土壤中不同有機組分的連續提取方法

土壤中不同有機組分的連續提取方法
【專利摘要】本發明屬于農業生產技術領域，公開了一種土壤中不同有機質組分的連續提取方法，包括顆粒有機質(POM)、顆粒態黑炭(POM?BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取態球囊霉素相關蛋白(EE?GRSP)、難提取態球囊霉素相關蛋白(HE?GRSP)、檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質(EE?DOC)、檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質(HE?DOC)、殘余態有機質(Residual)以及結合態黑炭(B?BC)的連續提取。主要步驟如下：(1)土壤樣品的采集與預處理；(2)試劑的配置；(3)不同有機組分的連續提取；(4)提取出有機組分碳含量的測定；(5)不同有機組分碳含量的計算。本發明將不同的有機組分連續提取與分離出來，克服了傳統方法每次只能提取一種有機組分以及提取出不同有機組分之間物質重疊的問題，同時提高了土壤中有機質的提取率。
【專利說明】
土壤中不同有機組分的連續提取方法
技術領域
[0001]本發明屬于農業生產技術領域中一套土壤有機質組分的分離提取方法。具體的說就是一套將土壤有機質的不同組分，顆粒有機質(Ρ0Μ)、顆粒態黑炭(P0M-BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取態球囊霉素相關蛋白(EE-GRSP)、難提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)、檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質(EE-DOC)、檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質(HE-D0C)、殘余態有機質(Residual)以及結合態黑炭(B-BC)，通過連續提取將其分離，并測定不同組分碳含量的方法。
技術背景
[0002]土壤有機質(SOM)是土壤的重要組成物質，對改善土壤物理化學性質以及植物的生長起著重要的作用，同時也是全球碳循環的一個重要因素，在環境保護、農業可持續發展等方面有著重要的意義。通過物理和化學分離手段可以將土壤有機組分分為顆粒有機質、富啡酸、胡敏酸、胡敏素、土壤球囊霉素相關蛋白以及黑炭。
[0003]顆粒有機質由大量來至植物根部的新鮮植物殘體組成，這是植物殘體分解最先形成的碳庫，也是土壤系統中能量與營養的來源。顆粒有機質的提取方法是在加入高密度的碘化鈉或多鎢酸鈉溶液，利用物理方法將其懸浮和土壤分離。胡敏酸和富啡酸是土壤動植物殘體被微生物分解的副產品。利用氫氧化鈉和焦磷酸鈉溶液對土壤進行提取后，提取液用稀硫酸酸化進行沉淀，發生沉淀的物質是胡敏酸，溶液中未沉淀的物質是富啡酸。球囊霉素相關蛋白是由叢植菌根真菌產生的一種糖蛋白。利用檸檬酸鈉溶液在提取溫度為121°C的條件下將其提取，然后用鹽酸溶液調節PH值到2.1使其沉淀，得到的沉淀物就是球囊霉素相關蛋白，溶液中沒有沉淀的物質是檸檬酸鈉可提取態可溶性有機質。土壤中黑炭的提取是利用鹽酸和氫氟酸反復處理樣品，充分去除土壤中的碳酸鹽和硅酸鹽，最后使用重鉻酸鉀和硫酸混合溶液處理，最后的殘余物質就是黑炭。土壤胡敏素是既不溶于酸又不溶于水的腐殖物質組分，將土壤用氫氧化鈉和焦磷酸鈉混合液反復浸提除去其中的胡敏酸和富啡酸，剩余的殘渣就是胡敏素。
[0004]現有的通過用不同提取劑將土壤有機質的不同組分分離提取出來的傳統方法只能分離或提取土壤有機質中的一種或幾種組分，不能完全將所有的已知土壤有機質組分分離出來。因此，設計一套能夠將已知的所有土壤有機質組分進行系統、連續提取和分離的方法，對于土壤有機質的研究是一項基礎性的工作，有非常重要的意義。

【發明內容】

[0005]本發明針對傳統土壤有機質組分的提取與分離的方法只能提取與分離部分土壤有機質組分的問題，設計出一種土壤中不同有機組分的連續提取方法，即連續分離土壤有機質的物理與化學組分的方法。
[0006]本發明所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法的連續提取步驟為:
[0007]—、土壤樣品的采集與預處理；
[0008]二、試劑的配制；
[0009]三、不同有機組分的連續提取；
[0010]所述不同有機組分的連續提取包括如下步驟:
[0011]a.游離態顆粒有機質和游離態黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時，5600轉離心20分;這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止;懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率<50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提取；測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0012]b.閉蓄態顆粒有機質和閉蓄態黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450 J/ml的超聲波處理I小時，溫度控制在40 °C以下，5600轉離心20分；這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止；懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率〈50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0013]c.