補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法
【專利摘要】本發明公開了一種補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，屬于酶免疫分析技術領域，本發明方法是通過血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗體與反應孔包被的精子抗原相結合后，再與補體C3C結合，形成抗原?抗體?補體C3C免疫復合物，加入抗補體C3C標記酶，反應后加入酶底物液顯色，本發明可以同時檢測血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗體，操作簡單、快速、靈敏、準確、廉價的檢測方法，適用于抗精子總抗體檢測，可以作為不孕不育的重要檢查指標。
【專利說明】
補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法
技術領域
[0001]—種血清中補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，屬于酶免疫分析技術領域。
【背景技術】
[0002]抗精子抗體(AsAb)是一個復雜的病理產物，男女均可罹患，其確切原因尚未完全明了，男性的精子、精漿，對女性來說皆屬特異性抗原，接觸到血液后，男女均可引起免疫反應，產生相應的抗體，阻礙精子與卵子結合，而致不孕，在5-10%的不育男性的血液和精漿中確實存在精子凝集抗體和精子制動抗體。當把這種具有抗精子抗體的血清和精漿與正常精子混合，精子會發生頭對頭、尾對尾或混合凝集現象，或者在補體存在情況下，這種血清和精漿可以使游動的精子停止活動或者在原地顫抖。抗精子抗體的滴度越高，精子發生凝集和停止運動的現象越嚴重。另外，有些人抗精子抗體的滴度不高，所以表面看精子凝集現象并不嚴重，精子活動率也不低，可實際上在精子表面已包裹上一層抗精子抗體，妨礙了精子與卵子的結合。
[0003]正常情況下，女性的血液中是沒有AsAb的，女性生殖道有一系列酶，它們能降解精子的抗原性，使其不能刺激免疫系統發生免疫反應，當這種酶系統缺陷或生殖道被破損時，可使進入的精子保持抗原性，刺激機體產生AsAb。據臨床觀察，AsAb陽性的女性患者，發病之前多有子宮內膜炎、陰道炎、輸卵管炎等生殖系統炎癥，這在輸卵管阻塞不孕癥中尤為多見，這些患者，常有經期、產后惡露未凈、生殖器官異常出血時性交史，此種狀態下性生活，精子、精液很容易與女性的血液接觸，進而“激發”女性免疫系統產生抗體。另據報道，AsAb還與腸道因素及遺傳因素有密切關系，AsAb可使精子在宮頸內凝集或制動，從而引起不孕。
[0004]抗精子抗體(AsAb)主要有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等5種類型，是一個復雜的病理產物，其作用主要表現為精子凝集、精子制動，影響精子的運送，抑制精子穿透宮頸黏液，限制精子與卵透明帶粘附，抑制精子頂體的活性，使精子不易穿透包繞卵細胞的放射冠和透明帶，阻礙精子與卵細胞膜的融合，阻止精子與卵子結合及影響胚胎的存活，導致死胎和流產等。
[0005]檢測血清中抗精子抗體常用ELISA法，該方法采用精子抗原包被酶標板反應孔，血液中抗精子抗體與酶標法反應孔中精子抗原結合，再加入酶標記抗精子抗體，形成抗原-抗體-抗抗體，加入底物顯色來檢測抗精子抗體的存在。目前，國內外應用補體介導的酶聯免疫法檢測IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子總抗體的方法尚無報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種補體參與反應的、可以同時檢測血清中186、18]\1、18八、IgD、IgE型抗精子抗體的酶聯免疫法，簡便、快速、靈敏、準確的檢測抗精子總抗體的方法。
[0007]本發明試劑盒主要由盒體(I)，酶標板(2)中設有反應孔(3)的板條，A試劑瓶(補體C3c溶液)(4)，B試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(5)，C試劑瓶(抗補體C3c標記酶)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺oro試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標板(2)均放在盒體(I)內。
[0008]本發明的原理是采用精子抗原包被酶標板反應孔，加入待檢患者血清，患者血清中IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子抗體與精子抗原結合，加入補體C3G溶液，形成抗原-抗體-補體免疫復合物，再加入抗補體C3e標記酶，該法通過形成抗原-抗體-補體C3e免疫復合物，使補體C3c結合位點多且牢固，而使結合抗補體C3c標記酶多，起到了放大作用，能同時結合IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗體，因此檢測靈敏度、陽性預測值均高于臨床上常用的酶聯免疫法檢測，能檢測到IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子總抗體。
