煙草甾醇突變體的篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草甾醇突變體的篩選方法，包括以下步驟：⑴、用甲基磺酸乙酯處理煙草種子，獲得M1代種子；⑵、對M1代種子進行種植，成熟后單株收獲，獲得M2代種子；⑶、配制梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基；⑷、利用步驟⑶梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，培育煙草種子，根據煙草種子的生長發育，獲得煙草種子生長發育對應的含伏立康唑的1/2MS培養基的梯度濃度；⑸、采用步驟⑷梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，來培育M2代種子，根據M2代種子的生長發育狀態，篩選煙草甾醇含量最低和最高的突變體。本發明篩選方法操作簡單、成本低、效率高，可適用于大量突變體和群體單株篩選。
【專利說明】
煙草甾醇突變體的篩選方法
技術領域
[0001] 本發明涉及煙草技術領域，尤其是一種煙草留醇突變體的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 植物留醇是植物性留體化合物，其結構類似于動物性留醇，廣泛存在于植物根、 莖、葉、果實和種子中，其基本結構為環戊氫化菲體系。植物留醇不僅是植物細胞的重要組 成成分，也是一種重要的植物活性成分。研究發現植物留醇不僅參與植物的生長發育調控， 而且通過植物留醇含量的相對變化響應各種生物脅迫和非生物脅迫，如病原體、干旱、鹽 堿、極端溫度、低氧、光照、ΑΒΑ和UV-B等。植物留醇作為信號分子參與逆境脅迫反應，在植物 中發揮重要作用，被譽為"生命的鑰匙"。
[0003] 此外，植物留醇具有重要的藥用價值，對人類生活具有重要意義。目前已經研究證 明植物留醇可以促進膽固醇的異化，抑制膽固醇在肝臟內的生物合成和在腸道內的吸收， 從而預防心血管疾病;膽固醇作為細胞膜的主要成分，參與血液中脂質的運輸;谷留醇等 植物留醇能夠阻斷致癌物誘發癌細胞的形成，因而對大腸癌、皮膚癌、宮頸癌的發生具有一 定程度的抑制作用。植物留醇促進人體內新陳代謝，與腎小管的重吸收作用有關，維持第二 性征。植物留醇在體內能表現出一定的激素活性，但卻無激素的副作用。當人體激素水平高 于正常值時，植物留醇能夠阻礙膽激素吸收的作用，降低人體激素水平；當人體激素水平低 于正常值時，植物留醇會轉化成人體內的激素，提高人體激素水平。
[0004] 目前煙草中已報道植物甾醇主要有膽甾醇，菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇。煙草中 的植物留醇主要存在于細胞膜中，不但能促進煙草生長，而且對煙草安全、品質都有較大的 影響。研究表明，煙草中的留醇是卷煙煙氣致癌物多環芳烴的主要前體物，卷煙煙氣中61% 的苯并[α]芘是由留醇裂解產生的。在卷煙抽吸時約有20%_25%的煙草植物留醇完整的轉 移到主流和側流煙氣中，留醇中的羥基，高溫熱解時會與其母體的四輪環戊烯[α]菲環結構 形成稠環芳經化合物。Stedman的研究表明豆留醇在750 °C下熱解生成苯并[α ]花;Badger表 明，在豆留醇的裂解過程中，發生了留醇骨架的一系列單分子反應后形成了菲，蒽等多環芳 烴。因此，獲得留醇突變體植株對培育高品質、低危害煙草品種以及植物留醇活性物質提取 研究都具有重要意義。但是，目前煙草中留醇的分析方法主要采用定量分析法，該方法樣品 前期需要經過多個工序處理，致使其測定周期較長，步驟繁瑣，不適用于大批量材料的篩 選。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術的不足，提出一種煙草留醇突變體的篩選方法，操作簡便，實 施效果好。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：一種煙草留醇突變體的篩選 方法，包括以下步驟：