顆粒態黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重絡酸鉀的濃度為0.lmol/L，硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55土I °C的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是P0M-BC;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[OOM] d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.lmol/L的焦磷酸鈉和0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮氣5分鐘，震蕩12小時;4500轉離心10分鐘，上清液轉入10ml容量瓶中，這一步驟重復3-5次，直到上清液無色為止，定容，此時容量瓶中收集的物質為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取；
[0015]e.易提取態球囊霉素相關蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到三角瓶中，參與物質用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容;濾紙上的固態物質便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測定碳含量對試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測定碳含量；
[0016]f.難提取態球囊霉素相關蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質HE-D0C的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復5次熱抽提，個別含量很高的土壤需要增加次數;殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將PH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態物質便是難提取態球囊霉素相關蛋白，再用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0017]g.殘余態有機組分Residual和結合態黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風干品均分成兩份，其中一份用于殘余態有機組分的測定;另一份轉入離心管中，加入6ml濃度為3moI/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去碳酸鹽，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應24小時，除去硅酸鹽;5000轉離心10分鐘，倒掉上清液；加入6ml濃度為10mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去可能生成的氟化鈣，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是B-BC;將黑炭樣品用去離子水沖洗轉入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干；
[0018]四、步驟三提取出的有機組分碳含量的測定；
[0019]五、步驟三提取出的有機組分碳含量的計算。
[0020]本發明的優點是:通過對同一土壤樣品按照一定順序行連續提取，對每種提取方式獲得的有機質樣品分別進行處理，獲得多個理化性質不同的土壤有機組分樣品。本發明的將同一個土壤樣品中一系列的有機組分連續分提取，各組分之間不存在重疊。本發明采用的提取順序中，胡敏酸與富啡酸在球囊霉相關蛋白之前提取，避免了提取球囊霉素相關蛋白時，在高溫、偏堿性的環境中將大量胡敏酸和富啡酸提取出來，造成胡敏酸和球囊霉素相關蛋白之間的大量的重疊。本發明采用多步連續提取的方法提取有機組分，使得有機組分的提取率遠高于單獨提取各種有機組分的提取率。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明的提取流程圖。
[0022]圖2是本發明連續提取法與傳統提取法提取有機組份之一的對照表。
[0023]圖3是本發明連續提取法與傳統提取法提取有機組份之二的對照表。
[0024]圖4是本發明連續提取法與傳統提取法提取效率的對照表。
【具體實施方式】
[0025]現給合具體實施倒對本發明作進一步的說明。
[0026]本發明所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法的連續提取步驟為:
[0027]一、土壤樣品的采集與預處理:
[0028]采樣地點:采樣點1-天然次生林(記為N;經瑋度:109°11.873’E 19。5.618，N;海拔:1145m);采樣點點2-—代橡膠林(記為FG;經瑋度:109° 3.587‘E 19° 8.784 ’ N;海拔:133m);采樣點3-二代橡膠林(記為SG;經瑋度:109° 24.275E 19° 28.555’N;海拔 125M)。
[0029]樣品采集0-20cm土層(記為a層)和20-40cm土層(記為b層)；每個采樣點采集3個重復。樣品編號記為:N-1-a，N_2_a ； N_3_a ； N_l_b ； N_2_b ； N_3_b ； FG-1-a ； FG-2—a ； FG-3—a ； FG-
