一種β?興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法

一種β?興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種β?興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法。是首先將量子點與β?興奮劑單克隆抗體偶聯，得到量子點與β?興奮劑單克隆抗體的標記復合物，即為量子點熒光探針；再將該標記復合物作為量子點熒光探針與待測樣品混勻孵育后，利用免疫層析試紙條進行β?興奮劑殘留的檢測。本發明能夠實現對多種β?興奮劑類藥物的同時快速篩查，檢測方法簡便、快捷、結果準確、靈敏度高，可做定性、定量檢測，價格低廉，適用范圍廣，具有很好的推廣應用前景。
【專利說明】
一種β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于食品安全免疫檢測技術領域。更具體地，涉及一種β-興奮劑多殘留的 量子點免疫層析試紙條快速檢測方法。
【背景技術】
[0002] β-興奮劑是一類化學結構和生理功能類似腎上腺素和去腎上腺素的苯乙胺類藥 物。興奮劑在臨床上常用于防治人、畜的支氣管痙攣和哮喘等病癥。大劑量的興奮劑能 影響營養物質在動物體內的重新分配，加快脂肪的分解代謝，增加蛋白質的合成，顯著提高 瘦肉率。因此，β-興奮劑曾被作為飼料添加劑廣泛用于畜牧生產中。但是，β-興奮劑在動物 內臟蓄積嚴重，能通過食物鏈進入人體，使人出現心悸、頭暈、心律失常等癥狀，嚴重時甚至 會導致死亡。我國農業部2002年發布的第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》明 確規定克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯類不得檢出。由于近年來世界各地陸續發 生食用殘留克倫特羅的動物性食品的中毒事件，使得各國均加強了對克倫特羅的監督檢 測，它的非法使用受到了極大的限制，不法分子不得不去尋找新的替代品。萊克多巴胺、沙 丁胺醇等成為克倫特羅最常用替代品，而其他興奮劑如馬布特羅和溴布特羅等在20世紀 90年代后才上市，相對用得較少。
[0003] β-興奮劑殘留的檢測一直是食品安全的重點，目前關于β-興奮劑的多殘留檢測方 法很多，包括氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)、酶聯免疫法 (ELISA)等方法。雖然這些方法靈敏度高、特異性好、精確度高，但是這些方法需要專業實驗 人員、大型實驗儀器和繁瑣的樣品預處理，難以滿足高通量、現場快速檢測的需要，很難適 應許多場合快速檢測的需要。近年來，免疫層析檢測技術因其快速、方便，適用于現場篩查， 被廣泛應用于β-興奮劑類藥物的快速檢測。但是，目前已報道的免疫層析試紙條都只能檢 測一到兩種β-興奮劑藥物，不能同時對多種β-興奮劑進行篩查，而且只能實現定性檢測，很 難對檢測樣品進行定量分析。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種檢測限 低、靈敏度高，能夠實現對多種興奮劑類藥物的同時快速篩查的方法;同時改進免疫層析 系統，獲得靈敏度高、穩定性好、低成本、可用于現場快速篩查測定食品中興奮劑類藥物 的檢測方法。
[0005] 本發明的目的是提供一種β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方 法。
[0006] 本發明另一目的是提供所述方法在檢測β-興奮劑殘留方面的應用。
[0007] 本發明上述目的通過以下技術方案實現： 一種β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，是首先將量子點與β-興 奮劑單克隆抗體偶聯，得到量子點與興奮劑單克隆抗體的標記復合物，即為量子點熒光 探針;再將該標記復合物作為量子點熒光探針與待測樣品混勻孵育后，靜置反應lmin，利用 免疫層析試紙條進行β-興奮劑殘留的檢測。
[0008] 優選地，所述量子點為水溶性羧基量子點。
[0009] 更優選地，所述量子點為水溶性羧基化核殼結構量子點，核殼結構為CdTe/ZnS。