[0007] ⑴、用甲基磺酸乙酯處理煙草種子，獲得Ml代種子；
[0008] ⑵、對Ml代種子進行種植，成熟后單株收獲，獲得M2代種子；
[0009] ⑶、配制梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基；
[0010]⑷、利用步驟⑶梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，培育煙草種子，根據煙草 種子的生長發育，獲得煙草種子生長發育對應的含伏立康唑的1/2MS培養基的梯度濃度； [0011] (5)、采用步驟⑷梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，來培育M2代種子，根據M2 代種子的生長發育狀態，篩選煙草留醇含量最低和最高的突變體。
[0012] 優選的，步驟⑴為：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸緩沖液作為溶劑，配置體積濃度為 0.6 %的甲基磺酸乙酯溶液;將煙草種子加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26 °C、11 Orpm的 搖床內，處理16小時。
[0013] 優選的，搖床處理后的種子，用pH 6.5的0.01m〇l/L磷酸緩沖液每隔半小時潤洗一 次，洗3次后用蒸餾水沖洗2h。
[0014] 優選的，步驟⑶包括：
[0015] ①、配制100μΜ伏立康唑溶液；
[0016] ②、1/2MS培養基配制:稱取MS培養基粉末2.37g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，116 。(:高壓滅菌30min備用；
[0017]③、設置梯度濃度:將梯度濃度的伏立康唑溶液分別加入1/2MS培養基中，得到梯 度濃度的伏立康唑的1/2MS培養基。
[0018] 優選的，煙草種子為紅花大金元。
[0019] 優選的，步驟⑶的濃度梯度為0·01μΜ、0·03μΜ、0·1μΜ、0·3μΜ、1μΜ、3μΑ^Ρ10μ Μ0
[0020] 優選的，步驟⑷或步驟(5)中，獲得煙草種子生長發育對應的含伏立康唑的1/2MS培 養基的梯度濃度為:ΙμΜ和3μΜ。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：利用不同濃度伏立康唑的1/2MS培養基探 索紅花大金元對伏立康唑的敏感性，從而篩選出紅花大金元正常生長和生長受到抑制時伏 立康唑的臨界濃度，其次，利用上述臨界濃度，篩選紅花大金元EMS突變體，獲得煙草低甾醇 含量突變體和煙草高留醇含量突變體。該方法能夠對煙葉總留醇物質進行定性檢測，篩選 方法操作簡單、成本低、效率高，可適用于大量突變體和群體單株篩選。
【附圖說明】
[0022] 圖1為留醇抑制劑福利康挫篩選紅花大金元；
[0023] 圖2為留醇抑制劑福利康挫篩選紅花大金元突變體。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖對本發明進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應 對本發明的保護范圍有任何的限制作用。
[0025] -種煙草留醇突變體的篩選方法，包括以下步驟：
[0026] 1)用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（sthyl methyl sulfonate，EMS)處理煙草種子，獲 得Ml代種子；
[0027] 2)對Ml代種子進行種植，成熟后單株收獲，獲得M2代種子；
[0028] 3)制備含不同濃度留醇抑制劑伏立康唑(Voriconazole)的1/2MS培養基。首先，配 制1 ΟΟμΜ伏立康唑溶液:稱取0.0 lg伏立康唑，加入286ml無菌水，混勻，棕色瓶保存備用。其 次，配制1/2MS培養基:稱取MS培養基粉末2.37g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，116 °C高壓滅 菌30min備用。最后，設置梯度濃度:根據實驗要求設計含有不同濃度伏立康唑的梯度1/2MS 培養基。