1-b ； FG-2-b ;FG-3-b ； SG-1-a ； SG_2_a ； SG_3_a ； SG_l_b ； SG_2_b ； SG_3_b。編號說明:例如N-1-a表示天然次生林-第一個采樣點-20_40cm 土層。
[0030]采集的土壤樣品風干后過0.25mm篩。
[0031]二、試劑的配制:
[0032]所述的試劑的配制方法為:
[0033](I)碘化鈉溶液，密度為1.7g/cm3:將1200g碘化鈉溶于水中，用IL的容量瓶定容；
[0034](2)氯化鈣溶液，濃度為0.01mol/L;
[0035](3)焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液:焦磷酸鈉和氫氧化鈉的濃度均為0.lmol/L;
[0036](4)硫酸溶液，濃度約為3mo 1/L:量取163ml濃硫酸定容到IL;
[0037](5)硫酸溶液，濃度為0.02mo 1/L:吸取將溶液(4)66.7ml，定容到IL;
[0038](6)氫氧化鈉溶液，濃度為0.02mol/L；
[0039 ] (7)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.02mo 1/L，pH值為7;
[0040](8)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.05mol/L，pH值為8;
[0041 ] (9)鹽酸溶液，濃度為0.lmol/L:吸取8.33ml濃鹽酸，定容到IL;
[0042](10)鹽酸溶液，濃度為3mol/L:量取125ml濃鹽酸，定容到500ml;
[0043](11)氫氟酸溶液，濃度為1mo 1/L:用塑料量筒量取150ml純氫氟酸，用500ml塑料容量瓶定容；
[0044](12)鹽酸溶液，濃度為10mol/L:量取417ml濃鹽酸，定容到500ml;
[0045](13)重鉻酸鉀和硫酸的混合液:重鉻酸鉀濃度為0.lmol/L，硫酸濃度為2mol/L;
[0046](14)重鉻酸鉀標準液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:將重鉻酸鉀試劑在烘箱中，105°C條件下烘干3小時，取出后在干燥器中冷卻8小時，冷卻后稱取39.225g，在水中加熱溶解，冷卻后用水定容至1L;
[0047](15)硫酸亞鐵溶液，FeSO4,0.2mol/L: 56.0g硫酸亞鐵，FeSO4'7H20，化學純，溶于水，加入15ml濃硫酸，用水定容至IL;
[0048](16)鄰啡羅啉試劑:1.485g鄰啡羅啉試及0.695g硫酸亞鐵溶于10ml水，在棕色瓶中保存。
[0049]三、不同有機組分的連續提取；
[0050]所述不同有機組分的連續提取包括如下步驟:
[0051]a.游離態顆粒有機質和游離態黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時，5600轉離心20分;這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止;懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率<50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提取；測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0052]b.閉蓄態顆粒有機質和閉蓄態黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450 J/ml的超聲波處理I小時，溫度控制在40 °C以下，5600轉離心20分；這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止；懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率〈50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0053]c.顆粒態黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重絡酸鉀的濃度為0.lmol/L，硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55土
I°C的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是P0M-BC;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0054]d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.lmol/L的焦磷酸鈉和
0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮氣5分鐘，震蕩12小時;4500轉離心10分鐘，上清液轉入10ml容量瓶中，這一步驟重復3-5次，直到上清液無色為止，定容，此時容量瓶中收集的物質為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取；
[0055]e.易提取態球囊霉素相關蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到三角瓶中，參與物質用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容;濾紙上的固態物質便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測定碳含量對試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測定碳含量；