[0010] 優選地，所述β-興奮劑單克隆抗體為β-興奮劑類廣譜性單克隆抗體。
[0011]更優選地，所述β-興奮劑類廣譜性單克隆抗體的制備方法如下： (1)抗原的制備： a. 半抗原的合成 將克倫特羅與戊二酸酐進行酰化反應，使克倫特羅分子結構上的醇羥基酰化成為含有 5個碳的羧基間隔臂，并稱之為β_興奮劑類藥物半抗原；
b. 免疫原的制備 將β-興奮劑類藥物半抗原與卵清蛋白（0VA)偶聯得到免疫原； c. 包被原的制備 將β-興奮劑類藥物半抗原和牛血清白蛋白（BSA)采用混合酸酐法進行偶聯得到包被 原； 上述興奮劑的包被抗原為CL-BSA。
[0012] (2)動物免疫:將上述制備的人工抗原免疫Balb/C小鼠，并采用間接ELISA方法測 定其效價； (3) 細胞融合:采用PEG融合法將能分泌抗體的小鼠脾臟細胞與能無限繁殖的瘤細胞進 行融合； (4) 雜交瘤細胞篩選：用間接ELISA檢測培養液中的特異性抗體，進行效價和抑制率的 測定，篩選出效價高和對藥物抑制強的陽性雜交瘤細胞； (5) 雜交瘤細胞亞克隆及建株:利用有限稀釋法進行亞克隆，如此反復3~4輪，得到能穩 定分泌均一抗體的雜交瘤細胞株； (6 )單克隆抗體制備:采用動物體內誘生單克隆抗體法制備單抗。
[0013] 另外，作為一種優選的可實施方案，所述量子點熒光探針的制備方法如下： 51. 取量子點溶解于磷酸鹽緩沖液中，加入偶聯劑和N-羥基琥珀酰亞胺溶液(NHS)，室 溫攪拌10~30min;所述偶聯劑為1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC); 52. 再加入β-興奮劑單克隆抗體，室溫攪拌反應1~2h; 53. 繼續加入10% BSA溶液封閉反應0.8~1.2h，將反應液以10000~14000r/min離心30 ~50min; S4.離心后去除上清液，用復溶液復溶沉淀，得到量子點與β-興奮劑單克隆抗體的標記 復合物，4 °C避光保存。
[0014] 其中，優選地，步驟S1所述量子點：1-(3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 化0〇4-羥基琥珀酰亞胺溶液(順3)的摩爾濃度比為1:3~6:13~17。
[0015] 更優選地，步驟S1所述量子點：1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC): N-羥基琥珀酰亞胺溶液(NHS )的摩爾濃度比為1:5:15。
[0016] 即量子點和偶聯劑的最佳比例為:n(QDs):n(EDC):n(NHS)= 1:5。
[0017] 優選地，步驟S1所述室溫攪拌15min。
[0018] 優選地，步驟S1所述量子點與步驟S2所述β-興奮劑單克隆抗體摩爾濃度比為1:3 ~6〇
[0019] 更優選地，步驟S1所述量子點:步驟S2所述β-興奮劑單克隆抗體=1:4。
[0020] 更優選地，步驟S2所述室溫攪拌反應1.5h。
[0021] 另外，優選地，步驟S1所述磷酸鹽緩沖液為0.0 lmo 1/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0022] 優選地，所述量子點：磷酸鹽緩沖液：10% BSA溶液的用量的體積比為1:150~170: 15 ~25〇
[0023] 更優選地，所述量子點:磷酸鹽緩沖液：10% BSA溶液的用量的體積比為1:160:20。
[0024]優選地，步驟S3所述封閉反應lh。
[0025] 優選地，步驟S3所述離心為12000r/min離心40min。
[0026] 優選地，步驟S4所述復溶液為0.01mol/L、pH 7.4的Tris-HCl，其中包括0.5%的 Tween-20和0.5%的BSA。
[0027]進一步地，所述免疫層析試紙條包括底板、樣品墊、反應膜、吸水墊，所述樣品墊、 反應膜和吸水墊依次貼附在底板上，所述反應膜上設置有包含β-興奮劑包被抗原的檢測線 和包含羊抗鼠 IgG抗體的質控線，且檢測線位于樣品墊一側，質控線位于吸水墊一側。
[0028]其中，優選地，檢測線上β-興奮劑包被抗原的濃度為0.85mg/mL，所述質控線上羊 抗鼠 I gG抗體的濃度為0 · 8 mg/mL。
[0029] 優選地，所述檢測線和質控線相隔5mm。