【具體實施方式】
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[0009]下面通過實施例及附圖對本發明做進一步詳細說明。
[0010]實施例1
[0011 ] 一、抗精子抗體酶標板的制備
[0012]將精子抗原用包被液稀釋成1:200倍，加入ΙΟΟμΙ包被微孔反應板的反應孔，加入含I %小牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液350μ1/每孔，室溫封閉2小時，4°C過夜。甩盡孔內液體后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘(市售均可)。
[0013]二、酶標記抗體的制備
[0014](I)將辣根過氧化物酶5mg溶于0.5ml 0.2mol/L pH5.6HAC_NaAc緩沖液中，滴入
0.1mol/L NaKk0.25ml，4°C30分鐘。
[0015](2)加入2.5%乙二醇0.51111，室溫下301^11。
[0016](3)加入抗補體C3g抗體5?10mg，用l.0mmol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調整反應液的pH至9.0左右，4°C過夜(市售均可，補體C3g市售)。
[0017](4)加入NaHB40.Iml混勻，4°C2小時后對0.0lmol/L pH7.4PBS透析，4°C過夜。加入適量中性甘油后小量分裝。
[0018]三、洗滌緩沖液(pH7.4PBS)配置:0.15MKH2PO40.2克，Na2HPO4.12Η202.9克，NaCl8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05%0.5ml加蒸餾水至100ml0
【附圖說明】
[0019]圖1補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體試劑盒示意圖。
[0020]圖2酶標板示意圖。
[0021 ]圖3酶標板條與反應孔示意圖。
[0022]實施例2.
[0023]抗補體C3c標記酶改為補體C3c標記酶，測定中采用精子抗原包被酶標板反應孔，加入待檢患者血清，患者血清中I gG、I gM、I gA、I gD、I gE型抗精子抗體與精子抗原結合，加入補體C3c標記酶，其測定效果等同實施例1。
[0024]下面以實施例1為例，具體實驗過程如下:
[0025]1.樣品處理取待檢患者靜脈血液2ml，待血液凝固后800G離心5min，分離血清待用。
[0026]2.檢測方法使用前，將抗精子抗體檢測試劑盒平衡至室溫，取10μ1血清、陰性、陽性對照加入到酶標板孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入補體C3g溶液50μ1，至37 °C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，加入補體C3g標記酶50μ1，至37 0C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、試劑E各50μ1，至37 °C水浴箱水浴I Omin，加I滴終止液，酶標儀讀取結果。
[0027]3.結果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測OD值:在ELI SA檢測儀上，于490nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
【主權項】
1.一種補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，其特征在于血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗體與反應孔包被的精子抗原相結合，加入補體，形成抗原-抗體-補體免疫復合物，再加抗補體C3e標記酶，反應后加入酶底物液顯色，至37 °C水浴箱水浴1min，加I滴終止液，酶標儀測定Α490Γ?值。2.按照權利要求1所述的一種補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，其特征在于所述的補體為補體C3c溶液。3.按照權利要求1所述的一種補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，其特征在于所述的抗補體C3C標記酶為標記為辣根過氧化物酶的抗補體C3C抗體。4.按照權利要求1所述的一種補體結合的酶聯免疫檢測抗精子抗體方法，其特征在于所述的酶底物液，其中一試劑瓶為鄰苯二胺(Oro)試劑，另一試劑瓶為H2O2。
【文檔編號】G01N33/543GK106093376SQ201610571240
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月29日
【發明人】李立和, 丁弘, 張超
【申請人】天津市寶坻區人民醫院