[0056]f.難提取態球囊霉素相關蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質HE-D0C的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復5次熱抽提，個別含量很高的土壤需要增加次數;殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將PH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態物質便是難提取態球囊霉素相關蛋白，再用
0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0057]g.殘余態有機組分Residual和結合態黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風干品均分成兩份，其中一份用于殘余態有機組分的測定;另一份轉入離心管中，加入6ml濃度為3moI/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去碳酸鹽，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應24小時，除去硅酸鹽;5000轉離心10分鐘，倒掉上清液；加入6ml濃度為10mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去可能生成的氟化鈣，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是B-BC;
[0058]將黑炭樣品用去離子水沖洗轉入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干。
[0059]本發明所述各有機組分碳含量的測定方法如下:步驟&、13、(3、(1、64^中的各組份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分別加入5ml的重鉻酸鉀溶液和5ml的濃硫酸搖勻，瓶口放置彎頸漏斗，放于190-200°C的油浴上加熱，使三角瓶中溶液微沸，彎頸漏斗下端落下第一滴冷凝液開始計時，消煮5分鐘；取下三角瓶冷卻片刻，用去離子水洗冷凝器內壁以及下端外壁，洗滌液收集于原三角瓶中；加入2-3滴鄰菲羅啉指示劑，用硫酸亞鐵滴定剩余的重鉻酸鉀，溶液顏色由橙黃—綠—棕色為止，即為終點；如果樣品滴定所用硫酸亞鐵的毫升數達不到空白標定所用的硫酸亞鐵毫升數的1/3時，則應增加重鉻酸鉀溶液與硫酸的體積，兩種溶液的體積比為I: 1.每批樣品分析時必須做兩個空白，取0.5g粉末狀二氧化硅代替有機組分，其它步驟與測定有機組分相同；測定結果取平均值。
[0060]四、本發明各有機組分碳含量的計算如下:
[0061 ] C= ((c*Vi/Vo)*(Vo-V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3)
[0062]式中:C一一重鉻酸鉀法測得的碳含量；
[0063 ] C一一重鉻酸鉀(I /6K2Cr207)標準溶液的濃度，單位:mo I /L;
[0064]Vi一一加入重鉻酸鉀標準溶液的體積，單位:ml;
[0065]Vo 空白標定用去硫酸亞鐵的體積，單位:ml ；
[00??] V 滴定土樣用去硫酸亞鐵溶液體積，單位:ml ；
[0067]V2一一腐殖酸、易提取態可溶性有機質和難提取態可溶性有機質定容體積，單位:ml ；
[0068]V3一一腐殖酸、易提取態可溶性有機質和難提取態可溶性有機質用于測定的體積，單位:ml ；
[0069]M——1/4C的摩爾質量，M(1/4C) =3g/mol ；
[0070]10 3 將ml換算成L的系數；
[0071]1.1一一氧化校正系數；
[0072]關于計算EE-DOC和HE-DOC碳含量的說明:計算檸檬酸鈉易提取態可溶性有機組分和檸檬酸鈉難提取態可溶性有機組分的碳含量是要注意去掉檸檬酸鈉的含碳量，在以上計算結果的基礎上，將含碳量帶入一下計算公式得到C.即為檸檬酸鈉提取可溶性有機質的含量；
[0073]Cdqc= (C-(20*Co*12*6*10—3) )*5/m
[0074]C一一重鉻酸鉀法測得的碳含量；
[0075]Cdoc一一檸檬酸鈉提取可溶性有機質的含量；
[0076]V4 提取液的用量20ml;
[0077]Co——檸檬酸鈉的濃度，單位mol/L
[0078]本發明所述的顆粒態黑炭(POM-BC)屬于土壤黑炭，分離出來的顆粒有機質經過低濃度重鉻酸鉀和濃硫酸的混合液的處理剩余的組分就是顆粒態黑炭。這部分黑炭由于自身密度小，在提取土壤顆粒有機質時被同時提出。因此，從提取方法的角度定義，顆粒態黑炭也是土壤顆粒有機質的一部分。由于以往的研究沒有認識到顆粒態黑炭的存在，在顆粒態有機質測定時沒有考慮這部分黑炭。實際上顆粒態黑炭可以占黑炭總量的很大一部分。
[OO79 ]本發明所述的結合態黑炭(B-BC)是和土壤中礦物質結合的土壤黑炭；
[0080]本發明所述的黑碳總量是土壤顆粒態黑炭加上結合態黑炭的和。
[0081]本發明所述的難提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)是在提取易提取態球囊霉素相關蛋白(EE-GRSP)之后，改變提取條件后進一步提取出來的球囊霉素相關蛋白；
