為檢測對象，用1?緩沖液依次稀釋ΑΜΕ標準品，使其濃度分別為50ng/ mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0 · lng/mL、0ng/mL〇分別取70yL上 述ΑΜΕ標準品，分別滴加到制備的膠體金免疫層析試紙條上進行檢測，5-10min后觀察顯色 結果（圖6)。
[0095] 從結果中可以看出，當ΑΜΕ濃度小于10ng/mL時，隨著ΑΜΕ標準品濃度的降低，檢測 線上紅色強度增加；當ΑΜΕ濃度大于10ng/mL時，檢測線不顯色。
[0096] 上述結果表明，該試紙條的檢測限為10ng/mL。
[0097]實施例5本發明膠體金試紙條的特異性試驗
[0098]由于鏈格孢酚A0H和ΑΜΕ具有相似的結構，因此，本發明利用A0H進一步考察此膠體 金試紙條的檢測特異性。以Α0Η標準品為檢測對象，用ΡΒ緩沖液依次稀釋Α0Η標準品，使其濃 度分別 400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、Ong/mL。依次取 70yL 上述 Α0Η 標準品溶液， 分別滴加到制備的膠體金免疫層析試紙條上進行檢測，5-10min后觀察顯色結果(圖7)。
[0099] 結果顯示為：當 A0H 的濃度分別為400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 時，檢測線和質控線均顯色，檢測結果均為陰性，可以得出本發明的膠體金免疫層析試紙條 具有高的檢測專一性，無交叉反應。
[0100] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結合 墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，其特征在于，膠體金結合墊上包被有膠體金-ΑΜΕ單抗復合物。2. 根據權利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于，NC膜上設置了檢測線和質控線； 所述檢測線上固定有ΑΜΕ-OVA偶聯抗原，濃度為lmg/mL。3. 根據權利要求2所述膠體金試紙條，其特征在于，所述質控線上固定有羊抗鼠二抗， 濃度為lmg/mL。4. 根據權利要求1~3任一項所述膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金-ΑΜΕ單抗復 合物的制備方法如下：用還原劑將氯金酸還原成膠體金納米顆粒;將膠體金與ΑΜΕ單克隆抗 體混合孵育3〇1^11，加入10%的854溶液使其終濃度為1%，反應2〇1^11后，加入10%的 PEG20000并使其終濃度為0.2 %，繼續反應20min;離心純化、濃縮產生膠體金-ΑΜΕ單抗復合 物。5. 根據權利要求4所述膠體金試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體的制備方法如 下： (1) ΑΜΕ羧基化衍生物半抗原制備:將ΑΜΕ，溴丁酸甲酯和碳酸鉀溶于甲酰胺溶液，50°C 磁力攪拌反應2h;待反應混合物冷卻后，加水稀釋，隨后用酒精進行萃取得到沉淀中間產 物;將沉淀溶于甲醇和四氫呋喃混合液，隨后加入到含有氫氧化鋰的水溶液中，室溫條件下 反應5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原； (2) AME-BSA抗原制備:將ΑΜΕ半抗原溶于Ν，Ν-二甲基甲酰胺中；加入二環己基碳二亞胺 攪拌;加入Ν-羥基琥珀酰亞胺，室溫避光磁力攪拌;離心，除去沉淀物Ν，Υ -二環已基脲;將 上清液逐滴加到由磷酸緩沖液配制的BSA溶液中，室溫避光攪拌；用0. lmol/L的roS溶液透 析3d，每天換液3次，即得AME-BSA抗原； (3) 抗體篩選與純化。6. 根據權利要求4所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體與 膠體金的最佳結合量為7.2yg/mL。7. 根據權利要求4所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體與 膠體金的最佳結合pH值為8.0。8. 根據權利要求6或7所述膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金的納米顆 粒大小為13~40nm。9. 根據權利要求8所述膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金的納米顆粒大 小為18nm。10. 根據權利要求1~3或5~7任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述 試紙條的寬度為4~5mm。
【文檔編號】G01N33/531GK106093381SQ201610539564
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】滿燕, 梁剛, 潘立剛, 付海龍
【申請人】北京農業質量標準與檢測技術研究中心