[0029] 4)利用含0·00μΜ (對照）、〇.〇叫厘、〇.〇34厘、〇.以厘、〇.34厘、以厘、3以厘、1(^厘伏 立康唑的1/2MS培養基，探索不同濃度伏立康唑抑制煙草紅花大金元的生長情況。
[0030] 5)留醇含量的突變體的篩選。利用摸索好的適宜濃度的留醇抑制劑伏立康唑的1/ 2MS培養基從煙草突變體中篩選低留醇含量的突變體。
[0031] 本發明利用篩選出的臨界濃度對EMS誘變的紅花大金元500個M2代家系進行篩選， 獲得高伏立康唑濃度下正常生長的突變體和低伏立康唑濃度下生長受到抑制的突變體材 料。最后參照《衍生化氣相色譜質譜聯用法同時測定煙葉多種植物留醇》定量測定煙草品種 紅花大金元和伏立康唑法篩選獲得的突變體單株中菜油留醇、豆留醇和β谷留醇的含量，以 此驗證伏立康唑法定性篩選留醇突變體的準確性。
[0032]伏利康唑能夠通過抑制細胞色素 Ρ450依賴性14-α-固醇去甲基酶的活性，進而抑 制功能性真菌膜的形成和維持真菌生長的留醇的生物合成，使得細胞膜合成受阻，細胞破 裂死亡。伏立康唑的植物生長調控特性和相關的苯三唑被鑒定具有抑制包括模式生物擬南 芥在內的大多數雙子葉植物和單子葉植物體內留醇生物合成的能力，進而影響植物生長發 育。煙草留醇突變體的篩選和深入研究，有助于深入認識留醇合成代謝途徑的分子機理。通 過篩選留醇合成代謝突變體，高留醇突變體材料可以作為生物反應器提取留醇作為藥物生 產原料;低留醇突變體材料可以用于培育低害煙草品種。
[0033]本發明具體操作步驟如下：
[0034] (1)種子誘變處理：用pH 6.5的O.OlmoVL磷酸緩沖液(Na2HP〇4 · 12H2〇-NaH2P〇4 · H20)作為溶劑，配置濃度為0.6%的EMS溶液(V/V)。將紅花大金元的種子加入EMS溶液中，放 置于26°C、llOrpm的搖床內，誘變處理16小時。處理后種子用pH 6.5的0.01mol/L磷酸緩沖 液每隔半小時潤洗一次，洗3次后用蒸餾水沖洗2h。經EMS誘變獲得的煙草種子即為Ml代種 子。
[0035] (2)突變體種植:Ml代種子播種后移栽大田，單株成熟后收獲M2代種子。
[0036] (3)突變體種子消毒:選取紅花大金元和500份紅花大金元突變體M2代材料，分別 取適量種子，加入無菌水配制的70 %乙醇沖洗30s，再用無菌水洗滌3次，每次lmin。加入無 菌水配制的10 % H2〇2浸泡10min，再用無菌水洗滌5次。
[0037] (4)不同濃度伏立康唑的1/2MS培養基的制備
[0038] 1) 100μΜ伏立康唑溶液配制:稱取0.0 lg伏立康唑，加入286ml無菌水，混勻，棕色瓶 保存備用。
[0039] 2) 1/2MS培養基配制：稱取MS培養基粉末2.37g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，116 °〇高壓滅菌30min備用。
[0040] 3)設置梯度濃度:根據實驗要求設計含有不同濃度伏立康唑的梯度1/2MS培養基。 如下所示：
[0042] (5)適宜的留醇抑制劑伏立康唑濃度篩選:首先檢測煙草烤煙品種紅花大金元在 不同濃度伏立康唑的1/2MS培養基上的生長情況，探索不同濃度伏立康唑抑制紅大生長情 況。
[0043] 將消毒后的煙草紅花大金元種子分別點播于含Ο.ΟΟμΜ (對照）、〇.〇1μΜ、〇.〇3μ Μ、〇 . ΙμΜ、〇 . 3μΜ、ΙμΜ、3μΜ、1〇μΜ伏立康唑的1/2MS培養基上，保鮮膜密封后將培養皿 放置于人工氣候室內，培養條件溫度25°C，45天后用測量尺測量植株大小及根長。結果發 現，烤煙紅花大金元在不同濃度伏立康唑的1/2MS培養基上生長情況如下：與對照（不添加 伏立康唑）相比，在濃度為〇.〇叫厘、〇.〇3以厘、〇.叫厘、〇.3以厘、以厘培養基上，紅花大金元整 個植株正常生長，根長與對照一致;在濃度為3μΜ條件下紅花大金元幼苗和根部生長發育 明顯受到抑制；在濃度為1〇μΜ條件下，幼苗和根部生長受到更強的抑制性。說明留醇抑制 劑伏立康唑影響煙苗的發育，出現矮小表型，而且隨著濃度不斷增大，抑制性逐漸明顯（圖 1)〇