[0030] 即作為一種優選的可實施方案，所述檢測線和質控線的制備：以硝酸纖維素膜為 反應膜，將反應膜固定貼附在底板上，將β-興奮劑的包被抗原用包被溶液配制成〇.85mg/ mL，羊抗鼠 IgG抗體（即為羊抗鼠 IgG二抗)用包被溶液配制成0.8 mg/mL，將β-興奮劑包被原 和羊抗鼠 IgG抗體噴涂在反應膜上相應的檢測區和控制區形成檢測線和質控線，檢測線和 質控線相隔5mm，放置于37°C烘箱中干燥2h后備用，其中包被溶液為0.01m 〇l/L、pH 7.4的磷 酸鹽緩沖液(PBS)。
[0031 ]優選地，所述β-興奮劑的包被抗原為CL-BSA。
[0032]另外，優選地，所述底板為PVC。
[0033] 優選地，所述樣品墊為玻璃纖維素膜。
[0034] 優選地，所述吸水墊為普通的吸水紙。
[0035] 優選地，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
[0036] 更優選地，所述試紙條的寬度為4mm，樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的寬度分別為 2.0cm、2.5cm、1.7cm，彼此搭接貼附在PVC底板上;其中，樣品墊與硝酸纖維素膜的重合寬度 為2mm，硝酸纖維素膜與樣品墊的重合寬度為2mm。
[0037] 進一步地，本發明上述的β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方 法，所述檢測可為定性檢測、半定量檢測或定量檢測，具體結果判定方法如下： Α.定性檢測或半定量檢測:采用紫外燈照射反應后的反應膜區域，通過肉眼觀察條帶 發光情況，如果檢測線出現熒光信號，判定該指標為陰性;如果檢測線不出現熒光信號，判 定該指標為陽性;同時，在任一情況，控制線不出現熒光信號則檢測結果無效； Β.定量檢測:配置一系列不同濃度的待測物質的標準曲線，然后利用熒光免疫層析讀 數儀分別進行檢測，通過不同濃度的標準溶液對應的T/C值做標準曲線，再將待測樣品進行 同樣處理，得到相應的T/C值，根據標準曲線得知樣品中待測物質含量。
[0038] 本發明上述方法可對多種β-興奮劑類藥物的同時快速篩查，因此，上述β-興奮劑 多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法在檢測興奮劑殘留方面的應用，也在本發 明的保護范圍之內。
[0039] 優選地，所述應用是指上述β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方 法在同時快速檢測或篩查多種興奮劑殘留方面的應用。
[0040] 其中，優選地，所述多種β-興奮劑為鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特 羅、硫酸異丙腎上腺素或西馬特羅中的任幾種。
[0041] 本發明所用量子點具有特殊的表面效應和尺寸效應，使其具有獨特光化學性質， 如量子成率高、激發波長范圍寬，發射波長窄且對稱，斯托克斯位移大，因此可以采用同一 激發光同時激發不同粒徑的量子點進行多元檢測。量子點的發射波長區間較大，可以跨域 紫外到紅外區間，且發射波長可以根據改變量子點的尺寸大小和化學組成來改變的。量子 點的熒光強度高，穩定性好，熒光壽命長，經過多次激發都不會被光漂白和化學降解，且量 子點有較好的生物相容性，適合作為熒光標記物。
[0042]本發明具有以下有益效果： 本發明提供一種興奮劑多殘留量子點免疫層析試紙條，以及一種興奮劑多殘留的 量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，利用量子點作為熒光探針，與免疫層析技術結合起 來，可實現對多種興奮劑類藥物的同時快速篩查。
[0043]而且，量子點的熒光強度高，穩定性好，熒光壽命長，經過多次激發都不會被光漂 白和化學降解，相比膠體金、有機熒光材料等，可以大大提高靈敏度。
[0044] 另外，本發明操作方便，結果準確，較好的解決了現有的檢測方法只能同時檢測一 到兩種β-興奮劑、穩定性差等問題。
[0045] 本發明能夠實現對多種β_興奮劑類藥物的同時快速篩查，檢測方法簡便、快捷、結 果準確、靈敏度高，可做定性、定量檢測，價格低廉，適用范圍廣，具有很好的推廣應用前景。
【附圖說明】
[0046] 圖1為本發明β-興奮劑多殘留量子點免疫層析試紙條結構示意圖。