[0082]本發明所述的檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質(EE-DOC)是在提取易提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)的過程中，伴隨提出了一部分有機組分，這種有機組分在酸性條件下不會發生沉淀，把這部分有機組分命名為檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質(EE-DOC)。在提取易提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)的過程中，將檸檬酸鈉提取液進行酸化出現沉淀后，溶液仍然帶有較深的顏色，將這部分物質通過重鉻酸鉀氧化法測定有機質含量，所得結果減去檸檬酸鈉碳含量之后發現，仍然剩余一部分碳的量，這表明提取土壤EE-DOC的過程中伴隨提出了一部分有機組分，這種有機組分在酸性條件下不會發生沉淀，把這部分有機組分命名為檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質(EE-DOC)。
[0083]本發明所述的檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質(HE-DOC):在提取難提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)的過程中，伴隨提出了一部分有機組分，這種有機組分在酸性條件下不會發生沉淀，把這部分有機組分命名為檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質(EE-D0C)。在提取難提取態球囊霉素相關蛋白(HE-GRSP)的過程中，將檸檬酸鈉提取液進行酸化出現沉淀后，溶液仍然帶有較深的顏色，將這部分物質通過重鉻酸鉀氧化法測定有機質含量，所得結果減去檸檬酸鈉碳含量之后發現，仍然剩余一部分碳的量，這表明提取土壤EE-DOC的過程中伴隨提出了一部分有機組分，這種有機組分在酸性條件下不會發生沉淀，把這部分有機組分命名為檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質(EE-DOC)。
[0084]上述本發明在傳統的有機質分類中將提取球囊霉素相關蛋白時檸檬酸鈉提取液中未發生沉淀的物質也納為土壤有機質的一個組分，暫命名為檸檬酸鈉可提取態可溶性有機質。
[0085]本發明所述的顆粒有機質(POM)主要是來自于動植物殘體的半分解產物，是沒有與土壤礦質土粒以化學鍵緊密結合在一起的不穩定土壤有機質。
[0086]本發明所述的顆粒有機質是傳統方法提取得到的顆粒有機質去掉黑炭后的部分。傳統方法提取得到的顆粒有機質中分離出了黑炭，而從顆粒有機質的組成成分的定義來講，不包括黑炭，傳統顆粒有機質提取法得到的物質叫做顆粒態有機質和顆粒態黑炭的混合物。
[0087]本發明所述的土壤黑炭包括顆粒態黑炭和結合態黑炭兩部分。從傳統的定義認為，土壤黑炭是化石燃料和生物質不完全燃燒產生的富含碳元素的有機連續統一體，包括從輕度碳化的易分解的生物質到高度抗芳香化的抗分解石墨碳和煙塵顆粒等。近期人為活動產生的黑炭密度較輕，隨顆粒有機質提取出來，為顆粒態黑炭;早期地質年代自然產生的黑炭，在自然條件下與土壤礦物質長期相互作用，形成結合態黑炭。
[0088]關于計算顆粒態有機質碳含量的說明:
[0089]本發明中的顆粒態有機質(POM)是指傳統方法提取得到的顆粒有機質(即本發明中的顆粒有機質和顆粒態黑炭的混合物)去掉黑炭所剩的部分。因此，POM的碳含量是用本發明中顆粒有機質和顆粒態黑炭的混合物的碳含量減去顆粒態黑炭的碳含量而得到的值。
[0090]關于計算土壤總的黑炭碳含量的說明:
[0091]土壤黑炭是由顆粒態黑炭和結合態黑炭兩部分組成的。因此土壤中總的黑炭的碳含量是顆粒態黑炭和結合態黑炭碳含量相加的和。
[0092]利用傳統方法對土壤有機組分進行提取:
[0093]樣品采集與預處理、溶液配制以及各組分有機質含碳量測定與本發明的相關操作相同，不同之處在于直接對稱量好的土樣進行提取，而不是按照一定順序進行連續提取。
[0094]實驗結果如下:
[0095]圖2是連續提取法與傳統提取法對照表。胡敏酸與富啡酸、顆粒有機質與黑炭的提取結果。連續提取方法與傳統方法相比，胡敏酸、富啡酸與顆粒有機質之間的碳含量沒有差異。連續提取法顆粒有機質與殘余組分中均提出了黑炭，兩部分碳含量之和與傳統方法之間差異不大。
[0096]圖3是連續提取法與傳統提取法易提取態球囊霉素相關蛋白、檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質、難提取態球囊霉素相關蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機質提取結果對照表。連續提取與傳統提取方法相比，以上4種有機組分的碳含量均小于傳統方法，這說明傳統方法利用檸檬酸鈉溶液提取到的土壤有機組分和胡敏酸、富啡酸之間存在重疊、連續提取的方法解決了不同有機組分之間重疊的問題。
[0097]圖4是有機組分提取率對照表。連續提取試驗中將顆粒有機質、胡敏酸、富啡酸、易提取態球囊霉素相關蛋白、檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質、難提取態球囊霉素相關蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機質之和除以土壤有機質總量計算其有機組分提取率。傳統提取方式中，選取提取量最大的組分除以土壤有機質總量記為最大提取率。實驗結果表明，連續提取中有機組分的提取率大于傳統方法的最大提取率，說明連續提取的方法能夠更加充分的將土壤有機組分提取出來。
[0098]連續提取試驗中將顆粒有機質、胡敏酸、富啡酸、易提取態球囊霉素相關蛋白、檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質、難提取態球囊霉素相關蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機質、殘余態有機組分之和除以土壤有機質總量計算回收率。樣品的平均回收率為109.05±3.29%。