[0044] (6)甾醇突變體的定性篩選
[0045] 初期篩選發現，紅花大金元在含3μΜ伏立康唑濃度下發育受阻，ΙμΜ濃度下正常發 育。因此，選擇含ΙμΜ和3μΜ伏立康唑的1/2MS培養基作為選擇培養基，從煙草突變體中篩選 在ΙμΜ伏立康唑濃度下篩選發育受阻的突變體材料，在3μΜ濃度下篩選生長正常的突變體材 料。將消毒后的500份EMS誘導的紅花大金元突變體M2代單株種子分別點播于適宜濃度的伏 立康唑的1/2MS平板培養基上。每個單株點種30粒，以紅花大金元作為對照，保鮮膜密封后 將培養皿放置于人工氣候室內，培養條件溫度25 °C，45天后，用測量尺測量植株大小及根 長。結果共獲得3份ΙμΜ伏立康唑濃度下發育受阻的突變體MHE00083、MHE00098和MHE00099， 2份發育3μΜ濃度下生長正常的突變體MHE000065和MHE00079(圖2;表1)。
[0046] 表1衍生化氣相色譜質譜聯用法測定伏立康唑篩選的突變體中留醇含量
[0048] (7)煙草突變體中留醇含量定量分析驗證伏立康唑法定性篩選留醇突變體的準確
性
[0049] 對已經獲得的3份ΙμΜ伏立康唑濃度下發育受阻的突變體，2份3μΜ濃度下生長發育 正常的突變體，進一步移栽后打頂工藝成熟期，經對現有技術文獻的檢索發現，參照《衍生 化氣相色譜質譜聯用法同時測定煙葉多種植物留醇》測定突變體中菜油留醇、豆留醇、β谷 甾醇含量。具體方法如下：將ΙμΜ伏立康唑濃度下生長抑制的突變體和3μΜ濃度下生長正常 的突變體植株以及對照紅花大金元植株移栽至假植盤中，約1個月后移植到大田。打頂后工 藝成熟期取中部3片煙葉，將鮮煙葉樣品帶回實驗室，去主脈，放入DHG-9240A電熱恒溫鼓風 干燥箱105 °C殺青lOmin，然后在60 °C條件下烘干。煙葉切絲后40 °C干燥處理8h，粉碎后混勻 過40目篩。準確稱取5. OOOOg煙末(精確至0.000lg)，用100mL丙酮超聲提取30min，抽提液低 壓蒸干，加入25mL 1 % (V/V)的硫酸乙醇溶液，75 °C攪拌水解4h，冷卻至室溫，加入50mL 2.0mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，80 °C皂化60min，冷卻至室溫，加入35mL飽和氯化鈉水溶液，用 正己燒萃取3次，合并萃取液，用飽和氯化鈉溶液洗滌至中性，加入10g無水硫酸鈉，干燥過 夜。將濾液濃縮蒸干，加入8mL無水吡啶，再加入500yL 6-酮膽留燒醇（內標），置于10mL衍生 化試管中，依次加入〇.4mL六甲基二硅胺烷和0.2mL三甲基氯硅烷，常溫振蕩lmin，靜置 10min，離心5min(3000r/min)，取上清液，過0.22μηι有機相微濾膜，取濾液立即進行GC/MS分 析。氣相色譜條件：色譜柱-[HP-5MS(60m X 0.25mmX 0.25μπι)];進樣量2. OyL，分流比10:1; 進樣口溫度280°C ;載氣-He;流速2. OmL/min;程序升溫180°C下保持lOmin，然后以35°C/min 的速率升至275°C，保持42min。質譜條件:離子源溫度230°C ;四極桿溫度150°C ; EI源；電離 電壓70eV;輔助加熱區280°C;采集模式-全掃描（Scan)與選擇離子檢測（SHO同時采集。結 果發現，紅花大金元中菜油甾醇、豆甾醇和β谷甾醇總含量為758.05mg/kg，而突變體 MHE00083、MHE00098 和 MHE00099 三種甾醇總含量分別為 475.4311^/1^、414.7111^/1^和 359.09mg/kg，突變體MHE000865和MHE00079中三種甾醇總含量分別為1074.80mg/kg和 1201.35mg/kg(表DjyM濃度下生長正常的突變體單株三種甾醇總含量遠遠大于ΙμΜ伏立 康唑濃度下發育受阻的突變體單株三種留醇總含量。該結果說明利用抑制劑伏立康唑能夠 有效的篩選留醇含量突變體。