[0047] 圖2為本發明β_興奮劑多殘留量子點免疫層析試紙條競爭抑制曲線。
[0048] 圖3為本發明β_興奮劑多殘留量子點免疫層析試紙條免疫反應動力學曲線。
【具體實施方式】
[0049] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試 劑、方法和設備。
[0050] 除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0051 ]實施例1 β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法 一種興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，包括以下步驟： (1) 制備量子點熒光探針:取20yL量子點溶解于3.2mL 0.01mol/L ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖 液中，加入偶聯劑1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、Ν-羥基琥珀酰亞胺溶液，室 溫攪拌15min，再加入50 yg β-興奮劑單克隆抗體，室溫攪拌反應1.5h，繼續加入0.4mL 10% BSA溶液封閉反應lh，將反應溶液以12000r/min離心40min，去除上清液，用復溶液復溶沉 淀，得到量子點與興奮劑單克隆抗體的標記復合物，4°C避光保存； (2) 檢測區和控制區的制備：以硝酸纖維素膜為反應膜，將反應膜固定貼附在底板上， 將β-興奮劑的包被抗原用包被溶液配制成0.85 mg/mL，羊抗鼠用包被溶液配制成0.8 mg/ mL，將β-興奮劑包被抗原和羊抗鼠 IgG二抗噴涂在反應膜上相應的檢測區和控制區，檢測區 和控制區相隔5 mm，放置于37°C烘箱中干燥2 h后備用，其中包被溶液為0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
[0052] (3)在上述底板上依次貼附樣品墊、步驟(2)中的反應膜、吸水墊，且檢測線位于樣 品墊一側，質控線位于吸水墊一側，將試紙板切割成試紙條，將試紙條裝于試紙條卡殼中， 組成免疫層析試紙條； (4)定性或定量檢測:將量子點熒光探針與樣品混勻孵育，靜置反應1 min，吸取加入免 疫層析試紙條的樣品墊上進行檢測； A. 定性檢測或半定量檢測:采用紫外燈照射反應后的反應膜區域，通過肉眼觀察條帶 發光情況，如果檢測線出現熒光信號時判定該指標為陰性，不出現熒光信號時判定該指標 為陽性，在任一情況，控制線不出現熒光信號則檢測結果無效； B. 定量檢測:配置一系列不同濃度的待測物質的標準曲線，然后利用熒光免疫層析讀 數儀分別進行檢測，通過不同濃度的標準溶液對應的T/C值做標準曲線，再將待測未知樣品 進行同樣處理，得到相應的T/C值，根據標準曲線得知樣品中待測物質含量。
[0053]其中，所述的量子點為水溶性羧基化核殼結構量子點，核殼結構為CdTe/ZnS。
[0054] 其中，步驟（1)所述的偶聯劑的量與量子點的摩爾濃度成比例，n(QDs):n(EDC):n (NHS)=l：5：15〇
[0055] 其中，步驟（1)所述的復溶液為0.0 lmo 1 /L、pH7.4的Tr i s-HCl，其中包括0.5% Tween-20和0.5% BSA。
[0056] 其中，所述的底板為PVC，樣品墊為玻璃纖維素膜，吸水紙為普通的吸水紙。
[0057] 其中，所述的試紙條的寬度為4 mm，樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的寬度分別為 2.0、2.5、1.7 cm，彼此搭接貼附在PVC上;其中，樣品墊與硝酸纖維素膜的重合寬度為2 mm， 硝酸纖維素膜與樣品墊的重合寬度為2 mm(如附圖1所示）。
[0058]另外，上述β_興奮劑單克隆抗體為β_興奮劑類廣譜性單克隆抗體，具體制備方法 如下： (1)抗原的制備： a. 半抗原的合成 將克倫特羅與戊二酸酐進行酰化反應，使克倫特羅分子結構上的醇羥基酰化成為含有 5個碳的羧基間隔臂，并稱之為β_興奮劑類藥物半抗原；