【主權項】
1.一種土壤中不同有機組分的連續提取方法，其特征在于所述的連續提取步驟如下: 一、土壤樣品的采集與預處理； 二、試劑的配制； 三、不同有機組分的連續提取； 所述不同有機組分的連續提取包括如下步驟: a.游離態顆粒有機質和游離態黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時，5600轉離心20分;這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止;懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率〈50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提取；測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； b.閉蓄態顆粒有機質和閉蓄態黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450J/ml的超聲波處理I小時，溫度控制在40°C以下，5600轉離心20分;這種操作重復3次，直到懸浮液中沒有懸浮物質為止;懸浮物質在0.7um的濾紙下過濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導率〈50yS/cm;樣品轉移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； c.顆粒態黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重鉻酸鉀的濃度為0.1mo I/L，硫酸的濃度為2mo I/L，在溫度為55 土 1°C的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是POM-BC;測定提取物碳含量時應把轉移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.1mo I/L的焦磷酸鈉和0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮氣5分鐘，震蕩12小時;4500轉離心10分鐘，上清液轉入10ml容量瓶中，這一步驟重復3-5次，直到上清液無色為止，定容，此時容量瓶中收集的物質為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉離心5分鐘，此操作重復3次，保留以便下一步提取； e.易提取態球囊霉素相關蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態可溶性有機質EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到三角瓶中，參與物質用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到I OOml容量瓶中定容;濾紙上的固態物質便是EE-GRSP，再用0.1moVL的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測定碳含量對試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測定碳含量； f.難提取態球囊霉素相關蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態可溶性有機質HE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉離心20分鐘，上清液轉移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復5次熱抽提，個別含量很高的土壤需要增加次數;殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調節到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產生大量沉淀;將溶液過濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態物質便是難提取態球囊霉素相關蛋白，再用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干； g.殘余態有機組分Residual和結合態黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風干品均分成兩份，其中一份用于殘余態有機組分的測定；另一份轉入離心管中，加入6ml濃度為3mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去碳酸鹽，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應24小時，除去硅酸鹽;5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的鹽酸溶液，室溫下反應24小時，除去可能生成的氟化鈣，5000轉離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應60小時，用去離子水沖洗轉入離心管中，5000轉離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質就是B-BC;將黑炭樣品用去離子水沖洗轉入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干； 四、步驟三提取出的有機組分碳含量的測定； 五、步驟三提取出的有機組分碳含量的計算。