[0050] 本發明優點：煙草中常見留醇的分析方法有衍生化氣相色譜法、高效液相色譜法、 超臨界流體色譜法和氣相色譜質譜聯用法等。這些植物留醇定量分析的方法需經過樣品處 理，（煙苗移植到大田長至成株時期采樣、烘干、研磨)萃取分離，純化富集，定量檢測等分析 步驟。這些方法測定周期長，步驟繁瑣，不適用于大批量材料的篩選。本次報道了一種簡易 的定性篩選煙草留醇含量突變體的方法，并利用標準的GC/MS定量測定留醇的方法對篩選 結果進行了驗證分析，該方法能夠對煙葉總留醇物質進行定性檢測，篩選方法操作簡單、成 本低、效率高，可適用于大量突變體和群體單株篩選。
[0051] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種煙草留醇突變體的篩選方法，包括以下步驟： ⑴、用甲基磺酸乙酯處理煙草種子，獲得Ml代種子； ⑵、對Ml代種子進行種植，成熟后單株收獲，獲得M2代種子； (3)、配制梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基； ⑷、利用步驟⑶梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，培育煙草種子，根據煙草種子 的生長發育，獲得煙草種子生長發育對應的含伏立康唑的1/2MS培養基的梯度濃度； (5)、采用步驟⑷梯度濃度的含伏立康唑的1/2MS培養基，來培育M2代種子，根據M2代種 子的生長發育狀態，篩選煙草留醇含量最低和最高的突變體。2. 如權利要求1所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于:步驟⑴為：用pH 6.5的 0.0 lmol/L磷酸緩沖液作為溶劑，配置體積濃度為0.6 %的甲基磺酸乙酯溶液;將煙草種子 加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26°C、110rpm的搖床內，處理16小時。3. 如權利要求2所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于:搖床處理后的種子，用 pH 6.5的0.0 lmol/L磷酸緩沖液每隔半小時潤洗一次，洗3次后用蒸餾水沖洗2h。4. 如權利要求1所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于:步驟⑶包括： ① 、配制100μΜ伏立康唑溶液； ② 、1/2MS培養基配制:稱取MS培養基粉末2.37g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，116°C高 壓滅菌30min備用； ③ 、設置梯度濃度:將梯度濃度的伏立康唑溶液分別加入1/2MS培養基中，得到梯度濃 度的伏立康唑的1 /2MS培養基。5. 如權利要求1所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于：煙草種子為紅花大金 J L· 〇6. 如權利要求5所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于：步驟⑶的濃度梯度為 0·01μΜ、0·03μΜ、0·1μΜ、0·3μΜ、ΙμΜ、3μΜ和ΙΟμΜ。7. 如權利要求6所述煙草留醇突變體的篩選方法，其特征在于:步驟⑷或步驟(5)中，獲 得煙草種子生長發育對應的含伏立康唑的1/2MS培養基的梯度濃度為:1μΜ和3μΜ。
【文檔編號】G01N30/02GK106093303SQ201610403706
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】陳明麗, 龔達平, 劉貫山
【申請人】中國農業科學院煙草研究所