b. 免疫原的制備 將β-興奮劑類藥物半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯得到免疫原； c. 包被原的制備 將β-興奮劑類藥物半抗原和牛血清白蛋白（BSA)采用混合酸酐法進行偶聯得到包被 原； 上述興奮劑的包被抗原為CL-BSA。
[0059] (2)動物免疫:將上述制備的人工抗原免疫Balb/C小鼠，并采用間接ELISA方法測 定其效價； (3) 細胞融合:采用PEG融合法將能分泌抗體的小鼠脾臟細胞與能無限繁殖的瘤細胞進 行融合； (4) 雜交瘤細胞篩選：用間接ELISA檢測培養液中的特異性抗體，進行效價和抑制率的 測定，篩選出效價高和對藥物抑制強的陽性雜交瘤細胞； (5) 雜交瘤細胞亞克隆及建株:利用有限稀釋法進行亞克隆，如此反復3~4輪，得到能穩 定分泌均一抗體的雜交瘤細胞株； (6 )單克隆抗體制備:采用動物體內誘生單克隆抗體法制備單抗。
[0060] 本發明上述制備的量子點免疫層析試紙條能夠同時檢測多種β-興奮劑類藥物。
[0061] 實施例2以標準品鹽酸克倫特羅(CL)為例建立量子點免疫層析試紙條的標準曲 線 1、實驗材料 (1 )β-興奮劑類廣譜性單克隆抗體，制備方法同實施例1。
[0062] (2)羊抗鼠 IgG二抗為商業化試劑，購自廣州優抗多生物技術有限公司。
[0063]免疫層析試紙條的制備同實施例1。
[0064] 2、CL標準品溶液的配置，用Tris-HCl配制濃度分別為0、0 · 0156、0 · 0625、0 · 250、 1.00、4.00、16.00和64. Oyg/L的系列標準溶液，用于試紙條檢測。
[0065] 3、試紙條的測定 每個濃度重復檢測3次，10 min后用熒光免疫層析讀數儀讀取試紙條FIT/FIC比值。以 FIT/FIC為縱坐標，以標準品濃度對數為橫坐標，繪制試紙條競爭抑制曲線，計算試紙條50% 競爭抑制率濃度以及確定試紙條檢測線性范圍。
[0066] 4、結果如圖2所示，量子點免疫層析試紙條的標準曲線的檢測線性范圍為（IC20-IC8〇)為0 · 14~2 · 28yg/L，50% 競爭抑制率濃度(IC5Q)為0 · 56yg/L，檢出限（IC1Q)為0 · 06yg/L。
[0067] 實施例3量子點免疫層析試紙條的精密度 1、以CL為例，分別以不同批次的試紙條測試不同CL含量的標準溶液，每個濃度重復檢 測3次，測量3個不同批次，計算出實際檢出值。
[0068] 2、如表1所示，試紙條檢測結果的批間、批內變異系數均小于15%，說明該方法的重 復性良好。
[0069] 表1量子點免疫層析試紙條檢測方法批內、批間變異
實施例4各種β-興奮劑藥物的交叉率 1、以CL的交叉反應率(CR)為100%，測定了 10種結構功能類似的β-興奮劑的交叉反應率 (CR)，如表2所示，分別為：鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CL)、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL)、 馬布特羅（Mabuterol)、溴布特羅（Brombuterol)、西馬特羅（Cimaterol)、氯丙那林（ Clorprenaline)、硫酸異丙腎上腺素 （Isoprenaline sulphate)、萊克多巴胺（ Ractopamine)、鹽酸腎上腺素（L-epinephrine hydrochloride)和重酒石酸去甲腎上腺素 (L-noradrenaline bitartrate)〇
[0070] 2、結果如表2所示，沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、硫酸異丙腎上腺素、西馬特羅 對克倫特羅都有交叉率，說明此方法能夠實現對多種興奮劑的同時快速篩查。
[0071] 表2交叉反應測定結果
實施例5以CL、SAL為例對量子點免疫層析試紙條準確性測定 1、樣品前處理 (1)豬尿的前處理:取澄清透明的尿樣備用，如有沉淀，離心取上清即可。
[0072] (2)豬肉的前處理:采用文獻方法，具體操作步驟如下： 2 g絞碎豬肉加入4mL 0.02mol/L HC1-2.8% NaCl提取液，組織均勻，13000r/min離心 4min，取上清液。再加入4mL 0 · 02mol/L HC1-2 · 8%提取液二次提取，13000r/min離心4min。 兩次上清合并，用氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，13000r/min離心4min，上清液待檢。