2.根據權利要求1所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法，其特征在于所述的步驟四中有機組分碳含量的測定方法如下:步驟a、b、c、d、e、f、g中的各組份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分別加入5 m I的重鉻酸鉀溶液和5 m I的濃硫酸搖勻，瓶口放置彎頸漏斗，放于190-200°C的油浴上加熱，使三角瓶中溶液微沸，彎頸漏斗下端落下第一滴冷凝液開始計時，消煮5分鐘;取下三角瓶冷卻片刻，用去離子水洗冷凝器內壁以及下端外壁，洗滌液收集于原三角瓶中；加入2-3滴鄰菲羅啉指示劑，用硫酸亞鐵滴定剩余的重鉻酸鉀，溶液顏色由橙黃—綠—棕色為止，即為終點；如果樣品滴定所用硫酸亞鐵的毫升數達不到空白標定所用的硫酸亞鐵毫升數的1/3時，則應增加重鉻酸鉀溶液與硫酸的體積，兩種溶液的體積比為I: 1.每批樣品分析時必須做兩個空白，取0.5g粉末狀二氧化硅代替有機組分，其它步驟與測定有機組分相同；測定結果取平均值。3.根據權利要求1所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法，其特征在于所述的步驟五有機組分碳含量的計算如下: C= ((c*Vi/Vo)*(Vo_V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3) 式中:C一一重鉻酸鉀法測得的碳含量； C——重鉻酸鉀(l/6K2Cr207)標準溶液的濃度，單位:mol/L; Vi一一加入重鉻酸鉀標準溶液的體積，單位:ml; Vo 空白標定用去硫酸亞鐵的體積，單位:ml ； V 滴定土樣用去硫酸亞鐵溶液體積，單位:ml ； V2—一腐殖酸、易提取態可溶性有機質和難提取態可溶性有機質定容體積，單位:ml; V3—一腐殖酸、易提取態可溶性有機質和難提取態可溶性有機質用于測定的體積，單位:ml ； M——1/4C的摩爾質量，M( 1/4C) = 3g/mol ； 10 3 將ml換算成L的系數； I.I—氧化校正系數； 關于計算EE-DOC和HE-DOC碳含量的說明:計算檸檬酸鈉易提取態可溶性有機組分和檸檬酸鈉難提取態可溶性有機組分的碳含量是要注意去掉檸檬酸鈉的含碳量，在以上計算結果的基礎上，將含碳量帶入一下計算公式得到Cdqc即為檸檬酸鈉提取可溶性有機質的含量；Cdoc= (C_(20*Co*12*6*10—3) )*5/mC一一重鉻酸鉀法測得的碳含量； Cdoc--朽1檬酸鈉提取可溶性有機質的含量； V4 提取液的用量20ml ； Co——檸檬酸鈉的濃度，單位mol/L。4.根據權利要求1所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法，其特征在于所述的步驟一土壤樣品的采集與預處理方法為:土壤樣品風干后過0.25mm篩，備用。5.根據權利要求1所述的土壤中不同有機組分的連續提取方法，其特征在于所述的步驟二中的試劑配制方法為: (1)碘化鈉溶液，密度為I.7g/cm3:將1200g碘化鈉溶于水中，用IL的容量瓶定容； (2)氯化媽溶液，濃度為0.0 lmol/L; (3)焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液:焦磷酸鈉和氫氧化鈉的濃度均為0.lmol/L; (4)硫酸溶液，濃度約為3mol/L:量取163ml濃硫酸定容到1L; (5)硫酸溶液，濃度為0.02mol/L:吸取將溶液(4)66.7ml，定容到IL; (6)氫氧化鈉溶液，濃度為0.02mol/L; (7)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.02mol/L，pH值為7; (8)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.05mol/L，pH值為8; (9)鹽酸溶液，濃度為0.lmol/L:吸取8.33ml濃鹽酸，定容到IL; (10)鹽酸溶液，濃度為3mol/L:量取125ml濃鹽酸，定容到500ml; (11)氫氟酸溶液，濃度為lOmol/L:用塑料量筒量取150ml純氫氟酸，用500ml塑料容量瓶定容； (12)鹽酸溶液，濃度為lOmol/L:量取417ml濃鹽酸，定容到500ml; (13)重絡酸鉀和硫酸的混合液:重絡酸鉀濃度為0.lmol/L，硫酸濃度為2mol/L; (14)重鉻酸鉀標準液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:將重鉻酸鉀試劑在烘箱中，105°C條件下烘干3小時，取出后在干燥器中冷卻8小時，冷卻后稱取39.225g，在水中加熱溶解，冷卻后用水定容至1L; (15)硫酸亞鐵溶液，FeSO4，0.2mol/L: 56.0g硫酸亞鐵，FeSO4^H2O，化學純，溶于水，加入15ml濃硫酸，用水定容至IL; (16)鄰啡羅啉試劑:1.485g鄰啡羅啉試及0.695g硫酸亞鐵溶于10ml水，在棕色瓶中保 存。
【文檔編號】G01N21/79GK106093289SQ201610580157
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月22日 公開號201610580157.5, CN 106093289 A, CN 106093289A, CN 201610580157, CN-A-106093289, CN106093289 A, CN106093289A, CN201610580157, CN201610580157.5
【發明人】吳蔚東, 蘭天, 王海龍
【申請人】海南大學