[0073] 2、結果如表3所示，所構建的量子點免疫層析試紙條對豬尿的回收率在83.6~ 102.19%之間，豬肉的回收率在64.27~87.98%之間，各個樣品的變異系數均小于15%，說明 該方法有較好的準確性。
[0074]表3樣品添加回收檢測結果(n=3)
實施例6量子點熒光探針的制備條件優化一一量子點和偶聯劑用量比的優化 1、參照實施例1，以不同梯度的量子點和偶聯劑用量比為變量，其他條件同實施例1，進 行量子點熒光探針的制備，再進一步制備所述的免疫層析試紙條，觀察試紙條T線的熒光強 度。
[0075] 2、結果如表4所示，當量子點和偶聯劑用量比的摩爾濃度比為1:3~6時，試紙條的 性能較好，最佳摩爾濃度比為1: 5。
[0076] 表4量子點和偶聯劑用量比的優化
實施例7量子點熒光探針的制備條件優化一一量子點和β_興奮劑單克隆抗體用量比 的優化 1、參照實施例1，以不同梯度的量子點和興奮劑單克隆抗體用量比為變量，其他條件 同實施例1，進行量子點熒光探針的制備，再進一步制備所述的免疫層析試紙條，觀察試紙 條Τ線的熒光強度。
[0077] 2、結果如表5所示，當量子點和β-興奮劑單克隆抗體摩爾濃度比為1:3~6時，試紙 條的性能較好，最佳用量比為1:4。
[0078] 表5量子點和β-興奮劑單克隆抗體用量比的優化
實施例8量子點熒光探針的制備條件優化一一標記緩沖液的優化 1、參照實施例1，以不同標記緩沖液，其他條件同實施例1，進行量子點熒光探針的制 備，再進一步制備所述的免疫層析試紙條，觀察試紙條Τ線的熒光強度。
[0079] 2、結果如表6所示，當標記緩沖液為磷酸鹽緩沖液時，試紙條的性能較好，其中最 佳的標記緩沖液為0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0080] 表6標記緩沖液的優化
實施例9棋盤法優化--QDs-mAbs用量體積和CL-BSA噴涂濃度 1、參照實施例1，通過棋盤滴定實驗確定最優的QDs-mAbs用量體積和CL-BSA噴涂濃度， 選取陰性樣本T、C線顯色正常，陽性樣本(c(CL)=0.5 yg/L)抑制率最高為最優條件。其他條 件同實施例1，再進一步制備所述的免疫層析試紙條進行β-興奮劑的制備。
[0081 ] 2、結果如表7所示，當QDs-mAbs的用量為3 yL，CL-BSA噴涂濃度為0.85 mg/mL時， 試紙條在克倫特羅(CL)的標品濃度為0.5 ng/mL時的抑制率達到54.98 %，且試紙條T、C線 的熒光強度相對較強。
[0082] 表7棋盤滴定優化QDs-mAbs體積和CL-BSA噴涂濃度(η = 3) 實施例10 QDs試紙條免疫反應動力學分析
l、QDs熒光免疫層析試紙條反應時間的確定是試紙條定量檢測的前提。對QDs熒光免疫 層析試紙條T、C線免疫反應動力學曲線進行測定，步驟如下:將50yL陰性質控滴加在試紙條 的加樣孔中，每隔lmin用熒光免疫層析讀數儀讀取試紙條中T、C線的熒光值FI T、FIc及FIt/ FIc值，并追蹤記錄30min。
[0083] 2、結果如圖3所示，在25 min內T、C線的熒光強度FIT、FIC隨著時間延長不斷升高， 25 min后趨于穩定;但FIt/FIc比值在10 min之后就趨于穩定，且隨后10~30 min無明顯變 化，表明FIt/FIc值的定量方法能夠在一定時間內消除免疫反應動力學的差異，縮短判讀時 間。因此，QDs熒光免疫層析試紙條定量檢測時間為10 min。
[0084]實施例11質控線二抗的稀釋倍數的優化 1、參照實施例1，以不同的二抗羊抗鼠的稀釋濃度為變量，其他條件同實施例1，制備所 述的免疫層析試紙條，將T線和C線的顏色進行比較。
[0085] 2、結果顯示，隨著二抗濃度的增加，T線的濃度逐漸增加，當二抗濃度為0.8mg/mL 時，C線與T線顏色一樣深淺。因此，選擇二抗濃度0.8mg/mL作為質控線二抗的最佳濃度。 [0086]表8質控線二抗的濃度優化(n=3)
【主權項】
1. 一種β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其特征在于，是首先 將量子點與β-興奮劑單克隆抗體偶聯，得到量子點與β-興奮劑單克隆抗體的標記復合物， 即為量子點熒光探針;再將該標記復合物作為量子點熒光探針與待測樣品混勻孵育后，利 用免疫層析試紙條進行β-興奮劑殘留的檢測。2. 根據權利要求1所述的β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述量子點為水溶性羧基量子點。3. 根據權利要求1所述的β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述量子點為水溶性羧基化核殼結構量子點，核殼結構為CdTe/ZnS。4. 根據權利要求1所述的β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述β-興奮劑單克隆抗體為β-興奮劑類廣譜性單克隆抗體。5. 根據權利要求1所述的β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述量子點熒光探針的制備方法如下：51. 取量子點溶解于磷酸鹽緩沖液中，加入偶聯劑和Ν-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫攪拌 10~30min;所述偶聯劑為1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；52. 再加入β-興奮劑單克隆抗體，室溫攪拌反應1~2h;53. 繼續加入10% BSA溶液封閉反應lh，將反應液以12000r/min離心40min;54. 離心后去除上清液，用復溶液復溶沉淀，得到量子點與β-興奮劑單克隆抗體的標記 復合物。6. 根據權利要求5所述的β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，步驟S1所述量子點：偶聯劑:Ν-羥基琥珀酰亞胺溶液的摩爾濃度比為1:3~6:13 ~17;步驟S1所述量子點與步驟S2所述β-興奮劑單克隆抗體的摩爾濃度比為1:3~6。7. 根據權利要求5所述的β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，步驟S4所述復溶液為0· 01mol/L、pH 7 ·4的Tris-HCl，其中包括0 · 5%的Tween-20 和0.5%的BSA。8. 根據權利要求1所述的β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述免疫層析試紙條包括底板、樣品墊、反應膜、吸水墊，所述樣品墊、反應膜和 吸水墊依次貼附在底板上，所述反應膜上設置有包含β-興奮劑包被抗原的檢測線和包含羊 抗鼠 IgG抗體的質控線，且檢測線位于樣品墊一側，質控線位于吸水墊一側;其中，所述β-興 奮劑包被抗原為CL-BSA。9. 根據權利要求1所述的β_興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法，其 特征在于，所述檢測可為定性檢測、半定量檢測或定量檢測，具體結果判定方法如下： Α.定性檢測或半定量檢測：采用紫外燈照射反應后的反應膜區域，通過肉眼觀察條帶 發光情況，如果檢測線出現熒光信號，判定該指標為陰性;如果檢測線不出現熒光信號，判 定該指標為陽性;同時，在任一情況，控制線不出現熒光信號則檢測結果無效； Β.定量檢測：配置一系列不同濃度的待測物質的標準曲線，然后利用熒光免疫層析讀 數儀分別進行檢測，通過不同濃度的標準溶液對應的T/C值做標準曲線，再將待測樣品進行 同樣處理，得到相應的T/C值，根據標準曲線得知樣品中待測物質含量。10. 權利要求1~9任一所述β-興奮劑多殘留的量子點免疫層析試紙條快速檢測方法在 檢測β-興奮劑殘留方面的應用。
【文檔編號】G01N33/02GK106093322SQ201610604513
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月28日 公開號201610604513.2, CN 106093322 A, CN 106093322A, CN 201610604513, CN-A-106093322, CN106093322 A, CN106093322A, CN201610604513, CN201610604513.2
【發明人】楊金易, 曾道平, 朱彬
【申請人】廣州萬聯生物科技有限公司